CN109897111B

CN109897111B - 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN109897111B
Application number: CN201711298703.7A
Authority: CN
Inventors: 黄莺; 张发明; 席甘
Original assignee: Hangzhou Hansi Biomedical Co ltd
Current assignee: Hangzhou Hansi Biomedical Co ltd
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN109897111A

Abstract

本发明提出了一种重组抗体。该重组抗体包括：抗PD‑1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD‑1的抗体的重链的C端相连。该重组抗体同时靶向PD‑1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

Description

抗PD-1/CD47的双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和抗体工程技术领域，具体涉及抗PD-1及CD47的双特异性抗体及其应用，更具体地，本发明涉及重组抗体、核酸、构建体、制备重组抗体地方法以及治疗癌症的治疗组合物。

背景技术

近年来癌症成为全球导致死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织报道，2015年全世界因癌症死亡人数达近880万，已占当年总死亡人数的近六分之一。2015年中国约有429.2万癌症新发病例，281.4万癌症死亡病例，而且癌症发病率在我国仍呈上升趋势。

目前对于癌症的治疗手段仍以进行手术、放射性治疗和化学治疗为主，传统的治疗手段有着肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。因此，人们对于更加安全高效和特异性强的手段来治疗癌症有着强烈的需求。近些年来，随着人们对于癌症的机理认识不断加深，通过特异性抗体来抑制肿瘤的分子靶向治疗逐渐崭露头角。在此基础上的抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高，疗效显著，毒副作用少等优点，对肿瘤治疗有非常广阔的前景。近些年来，一些免疫检查点(immunogicalcheckpoint)的不断发现，针对这些免疫检查点的特异性抗体被开发出来阻断肿瘤细胞免疫逃逸的过程，把免疫疗法推向新一波高潮。

在免疫***中，T细胞的活化过程是复杂的，不仅取决于MHC-TCR复合体提供的第一刺激信号，还需要抗原呈递细胞表面的一些分子提供的第二信号(也即“共刺激信号”)。缺乏这类共刺激信号会导致T细胞的无应答、耐受及凋亡^[1]。程序性死亡受体－1(programmed death-1,PD-1，又称CD279)及其配体程序性死亡受体配体1和2(PD-L1和PD-L2)即是这样一类抑制性的共刺激分子。

人的PD-1属于CD28家族成员的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其分子量约为55kDa。人PD-1的胞内区存在两个酪氨酸残基(Y223及Y248)，分别参与构成了N端的一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM，基序为VDYGEL)和C端的一个免疫受体酪氨酸依赖的转换基序(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM，基序为TEYATI)。ITIM基序可招募胞内的SHP-2并磷酸化下游的蛋白，降低BCR或TCR受体信号，最终抑制淋巴细胞的增殖及细胞因子的产生并诱导细胞***周期停滞^[2]。胞外区有一个IgV样结构域，含有多个糖基化位点并被重度糖基化，主要参与与配体结合，从而发挥抑制T细胞活化的功能。与其他共刺激分子以二聚体形式存在不同，PD-1的胞外区缺乏半胱氨酸残基，因此PD-1可以以单体的形式存在。PD-1在活化的T及B细胞表达，也在单核细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)和调节性T细胞(T regulatory cells，Tregs)中表达。

PD-1的两种配体，PD-L1(B7-H1，又称CD274)和PD-L2(B7-DC)，是Ⅰ型糖蛋白，属于B7家族蛋白成员^[3]。PD-1的主要配体PD-L1含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和胞质区，其中胞质区参与细胞内信号转导，IgV样区和IgC样区则参与细胞间的信号转导。其表达受一些炎症因子的正向调控，如白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)等^[4]。除了表达在活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和多种肿瘤细胞外，PD-L1还广泛表达在非淋巴器官如心脏、血管、胎盘、骨骼肌、肺、肝、脾及胸腺等器官。PD-L2主要只在活化的巨噬细胞、DCs和少数肿瘤细胞上表达^[5]。

PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用对多种免疫失调性疾病的发生与发展具有重要作用。例如自身免疫性疾病。缺失PD-1的小鼠会出现延迟性、器官特异性自身免疫。PD-1的缺失情况在涉及自身免疫性疾病的红斑狼疮的LPR模型及糖尿病的NOD小鼠模型下均体现出加速的组织特异性自身免疫表征^[6]。此外在一些病毒诸如HIV和HBV等的慢性感染者体内都发现了过量表达PD-1的功能缺陷的细胞毒性T(cytotoxic lymphocyte,CTL)细胞，而阻断PD-1信号则可逆转CTL的“功能缺失”状态并清除病毒^[7]。

肿瘤细胞会利用PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用来实施免疫逃逸。多种肿瘤细胞会上调表达PD-L1，如非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、白血病及各种泌尿系肿瘤、消化道肿瘤、生殖系肿瘤等^[8]。过量表达PD-L1从而与T细胞表面的PD-1受体相互作用，使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸被磷酸化，进而引起下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和酪氨酸激酶(Syk)的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译^[5]。另一方面，研究表明PD-L1引起PD-1在T细胞的积累，导致细胞周期停滞，使在G0/G1期的细胞大量积累^[9]。体外实验和小鼠模型还发现，激活PD-1/PD-L1信号通路导致特异性CTL调亡，使CTL的细胞毒杀伤效应敏感性下降，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸^[10]。综上所述，肿瘤细胞通过表达PD-L1和T细胞表面的PD-1作用，能够抑制T细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤。

因此，PD-1/PD-L1信号通路成为了肿瘤免疫治疗的新分子靶标，PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起到关键性作用，阻断PD-1/PD-L1信号通路可以阻断肿瘤细胞抑制细胞免疫的主力军T细胞。抗PD-1和抗PD-L1抗体的开发已经成为肿瘤免疫治疗研究中的热点研究方向。目前美国FDA已经批准使用的针对PD-1靶点的单抗药物有默克公司(Merck)的Keytruda(pembrolizumab)和百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的Opdivo(Nivolumab)。针对PD-L1靶点的单抗药物有罗氏(Roche)的Tecentriq(Atezolizumab)、辉瑞(Pfizer)和默克(Merck)生产的Bavencio(avelumab)和阿斯利康(AstraZeneca)生产的Imfinzi(Durvalumab)。这些单抗药物在从最开始临床上用于治疗黑色素瘤和化疗后依然进展的转移性鳞状非小细胞肺癌等多种肿瘤，到现在用于霍奇金淋巴瘤、肾癌、胃癌、***癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤类型都已经取得了较好的临床试验结果。另外还有多个抗PD-1和抗PDL1的抗体进入临床试验用于多种肿瘤的治疗。

但目前免疫疗法的最大限制在于有效率太低，PD-1的有效率从15％-50％不等。有研究证据表明，成功的癌症免疫疗法取决于能否触发***广泛的免疫相应，而不是仅触发肿瘤本身的局部影响，刺激免疫***产生更***的响应有望显著增加免疫疗法的有效性。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，所述重组抗体包括：抗PD-1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD-1的抗体的重链的C端相连。根据本发明实施例的重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

根据本发明的实施例，上述重组抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述抗PD-1的抗体为抗PD-1的IgG类抗体。优选地，IgG类抗体为IgG4亚型。IgG4容易形成半抗体(发生Fab-arm的交换)，进行了S228P改造的IgG4亚型抗体可有效降低Fab-arm的交换，有效避免ADCC和CDC的作用。

根据本发明的实施例，所述抗PD-1的抗体为H8。H8可参见专利201610207741.6以及PCT/CN2016/103814记载的内容。

根据本发明的实施例，进一步包括连接肽，所述连接肽的N端与所述抗PD-1的抗体的重链的C端相连，所述连接肽的C端与所述人SIRPA胞外段的N端相连。进而可避免蛋白的空间位阻的相互影响，进一步促进蛋白折叠。

根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

GGGGSGGGGSERGETGP(SEQ ID NO:1)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，所述重组抗体的轻链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述重组抗体的重链具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNKGTGVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEEEDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。

EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCARQKGEAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSERGETGPEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:3)。

根据本发明实施例的重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸编码的重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

根据本发明的实施例，上述核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：4和5所示的核苷酸序列。

gacatcgtgctgacccagtcccctgcttccctggctgtgtcccctggacagagggccaccatcacatgccgggcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcatgaactggttccagcagaagcccggccagcctcccaagctgctgatctacgccgcctccaacaagggcacaggcgtgcctgccaggttttccggttctggctccggcaccgacttcaccctgaacatcaaccctatggaagaggaagacaccgccatgtacttctgccagcagtccaaggaggtgccttggacattcggcggcggcaccaagctggagatcaagcggaccgtggccgctccaagcgtcttcatttttcccccttccgacgaacagctgaagagtgggacagcctcagtggtctgtctgctgaacaatttctaccctagagaggctaaggtgcagtggaaagtcgataacgcactgcagtctggcaatagtcaggagtcagtgacagaacaggacagcaaggattccacttattctctgtctagtacactgactctgtctaaagccgactacgaaaagcacaaagtgtatgcttgtgaagtgacccaccaggggctgtccagtcccgtgaccaaatctttcaataggggcgagtgt(SEQ ID NO：4)。

gaggtgcagctggtccagagcggaggcggactggtccagcctggcggcagcctgaagctcagctgtgccgccagcggattcaccttctcctcctacggaatgtcctgggtccggcaggctcctggcaaaggactggactgggtggctaccatctccggcggaggaagggacacctactaccccgactccgtcaagggcaggttcaccatctcccgggacaatagcaagaacaacctgtatctccagatgaacagcctgcgggctgaggacaccgccctgtactactgcgctcggcagaagggcgaagcctggttcgcctattggggacagggcacactggtgaccgtgagcgccgccagcacaaaaggccccagcgtgttccccctggctccctgttccaggagcaccagcgagtccaccgctgctctgggctgcctggtgaaggactatttccctgagcccgtcaccgtcagctggaatagcggcgccctgaccagcggagtccacacattccccgccgtgctgcaaagcagcggcctgtactccttatcttctgtcgtgaccgtgccctccagcagcctgggaaccaagacctatacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggataagcgggtcgaatccaagtacggccccccttgtcctccttgtcccgctcctgagttcctgggaggacccagcgtgtttctgttccctcctaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtcacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtgcagtttaactggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaaggcctgcccagctccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccaacctcgggagccccaagtgtatacactgcccccttcccaggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctcacctgtctggtgaagggcttctatcccagcgacatcgccgtcgaatgggaatccaacggccagcccgagaacaattacaagaccaccccccccgtgctggattccgacggctccttctttctgtatagccggctcaccgtggacaagagcaggtggcaggagggcaacgtgttctcctgtagcgtcatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaatccctgtccctgtccctgggaaagggcggcggcggctccggcggaggaggcagcgaaaggggcgaaaccggccctgaggaggagttacaagtgatccagcccgacaagtccgtgtccgtggctgctggcgagtccgctatcctgcactgcaccgtgacctccctgatccccgtgggccctatccagtggttcaggggagctggccccgctagggagctgatctacaaccagaaggagggccacttccccagggtgaccaccgtgtccgagagcaccaagagggagaacatggacttctccatcagcatctccaacatcacccccgctgacgccggcacctactactgcgtgaagttcaggaagggcagccccgacaccgagttcaagtccggcgctggcaccgagctgtccgtgagggccaaaccctcc(SEQ ID NO：5)。

根据本发明实施例的核酸所编码的重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码抗PD-1的抗体；第二核酸分子，所述第二核酸分子编码人SIRPA胞外段。根据本发明实施例的构建体导入受体细胞后，表达的重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接。第一启动子可高效启动第一核酸分子和第二核酸分子的表达，进而实现前面所述重组抗体的表达。

根据本发明的实施例，所述第一启动子选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。发明人发现，U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子能够高效启动表达第一、第二核酸分子，第一、第二核酸分子的表达效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，所述第三核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽。进而第一核酸分子表达的蛋白可与第二核酸分子表达的蛋白通过连接肽连接在一起，成为融合蛋白发挥作用。

根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。本发明实施例中的构建体载体的致病位点经过修饰或突变，已丧失病毒的致病性，进而在根据本发明实施例的非致病性病毒载体介导下的治疗的安全性更高。

根据本发明的实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。上述载体可实现所携带核酸在受体细胞的高效表达，治疗效率高。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前面所述的重组抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将钱买你所述的构建体引入到哺乳动物细胞中；将所述哺乳动物细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。利用根据本发明实施例的方法可简便、高效地获得前面所述的重组抗体，如前所述，所述重组抗体同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述哺乳动物细胞包括选自CHOK1、CHOS、293F、293T的至少之一。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：前面所述的构建体、前面所述的重组抗体或者前面所述的核酸。根据本发明实施例的治疗组合物对癌症的治疗效果进一步显著提高。

根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物，较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。

综上，本发明的目的在于提供一种新的能同时靶向PD1和CD47的双功能特异性抗体。

CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，是一种跨膜糖蛋白，分子量在50kDa左右，是免疫球蛋白(Ig)超家族，包含一个胞外N端IgV结构域，5个高度疏水的跨膜片段和羧基端胞质区。CD47可与信号调节蛋白α(Signal regulatoryproteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，参与T细胞和单核细胞等免疫细胞跨膜迁移和吞噬作用的调节。

CD47的配体SIRPα蛋白也称为CD172a或者SHPS-1(SH2domain-containingprotein tyrosine phosphatase substrate-1)，是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，其中N末端与CD47的结合。在DC，巨噬细胞，肥大细胞，粒细胞、神经细胞和造血干细胞中均广泛表达，在其他细胞中则表达较少。SIRPα在与CD47结合后，其C端胞质区的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)发生磷酸化，募集和引起酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2磷酸化，并且激活下游信号通路，从而起到抑制巨噬细胞吞噬的作用。

CD47广泛表达在各类细胞表面，释放一种"别吃我"的信号。CD47是细胞表面一个重要的"自我"标记，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面的SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应α蛋白抑制巨噬细胞的吞噬作用。CD47在年轻的红细胞中高表达，而在衰老的红细胞中低表达，使得巨噬细胞能够有针对性地只进攻并清除衰老的红细胞。肿瘤细胞为了逃避机体的免疫***攻击则利用起CD47这个“自己人”的标记。不同的研究表明，CD47自19世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种人类肿瘤类型中表达，包括急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)和其他实体瘤，远高于普通正常细胞。因此CD47及其配体SIRPα蛋白的信号通路成为了一种可以抑制肿瘤细胞免疫逃逸的新靶点。近些年基于此信号通路的药物开发不断受到关注。

通过药物阻断CD47与SIRPα的结合从而达到抑制肿瘤免疫逃逸的过程存在多种机制。第一，物理阻断CD47与SIRPα的结合可以解除SIRPα解除对巨噬细胞的抑制作用，这一作用不依赖抗体Fc介导的细胞毒效应，属于非固有免疫范畴。人们发现缺失Fc片段的抗CD47抗体仍然能够促进巨噬细胞对肿瘤的清除。第二，对于CD47的阻断可以不依赖巨噬细胞直接诱导肿瘤细胞的凋亡。第三，抗体通过激活T细胞和DC细胞来实现抗原呈递和启动抗肿瘤适应性免疫。DC细胞和T细胞亚型都能表达SIRPα。通过阻断CD47与SIRPα信号通路能够解除抑制DC的成熟和产生细胞因子。DC通过CD47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T细胞，进而发挥CD8+T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。

所以CD47抗体或其配体SIRPα是继PD1/PD-L1抗体之后，下一代肿瘤免疫抑制剂产品重磅药物。两者有相似之处，CD47与PD-L1都受转录因子myc的调控；并且两者都广泛在各类肿瘤细胞中表达。从某些方面来讲，CD47抗体可能比PD1/PD-L1抗体更有前景。首先是CD47比PD-L1具有更为广泛的表达，以及在所有肿瘤细胞中几乎都高表达，代表着其具有更为广谱的效应。第二，CD47抗体有着比PD-1抗体更加多元化的抑制肿瘤机制。PD-1、CTLA-4等肿瘤免疫抑制剂之所以仅对一小部分发挥作用，也许一个重要的原因就是PD-1或者CTLA-4等传统免疫抑制剂抗体，无法形成肿瘤特异性的杀伤T细胞，而CD47抗体不仅能启动巨噬细胞介导的非适应性免疫过程，而且能通过巨噬细胞，DC等的抗原传递启动对肿瘤细胞的特异杀伤。然而，CD47由于其广泛的表达，还涉及到不同组织的非免疫性信号调节，阻断CD47信号可能会引起巨噬细胞广泛地攻击自身正常组织的风险，或者某些非免疫性调节紊乱。巨噬细胞发挥吞噬作用，需要CD47这类的“别吃我”信号与钙网织蛋白(calreticulin，CRT)等“吃我”信号协同作用。通常情况下肿瘤细胞高表达CRT而正常细胞并不表达CRT等"吃我"信号，所以尽管CD47也广泛在人的大脑皮层以及小脑等健康组织中，在正常组织中CD47抗体的阻断效应比较有限。然而，观察Ⅰ期临床的临床数据，接受放疗和化疗后的患者也会上调"吃我"信号。CD47抗体治疗后，CD47+红细胞枯竭，造成短暂性的贫血是其主要的不良反应。

CD47抗体治疗是通过DC细胞和CD8+T发挥肿瘤杀伤效应的。DC细胞通过CD47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T，进而发挥CD8+T对肿瘤的特异性杀伤作用，同时，肿瘤细胞上调CD47的表达，以此欺骗巨噬细胞。那么通过CD47抗体block这个"别吃我"的信号，使巨噬细胞发挥吞噬作用。同时靶向PD-1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫***的能力，效果显著增强，是新一代的免疫哨卡抑制剂。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明实施例的HX009-5的SDS-PAGE鉴定结果图；

图2是根据本发明实施例的HX009-5的SEC-HPLC鉴定结果图；

图3是根据本发明实施例的H8和HX009-5对PD-1的亲和力的实验结果图；

图4是根据本发明实施例的HX009-5和H8抑制Pd-1与PdL1活性的结果图；

图5是根据本发明实施例的HX009-5和H8抑制Pd-1与PdL2活性的结果图；

图6是根据本发明实施例的HX009-5与人CD47结合的实验结果图；

图7是根据本发明实施例的HX009-5抑制CD47与SIRPA的结合的实验结果图；

图8是根据本发明实施例的HX009-5与CD16a没有结合的实验结果图；

图9是根据本发明实施例的HX009-5与CD32a没有结合的实验结果图；

图10是根据本发明实施例的HX009-5与CD32b没有结合的实验结果图；

图11是根据本发明实施例的HX009-5与CD64没有结合的实验结果图；

图12是根据本发明实施例的抗体H8和HX009-5刺激T细胞分泌IL-2分泌的实验结果图；

图13是根据本发明实施例的Hx009-5样品不会产生红细胞凝集反应的实验结果图；

图14是根据本发明实施例的肿瘤体积随时间变化的结果图；以及

图15是根据本发明实施例的肿瘤体积随时间变化的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：

实施例1PD-1/CD47的双特异性抗体的蛋白表达

在人源化抗体H8(抗PD-1的IgG类抗体)基础上，通过特殊的Linker(GGGGSGGGGSERGETGP)将人SIRPA(NP_542970.1)的膜外部分(32aa-137aa)连接到H8重链的C端获得双特异性抗体HX009-5，使其同时靶向目标蛋白PD-1和CD47。

实际操作中，全基因合成编码人源化抗体H8的轻链的核酸序列，先连接到表达载体中获得表达载体1，同时分别全基因合成H8的重链和Linker-SIRPA(108mer)的核酸序列，直接把H8的重链序列连接到表达载体1中获得表达抗PD1的单克隆抗体H8的表达载体2。通过Over-lap PCR融合后，连接到表达载体1中获得表达双特异性抗体HX009-5的表达载体3。提取表达载体2和3的DNA，分别转染至哺乳动物细胞293细胞。细胞转染后，抗体在哺乳动物细胞内表达，并分泌到细胞外。然后，通过抗体A亲和层析柱，纯化表达的抗体，即获得H8和HX009-5蛋白。用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对HX009-5进行质量鉴定后用于后续的药效学研究。

其中，HX009-5的SDS-PAGE和SEC-HPLC鉴定结果分别见图1和图2。

HX009-5的SDS-PAGE鉴定结果见图1。如图1所示，泳道1：HX009-5还原；泳道2：H8还原；泳道M：蛋白标准品(18.4KDa 25KDa 35KDa 45KDa 66.2KDa)；泳道3：BSA。由图1可知，候选抗体HX009-5样品总体纯度较高。

HX009-5的SEC-HPLC鉴定结果见图2。如图2所示，积分定量确认该抗体总纯度为98.2％。

HX009-5重链氨基酸序列：

evqlvqsggglvqpggslklscaasgftfssygmswvrqapgkgldwvatisgggrdtyypdsvkgrf tisrdnsknnlylqmnslraedtalyycarqkgeawfaywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkggggsggggsergetgpeeelqviqpdksvsvaagesailhctvtslipvgpiqwfrgagpareliynqkeghfprvttvsestkrenmdfsisisnitpadagtyycvkfrkgspdtefksgagtelsvrakps(SEQ ID NO：3)，其中，下划线标注的部分为抗体可变区。

编码HX009-5重链的核酸序列：

HX009-5轻链氨基酸序列：

divltqspaslavspgqratitcrasesvdnygisfmnwfqqkpgqppklliyaasnkgtgvparfsg sgsgtdftlninpmeeedtamyfcqqskevpwtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQ ID NO：2)，其中，下划线标注的部分为抗体可变区。

编码HX009-5轻链的核酸序列：

实施例2HX009-5双特异性抗体ELISA结合实验

1、H8、HX009-5ELISA PD-1结合实验

针对实施例1制备获得的H8抗体，与HX009-5进行头对头比较，包括PD1结合实验和PDL1竞争实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：hPD-1-his抗原0.25μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

2)1％BSA(PBS稀释)37℃封闭2小时，1×PBST(Tween-20,1％)洗涤3次，轻轻拍干；

3)一抗：2μg/ml，1:5梯度稀释7个梯度浓度，空白对照组为PBS，37℃孵育1小时；

4)二抗：PBST洗涤3次，轻轻拍干，每孔100μl加入1:10000稀释的HRP酶标羊抗人IgG(H+L)二抗，37℃孵育1小时；

5)显色：PBST洗涤3次，轻轻拍干；每孔100μl加入TMB显色剂，室温反应5～15min；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表1和图3，可计算出H8和HX009-5对PD-1的EC₅₀值分别为0.05nM和0.05nM。由图3可知，在C端融合上Linker-SIRPA(108mer)对抗体HX009-5与PD-1亲和力没有影响。

表1：

2、HX009-5、H8与PDL1竞争ELISA实验

具体步骤如下：

1)包被抗原：在96孔酶标板上包被hPD-1-hIgGFc抗原0.5μg/ml，50μl/孔，4℃包被过夜；

2)PBST洗板3次，轻轻拍干，加入1％BSA(PBS稀释)37℃封闭2小时，1×PBST(Tween-20,1％)洗涤3次；

3)一抗：6μg/ml，1:3梯度稀释7个梯度浓度，空白对照组为PBS，50μl/孔加入到包被好的酶标板上，室温孵育10min；

4)配体：加入PDL1-mIgG2aFc溶液0.6μg/ml，50μl/孔，37℃孵育1小时；

5)二抗：PBST洗涤3次，轻轻拍干；每孔50μl加入1:5000稀释的HRP酶标羊抗鼠IgG(H+L)二抗，37℃孵育1小时；

5)显色：PBST洗涤3次，轻轻拍干；每孔50μl加入TMB显色剂，室温反应5～15min；

6)终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表2和图4，并且HX009-5和H8抑制Pd-1与PdL1的IC₅₀值分别为1.5nM和1.0nM。由此可知，在C端融合上Linker-SIRPA(108mer)对抗体HX009-5抑制Pd-1与PdL1的结合没有显著影响。

表2：

3、HX009-5、H8与PDL2竞争ELISA实验

具体步骤如下：

1)包被抗原：在96孔酶标板上包被hPD-1-hIgGFc抗原1.0μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

2)PBST洗板3次，轻轻拍干，加入1％BSA(PBS稀释)37℃封闭2小时，1×PBST(Tween-20,1％)洗涤4次；

3)一抗：20μg/ml，1:3梯度稀释7个梯度浓度，空白对照组为PBS，50μl/孔加入到包被好的酶标板上，室温孵育10min；

4)配体：加入PDL2-his tag溶液0.6μg/ml，50μl/孔，37℃孵育1小时；

5)二抗：PBST洗涤5次，轻轻拍干；每孔50μl加入1:750稀释的HRP酶标抗his tag小鼠单克隆抗体二抗，37℃孵育1小时；

6)显色：PBST洗涤6次，轻轻拍干；每孔100μl加入TMB显色剂，室温反应30min；

7)终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄终止显色反应；

8)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表3和图5，并且HX009-5和H8抑制Pd-1与PdL2的IC₅₀值分别为1.5nM和2.7nM.由此可知，在C端融合上Linker-SIRPA(108mer)对抗体HX009-5抑制Pd-1与PdL2的结合没有显著影响。

表3：

4、HX009-5与CD47结合ELISA实验

针对实施例1制备获得的HX009-5抗体，进行与CD47结合ELISA实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：CD47抗原0.25μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

3)一抗：10μg/ml，1:5梯度稀释7个梯度浓度，空白对照组为PBS，37℃孵育1小时；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表4和图6，HX009-5与人CD47结合，EC₅₀为0.6nM。

表4：

5、HX009-5与SIRPA竞争ELISA实验

具体步骤如下：

1)包被抗原：在96孔酶标板上包被CD47抗原0.25μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

3)一抗：30μg/ml，1:3梯度稀释7个梯度浓度，空白对照组为PBS，50μl/孔加入到包被好的酶标板上，室温孵育10min；

4)配体：加入SIRPA-his tag溶液0.6μg/ml，50μl/孔，37℃孵育1小时；

7)终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄终止显色反应；

8)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表5和图7，HX009-5能抑制CD47与SIRPA的结合，IC₅₀为21nM。

表5：

实施例3HX009-5Fc端效应研究

对HX009-5(实施例1制备获得)进行Fc端效应研究，与Fc受体CD16、CD32a、CD32b以及CD64的亲和力常数策行，以判断HX009-5与Fc受体的结合能力，具体如下：

1、HX009-5与CD16a的亲和力常数测定

Fc受体CD16a(又名FcγRIIIa)可与IgG抗体的Fc端结合，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。治疗性单克隆抗体与Fc受体结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。本实验使用ELISA方法检测HX009-5与CD16a的亲和力常数，以评价HX009-5与Fc受体CD16a的结合能力。

针对实施例1制备获得的HX009-5抗体，以及HX006抗体(为IgG1亚型)进行与CD16a结合ELISA实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：CD16a抗原0.5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

4)二抗：PBST洗涤3次，轻轻拍干，每孔100μl加入1:8000稀释的HRP酶标羊抗人IgG(H+L)二抗，37℃孵育1小时；

5)显色：PBST洗涤3次，轻轻拍干；每孔100μl加入TMB显色剂，室温反应30min；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表6和图8，HX009-5与CD16a没有结合。

表6：

2、HX009-5与CD32a的亲和力常数测定

针对实施例1制备获得的HX009-5抗体，以及HX006抗体(为IgG1亚型)进行与CD32a结合ELISA实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：CD32a抗原0.5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表7和图9，HX009-5与CD32a没有结合。

表7：

3、HX009-5与CD32b的亲和力常数测定

针对实施例1制备获得的HX009-5抗体，以及HX006抗体(为IgG1亚型)进行与CD32b结合ELISA实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：CD32b抗原0.5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表8和图10，HX009-5与CD32b没有结合。

表8：

4、HX009-5与CD64的亲和力常数测定

针对实施例1制备获得的HX009-5抗体，以及HX006抗体(为IgG1亚型)进行与CD64结合ELISA实验，具体如下：

具体步骤如下：

1)包被抗原：CD64抗原0.5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

6)显色终止：50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表9和图11，HX009-5与CD64没有结合。

表9：

实施例4混合淋巴反应检测双特异性抗体抗PD1生物学活性

利用混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测并比较H8(实施例1制备获得)和HX009-5刺激T淋巴细胞分泌IL-2和IFNgamma分泌能力，具体如下：

MLR实验采用不同人来源的T细胞(TC)和树突状细胞(DC)进行混合，利用DC细胞抗体提呈能力刺激T细胞分泌IL-2和IFNgamma。首先用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导血液中单核细胞分化成树突状细胞，然后用TNFa刺激是未成熟的DC细胞成熟。成熟后的DC与同种异源的TC细胞进行混合5天后，检测细胞上清中的IL-2和IFNgamma的分泌水平。在96孔板中混合TC和DC，按每孔加入TC 1×10⁵和DC 1×10⁴，设置抗体浓度从10M到0.09765625nM共8个梯度，混合反应5天后，用IL-2检测试剂盒定量检测上清IL-2含量。

抗体H8和HX009-5刺激T细胞分泌IL-2分泌水平如图12所示。由图12可见，抗体H8和HX009-5能有效地刺激T细胞分泌IL-2，由此可知，在C端融合上Linker-SIRPA(108mer)对抗体HX009-5刺激T细胞分泌IL-2的能力没有影响。

实施例5HX009-5血细胞凝集反应研究

具体步骤如下：

1、抽取志愿者的外周血5ml，用5ml肝素抗凝管接取，轻轻摇匀后使其充分接触肝素后，加入15ml离心管中，再加入9ml的PBS，轻柔混匀，2100rpm，离心10min；

2、弃去红细胞层以上的含白细胞血浆上清，加入12ml PBS重悬，1500rpm，离心5min；

3、弃去红细胞层以上上清，加入12ml PBS重悬，1500rpm，离心5min；

4、再重复步骤3两次；

5、弃上清，吸取1ml的红细胞悬液加入15ml离心管中，再加入9ml的PBS混匀，制备成10％的红细胞备用。

6、取制备好的10％的红细胞1ml加入15ml离心管，再加入9ml的PBS重悬，制备成1％的红细胞备用；

7、各样品溶液制备：

1)将HX009-5从9.1mg/ml稀释至0.9mg/ml,再按3X依次稀释，共12个浓度梯度；

2)将H8从10mg/ml稀释至0.9mg/ml,再按3X依次稀释，共12个浓度梯度；

3)将土豆凝集素提取液按3X依次稀释，共8个浓度梯度；

4)PBS作为空白对照；

取出一96孔U底细胞培养板，先向B1至G12各孔加入50μl的1％的红细胞，再按如下图顺序方案加入50ml的样品，混匀后，放37℃，5％二氧化碳培养箱过夜孵育。

24h后，取出96孔板观察，并在凝胶成像分析仪下拍照，如下表10和图13所示，土豆凝集素提取液作为阳性对照前4个浓度梯度有明显的红细胞凝集反应；H8与HX009-5与空白对照各个梯度均无凝集反应发生；从而可以得出，HX009-5样品不会产生红细胞凝集反应。

表10：

实施例6HX009-5在KARPAS-299人间变性大细胞淋巴瘤皮下移植MiXeno模型中的抗肿瘤作用

利用NSG小鼠建立人肿瘤移植模型，研究H8以及HX009-5(实施例1制备获得)在KARPAS-299人间变性大细胞淋巴瘤皮下移植MiXeno模型中的抗肿瘤作用，具体如下：

NSG小鼠具有NOD，Prkdcscid，IL2rgnull缺失/变异特征，是目前免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞移植的工具小鼠，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应。因此，发明人选择过继转输人外周血单核细胞(PBMC)至NSG小鼠所构建的移植物抗宿主反应(GVHD)模型，并由此来衡量HX009-5的体内药效学。发明人运用NSG小鼠建立人肿瘤移植模型(Mixeno模型)，研究HX009-5在KARPAS-299人间变性大细胞淋巴瘤皮下移植MiXeno模型中的抗肿瘤作用。

第0天(Day 0)在右侧背部皮下接种KARPAS-299细胞于30只NCG小鼠中，接种肿瘤细胞后6天(Day 6)当平均瘤体积达到60mm³，均匀分成5组，每组6只小鼠。自尾静脉移植PBMC于30只NCG小鼠(第1-5组小鼠)中，由于PBMC来源不同，分为donorA和donorB，每组6只小鼠分为a和b各3只，细胞重悬在PBS中(0.1ml接种体积)。试验分为测试药HX009-5 0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg、阳性对照H8(也即下面所指HX008)10mg/kg组及同型抗体Human IgG45mg/kg对照组。尾静脉注射给药，分别于接种肿瘤细胞后第6，9，13，16，19，22天给药，共给药六次(见表11)。根据相对肿瘤抑制率(TGI_RTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。

表11：测试药HX009-5在KARPAS-299Mixeno肿瘤模型中的抗肿瘤作用实验设计

注：给药体积为10μl/g；n：动物只数；Day 0为肿瘤细胞接种当天；i.v.：尾静脉给药。

各组的肿瘤体积随时间变化如下图14和15所示，相对对照组接种了PBMC的同型抗体(Human lgG4)，测试药HX009-5和H8均表现出了明显的抑瘤作用。其中，HX009-5有明显的剂量相关性，给药剂量越大，肿瘤抑制率越高。同等浓度下，HX009-5比H8表现出更强的肿瘤抑制力，说明PD1/CD47双靶点抗体优于PD1单靶点抗体。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州翰思生物医药有限公司

<120> 抗PD-1/CD47的双特异性抗体及其应用

<130> PIDC3175932

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 连接肽的氨基酸序列

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Gly Glu Thr Gly

1 5 10 15

Pro

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重组抗体的轻链的氨基酸序列

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Lys Gly Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asn

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 580

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重组抗体的重链的氨基酸序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Gly Glu Thr Gly Pro Glu Glu

450 455 460

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly

465 470 475 480

Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

485 490 495

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr

500 505 510

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser

515 520 525

Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr

530 535 540

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

545 550 555 560

Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg

565 570 575

Ala Lys Pro Ser

580

<210> 4

<211> 654

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码重组抗体轻链的核酸序列

<400> 4

gacatcgtgc tgacccagtc ccctgcttcc ctggctgtgt cccctggaca gagggccacc 60

atcacatgcc gggcctccga gtccgtggac aactacggca tctccttcat gaactggttc 120

cagcagaagc ccggccagcc tcccaagctg ctgatctacg ccgcctccaa caagggcaca 180

ggcgtgcctg ccaggttttc cggttctggc tccggcaccg acttcaccct gaacatcaac 240

cctatggaag aggaagacac cgccatgtac ttctgccagc agtccaagga ggtgccttgg 300

acattcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagcggaccg tggccgctcc aagcgtcttc 360

atttttcccc cttccgacga acagctgaag agtgggacag cctcagtggt ctgtctgctg 420

aacaatttct accctagaga ggctaaggtg cagtggaaag tcgataacgc actgcagtct 480

ggcaatagtc aggagtcagt gacagaacag gacagcaagg attccactta ttctctgtct 540

agtacactga ctctgtctaa agccgactac gaaaagcaca aagtgtatgc ttgtgaagtg 600

acccaccagg ggctgtccag tcccgtgacc aaatctttca ataggggcga gtgt 654

<210> 5

<211> 1740

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码重组抗体重链的核酸的序列

<400> 5

gaggtgcagc tggtccagag cggaggcgga ctggtccagc ctggcggcag cctgaagctc 60

agctgtgccg ccagcggatt caccttctcc tcctacggaa tgtcctgggt ccggcaggct 120

cctggcaaag gactggactg ggtggctacc atctccggcg gaggaaggga cacctactac 180

cccgactccg tcaagggcag gttcaccatc tcccgggaca atagcaagaa caacctgtat 240

ctccagatga acagcctgcg ggctgaggac accgccctgt actactgcgc tcggcagaag 300

ggcgaagcct ggttcgccta ttggggacag ggcacactgg tgaccgtgag cgccgccagc 360

acaaaaggcc ccagcgtgtt ccccctggct ccctgttcca ggagcaccag cgagtccacc 420

gctgctctgg gctgcctggt gaaggactat ttccctgagc ccgtcaccgt cagctggaat 480

agcggcgccc tgaccagcgg agtccacaca ttccccgccg tgctgcaaag cagcggcctg 540

tactccttat cttctgtcgt gaccgtgccc tccagcagcc tgggaaccaa gacctatacc 600

tgcaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggata agcgggtcga atccaagtac 660

ggcccccctt gtcctccttg tcccgctcct gagttcctgg gaggacccag cgtgtttctg 720

ttccctccta agcccaagga caccctgatg atcagccgga cccccgaggt cacctgtgtg 780

gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag gtgcagttta actggtacgt ggacggcgtg 840

gaagtgcaca atgccaagac caagcccagg gaggagcagt tcaacagcac ctaccgggtg 900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaaa 960

gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tctccaaggc caagggccaa 1020

cctcgggagc cccaagtgta tacactgccc ccttcccagg aagagatgac caagaaccag 1080

gtcagcctca cctgtctggt gaagggcttc tatcccagcg acatcgccgt cgaatgggaa 1140

tccaacggcc agcccgagaa caattacaag accacccccc ccgtgctgga ttccgacggc 1200

tccttctttc tgtatagccg gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagga gggcaacgtg 1260

ttctcctgta gcgtcatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa atccctgtcc 1320

ctgtccctgg gaaagggcgg cggcggctcc ggcggaggag gcagcgaaag gggcgaaacc 1380

ggccctgagg aggagttaca agtgatccag cccgacaagt ccgtgtccgt ggctgctggc 1440

gagtccgcta tcctgcactg caccgtgacc tccctgatcc ccgtgggccc tatccagtgg 1500

ttcaggggag ctggccccgc tagggagctg atctacaacc agaaggaggg ccacttcccc 1560

agggtgacca ccgtgtccga gagcaccaag agggagaaca tggacttctc catcagcatc 1620

tccaacatca cccccgctga cgccggcacc tactactgcg tgaagttcag gaagggcagc 1680

cccgacaccg agttcaagtc cggcgctggc accgagctgt ccgtgagggc caaaccctcc 1740

Claims

1.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包括：抗PD-1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述重组抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的重组抗体。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述重组抗体轻链对应的核酸序列如SEQID NO：4所示，所述重组抗体重链对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.一种制备权利要求1所述的重组抗体的方法，其特征在于，包括：

将权利要求2或3所述的核酸引入到哺乳动物细胞中；

将所述哺乳动物细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括选自CHOK1、CHOS、293F、293T之一。

6.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：

权利要求1所述的重组抗体或者权利要求2～3任一项所述的核酸。