CN109884224B - 一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法 - Google Patents
一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种卡络磺钠及其制剂的检测样品配置方法，它包括如下步骤：分别取待测样品，盐酸氨基脲对照品和空白，加水和甲醇溶解，调节pH值2.0～8.0，摇匀，再加入2‑萘甲醛溶液，用水定容，摇匀，室温下反应1h～5h，过滤，续滤液加正己烷萃取，离心，取底层水溶液反复萃取，离心，即得。本发明还提供了一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法，兼顾了测定不同剂型的卡络磺钠制剂的盐酸氨基脲含量，具有较好的通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为卡络磺钠及其制剂的盐酸氨基脲含量的质量控制提供了有效保障，保证了用药安全，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法。
背景技术
卡络磺钠，化学名为1-甲基-6-氧代-2,3,5,6-四氢吲哚-5-缩氨脲-2-磺酸钠，具有式I所示的结构式：
卡络磺钠由日本田边三菱制药株式会社(MITSUBISHI TANABE公司)原研，商品名:Adona阿洛那，适应于毛细血管阻力的减弱和渗透性的增强引起的出血倾向(例如紫癜等)；由于毛细血管阻力的减弱而从皮肤或粘膜和内膜渗出的眼底出血、肾出血和子宫出血；毛细血管阻力的减弱引起的手术期间和手术后异常出血。
盐酸氨基脲，具有式Ⅱ所示的结构式：
盐酸氨基脲属于肼系列化学物质，早期研究表明盐酸氨基脲具有致诱变性和潜在的致癌性，近期的研究表明，盐酸氨基脲不仅能够在组织形态学水平上导致多种组织形态改变，而且还可以对神经***、内分泌***的功能产生影响。75～225mg/L盐酸氨基脲可导致大鼠胎儿肺和肝脏器官内核酸水平显著降低，增加幼年小鼠肺肿瘤发生率；此外，能够显著增加鼠骨髓嗜多染红细胞的微核率，表现出弱遗传毒性。盐酸氨基脲是GABA合成酶GAD(谷氨酸脱羧酶)的抑制剂，并且对NMDAR(N-甲基-D-天冬氨酸受体)，具有拮抗作用，从而产生神经毒性。盐酸氨基脲可致大鼠多个靶组织器官形态结构的改变且具有一定的性别差异，其中，对胸腺及肾上腺的组织学改变仅在雌性中表现出来，而对甲状腺组织结构的改变仅在雄性中表现明显，对生殖器官毒性表现为其能够改变雌性卵巢和雄性睾丸显微结构。雌性大鼠口服60、110、210mg/kg盐酸氨基脲28d能够降低其血浆内E2(***)水平，并且呈剂量-效应关系，表现出抗***效应。
盐酸氨基脲作为卡络磺钠的合成起始物料，即肾上腺色腙(也称为卡巴克络)的合成试剂，在其合成过程中可能存在残留。另外，由于卡络磺钠结构中存在缩氨脲基团，在卡络磺钠及其制剂储存过程中，可能受高温、氧化、光照等影响造成缩氨脲基团断裂，从而产生盐酸氨基脲。基于前述盐酸氨基脲的潜在毒性，为控制卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量，保障药品安全性，开发一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法成为亟待解决的问题。
通过检索国内外相关标准与文献，国内外均无卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲含量测定的法定标准，仅发现一篇由Kossana Canavesi在Chromatographia(2017)80:1535-154发表的文献中报道了，卡络磺钠与卡巴克络的盐酸氨基脲含量检测方法。但是该方法的反应平衡时间长，专属性差，回收率偏高，影响结果准确性，且会导致含辅料的卡络磺钠制剂柱前衍生反应减慢，影响检测效率与准确性，因此并不适用于卡络磺钠及其制剂的检测。
发明内容
为解决前述问题，本发明提供了一种卡络磺钠及其制剂盐酸氨基脲的含量测定方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤：
(1)样品配制及衍生反应
a、空白溶液：取甲醇和水，调节pH值，摇匀，再加入2-萘甲醛溶液，用水定容，室温下反应，即得；
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲对照品，加水溶解，再加甲醇和水稀释，调节pH值，摇匀，加入2-萘甲醛溶液，用水定容，摇匀，室温下反应，即得；
c、供试品溶液：取待测样品，加甲醇和水溶解，调节pH值，摇匀，再加入2-萘甲醛溶液，用水定容，摇匀，室温下反应，即得；
(2)液-液萃取
分别取空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液，加正己烷萃取，离心，取底层水溶液反复萃取，离心，即得；
(3)高效液相色谱检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；等度洗脱程序：A相：B相＝65:35；
(4)计算含量
按照外标法计算样品中盐酸氨基脲的含量，具体计算公式如下：
所述A对为对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；A样为供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；C对为对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；C样为供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
进一步地，步骤a所述甲醇与2-萘甲醛溶液的体积比为2:1～5:1，优选为4:1；所述用水定容至甲醇浓度为0.2ml/ml～0.5ml/ml，优选为0.4ml/ml。
进一步地，步骤b所述盐酸氨基脲对照品与甲醇和2-萘甲醛溶液的质量体积比为(1～10)μg:(2～5)ml:1ml，优选为(1～10)μg:4ml:1ml；所述用水定容至盐酸氨基脲浓度为(0.1～1)μg/ml。
进一步地，步骤c所述待测样品与甲醇和2-萘甲醛溶液的质量体积比为(1～10)mg：(2～5)ml：1ml，优选为(1～10)mg:4ml:1ml；所述用水定容至待测样品浓度为(0.1～1)mg/ml；所述溶解为超声溶解，时间为5～40min，优选为20min。
进一步地，步骤(1)中，所述调节pH值所用试剂为盐酸、磷酸、硫酸或冰醋酸，优选为盐酸溶液，其浓度为(3→1000)；所述调节pH值2.0～8.0，优选3.0～6.0，更优选3.5～5.5。
进一步地，所述溶液的浓度后标示的“(3→1000)”，系指液体溶质盐酸3.0ml加水使成1000ml的溶液。
进一步地，步骤(1)中，所述2-萘甲醛溶液是将2-萘甲醛溶解于95％乙醇制成浓度为10mg/ml的溶液。
进一步地，步骤(1)中，所述反应时间为1h～5h，优选为2h。
进一步地，步骤(2)中，所述续滤液与正己烷的体积比为1:2；所述离心的转速为4000rpm，时间3min。
进一步地，步骤(2)中，所述反复萃取至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件中流速为1.0ml/min，柱温为室温，检测波长为272nm±10nm，进样体积为20μl。
本发明对不同衍生温度、不同衍生pH环境及加入衍生催化试剂进行深入研究，发现衍生温度与衍生催化试剂对反应速率无明显影响，而柱前衍生反应的pH环境对反应速率有明显的改善，在衍生pH环境达到3.5～5.5时，盐酸氨基脲对照品、卡络磺钠与卡络磺钠相关制剂衍生反应速率均一致。试验数据显示：通过本发明方法，不同制剂类型的样品与2-萘甲醛反应1h就能达到反应平衡，解决了现有技术中柱前衍生反应速率缓慢，检测准确性差的问题。
本发明对衍生试剂2-萘甲醛与液-液萃取时所用萃取剂进行分析研究，通过筛选，发现正己烷作为萃取剂不会对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰产生干扰，但2-萘甲醛中存在与2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰保留时间一致的其它杂质峰，进一步研究发现其杂质可以通过增加正己烷萃取次数溶于正己烷中而消除影响。再对不同品牌的2-萘甲醛进行比较试验，发现不同品牌2-萘甲醛所含杂质不同，需要正己烷的洗脱次数存在一定差异，比如SIGMA生产的2-萘甲醛需要液-液萃取4次，而阿拉丁生产的2-萘甲醛需要液-液萃取6次，由于检测时衍生反应所用的2-萘甲醛很难做到保持实用同一品牌，因此，结合检测实际，液-液萃取次数需要由空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰时所用萃取次数确定。本发明的这个关键技术解决了现有技术中存在的：空白溶液中有色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰产生干扰，影响方法的专属性问题。
本发明方法针对现有技术存在的问题，还进一步改进，确定了柱前衍生反应pH值，对液-液萃取的步骤进行了合理限定，使本发明方法能够快速、准确的检测卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量。
本发明卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法，兼顾了测定不同剂型的卡络磺钠制剂的盐酸氨基脲含量，具有较好的通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为卡络磺钠及其制剂中的盐酸氨基脲含量的质量控制提供了有效保障，保证了用药安全，具有良好的应用前景。本发明更能够满足新颖性、创造性和实用性的特征。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1盐酸氨基脲对照品溶液色谱图。
图2空白溶液与对照品溶液对比图谱(1、盐酸氨基脲对照品溶液2、空白溶液)。
图3样品溶液与对照品溶液对比图谱(1、卡络磺钠2、盐酸氨基脲对照品溶液)。
图4样品溶液与对照品溶液对比图谱(1、卡络磺钠注射液2、盐酸氨基脲对照品溶液)。
图5样品溶液与对照品溶液对比图谱(1、卡络磺钠氯化钠注射液2、盐酸氨基脲对照品溶液)。
图6样品溶液与对照品溶液对比图谱(1、注射用卡络磺钠2、盐酸氨基脲对照品溶液)。
图7样品溶液与对照品溶液对比图谱(1、卡络磺钠片2、盐酸氨基脲对照品溶液)。
具体实施方式
实施例1卡络磺钠中盐酸氨基脲的含量测定
待测样品卡络磺钠
(1)样品配制及衍生反应
a、空白溶液：取4ml甲醇与适量水，置10ml容量瓶中，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5之间，摇匀，然后再加入1.0ml 2-萘甲醛(NCA)溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加适量水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1.0ml置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5之间，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
c、供试品溶液：取卡络磺钠样品10mg，置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，超声20min，使卡络磺钠溶解，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH在3.5～5.5之间，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
(2)液-液萃取
分别取上述空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液各1ml置离心管中，加入2ml正己烷中，充分混合后，以4000rpm转速离心3min，弃去上层有机层，重复此操作数次，将水溶液作为测试溶液。先分别取空白溶液、对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，确定空白溶液中色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，若有干扰继续增加萃取离心次数，直至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
(3)检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：甲醇：水(65:35)
流速1.0ml/min，柱温为室温，检测波长：272nm±10nm，进样体积20μl
(4)盐酸氨基脲的计算
供试品溶液色谱图中若有与对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲峰保留时间一致的色谱峰，按照外标法以对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积计算盐酸氨基脲的含量，具体按照如下公式计算盐酸氨基脲含量：
A对：对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；
A样：供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；
C对：对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；
C样：供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
实施例2卡络磺钠注射液中盐酸氨基脲的含量测定
待测样品卡络磺钠注射液规格为20ml：100mg
(1)供试品及对照品制备及衍生过程
a、空白溶液：取4ml甲醇与适量水，置10ml容量瓶中，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加适量水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，作为对照品贮备液。精密量取1.0ml置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
c、供试品溶液：精密量取本品2.0ml，置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，摇匀，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
(2)液-液萃取过程
分别取上述空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液各1ml置离心管中，加入2ml正己烷中，充分混合后，以4000rpm转速离心3min，弃去上层有机层。重复此操作数次，将水溶液作为测试溶液，先分别取空白溶液、对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，确定空白溶液中色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，若有干扰继续增加萃取离心次数，直至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
(3)检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：甲醇：水(65:35)
流速1.0ml/min，柱温为室温，检测波长：272nm±10nm，进样体积20μl
(4)盐酸氨基脲的计算
供试品溶液色谱图中若有与对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲峰保留时间一致的色谱峰，按照外标法以对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积计算盐酸氨基脲的含量，具体按照如下公式计算盐酸氨基脲含量：
A对：对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；
A样：供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；
C对：对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；
C样：供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
实施例3卡络磺钠氯化钠注射液中盐酸氨基脲的含量测定
待测样品卡络磺钠氯化钠注射液规格为100ml：80mg
(1)供试品及对照品制备及衍生过程
a、空白溶液：取4ml甲醇与适量水，置10ml容量瓶中，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加适量水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，作为对照品贮备液。精密量取1.0ml置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
c、供试品溶液：精密量取本品2.0ml，置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，摇匀，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
(2)液-液萃取过程
分别取上述空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液各1ml置离心管中，加入2ml正己烷中，充分混合后，以4000rpm转速离心3min，弃去上层有机层。重复此操作数次，将水溶液作为测试溶液，分别取空白溶液、对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，确定空白溶液中色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，若有干扰继续增加萃取离心次数，直至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
(3)检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：甲醇：水(65:35)
流速1.0ml/min，柱温为室温，检测波长：272nm±10nm，进样体积20μl
(4)盐酸氨基脲的计算
供试品溶液色谱图中若有与对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲峰保留时间一致的色谱峰，按照外标法以对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积计算盐酸氨基脲的含量，具体按照如下公式计算盐酸氨基脲含量：
A对：对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；
A样：供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；
C对：对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；
C样：供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
实施例4注射用卡络磺钠中盐酸氨基脲的含量测定
待测样品注射用卡络磺钠规格为20mg
(1)供试品及对照品制备及衍生过程
a、空白溶液：取加4ml甲醇与适量水，置10ml容量瓶中，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加适量水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，作为对照品贮备液。精密量取1.0ml置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
c、供试品溶液：取本品1瓶(20mg)，转移至20ml容量瓶中，瓶中剩余内容物加适量水溶解，一同转移至容量瓶中，再用少量水润洗空瓶2次，一同转移至容量瓶中，向容量瓶中加8ml甲醇，超声20min，使卡络磺钠溶解，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入2.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
(2)液-液萃取过程
分别取上述空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液各1ml置离心管中，加入2ml正己烷中，充分混合后，以4000rpm转速离心3min，弃去上层有机层。重复此操作数次，将水溶液作为测试溶液，分别取空白溶液、对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，确定空白溶液中色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，若有干扰继续增加离心萃取次数，直至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
(3)检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：甲醇：水(65:35)
流速1.0ml/min，柱温为室温，检测波长：272nm±10nm，进样体积20μl
(4)盐酸氨基脲的计算
供试品溶液色谱图中若有与对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲峰保留时间一致的色谱峰，按照外标法以对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积计算盐酸氨基脲的含量，具体按照如下公式计算盐酸氨基脲含量：
A对：对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；
A样：供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；
C对：对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；
C样：供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
实施例5卡络磺钠片中盐酸氨基脲的含量测定
待测样品卡络磺钠片规格为10mg
(1)供试品及对照品制备及衍生过程
a、空白溶液：取4ml甲醇与适量水，置10ml容量瓶中，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
b、对照品溶液：取盐酸氨基脲10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加适量水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，作为对照品贮备液。精密量取1.0ml置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
c、供试品溶液：取本品1片(10mg)，置10ml容量瓶中，加4ml甲醇与适量水，超声20min，使卡络磺钠溶解，使用盐酸溶液(3→1000)调节pH至3.5～5.5，摇匀，然后再加入1.0mlNCA溶液，并用水定容，摇匀；将此溶液在室温下反应2小时。
(2)液-液萃取过程
分别取上述空白溶液、对照品溶液与供试品溶液过滤，取续滤液各1ml置离心管中，加入2ml正己烷中，充分混合后，以4000rpm转速离心3min，弃去上层有机层。重复此操作数次，将水溶液作为测试溶液，分别取空白溶液对照品溶液20μl注入液相色谱仪，确定空白溶液中色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，若有干扰继续增加萃取离心次数，直至空白溶液色谱图中其它色谱峰对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰。
(3)检测
分别将空白测试溶液，对照品测试溶液和供试品测试溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：甲醇：水(65:35)
流速1.0ml/min，柱温为室温，检测波长：272nm±10nm，进样体积20μl
(4)盐酸氨基脲的计算
供试品溶液色谱图中若有与对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲峰保留时间一致的色谱峰，按照外标法以对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积计算盐酸氨基脲的含量，具体按照如下公式计算盐酸氨基脲含量：
A对：对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；
A样：供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；
C对：对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度(μg/ml)；
C样：供试品溶液中卡络磺钠的浓度(mg/ml)。
以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：
试验例1卡络磺钠中盐酸氨基脲检测分析方法验证
1、分析方法
同实施例1，得色谱图(见图1～图3)。
2、专属性
取实施例1步骤a所述空白溶液按照实施例1步骤(3)所述的色谱条件进行分析，结果表明，空白溶液对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，专属性良好。
3、定量限
按照实施例1步骤b所述方法制备对照品溶液，经过液-液萃取的待测溶液，经稀释，按照实施例1步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，在S/N约为10时，盐酸氨基脲的浓度为4.86ng/ml，相当于卡络磺钠浓度的0.0005％。
4、线性
分别取相当于盐酸氨基脲为48.6ng、809.3ng、1618.6ng、4046.5ng、6474.4ng、8093.0ng、9711.6ng与12139.5ng的对照品溶液置10ml容量瓶中，按照实施例1步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的线性系列溶液，按照实施例1步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲测定浓度在4.86ng/ml～1213.95ng/ml的范围内，线性方程为y＝4972.4x+4535.9，相关系数r＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。
5、回收率
分别精密称取卡络磺钠约10mg，共9份，置10ml容量瓶中，分别加入所述方法对照品贮备液0.5ml、1.0ml与1.5ml，各3份，按照实施例1步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的高、中、低回收溶液，按照实施例1步骤(3)所述色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲回收率在97％～101％之间，RSD＜1.0％，回收率符合要求。
6、重复性
分别精密称取卡络磺钠约10mg，共6份，置10ml容量瓶中，精密加入实施例1所述方法对照品贮备液0.5ml，按照实施例1步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的重复性系列溶液，按照实施例1步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲含量结果RSD＜1.0％，重复性符合要求。
7、溶液稳定性
供试品溶液置室温条件下放置，在24小时内供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰峰面积RSD为1.3％，结果表明，供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。
试验例2卡络磺钠注射液分析方法验证
方法学验证所用卡络磺钠注射液规格为20ml：100mg。
1、分析方法
同实施例2，得色谱图(见图4)
2、专属性
按照卡络磺钠注射液说明书处方配制空白制剂溶液，按照实施例2方法制备供试品溶液，经过液-液萃取的空白辅料溶液，按照实施例2步骤(3)的色谱条件进行分析，结果表明，空白辅料溶液对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，专属性良好。
3、定量限
按照实施例2方法制备对照品溶液，经过液-液萃取的待测溶液，经稀释，按照实施例2步骤(3)的色谱条件进行检测，结果表明，在S/N约为10时，盐酸氨基脲的浓度为4.86ng/ml，相当于卡络磺钠浓度的0.0005％。
4、线性
分别取相当于盐酸氨基脲为48.6ng、809.3ng、1618.6ng、4046.5ng、6474.4ng、8093.0ng、9711.6ng与12139.5ng的对照品溶液置10ml容量瓶中，按照实施例2步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的线性系列溶液，按照实施例2步骤(3)色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲测定浓度在4.86ng/ml～1213.95ng/ml的范围内，线性方程为y＝4972.4x+4535.9，相关系数r＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。
5、回收率
分别精密量取卡络磺钠注射液2.0ml，共9份，置10ml容量瓶中，分别加入实施例2步骤b所述方法对照品贮备液0.5ml、1.0ml与1.5ml，各3份，按照实施例2步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的高、中、低回收溶液，按照实施例2步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲回收率在99％～102％之间，RSD＜1.0％，回收率符合要求。
6、重复性
分别精密量取卡络磺钠注射液2.0ml，共6份，置10ml容量瓶中，按照实施例2步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的重复性系列溶液，按照实施例2步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲含量结果RSD＜1.0％，重复性符合要求。
7、溶液稳定性
供试品溶液置室温条件下放置，在24小时内供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰峰面积RSD为1.4％，结果表明，供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。
试验例3卡络磺钠氯化钠注射液分析方法验证
方法学验证所用卡络磺钠氯化钠注射液规格为100ml：80mg。
1、分析方法
同实施例3，得色谱图(见图5)
2、专属性
按照卡络磺钠氯化钠注射液说明书处方配制空白制剂溶液，按照实施例3所述方法制备供试品溶液，经过液-液萃取的空白辅料溶液，按照实施例3所述的色谱条件进行分析，结果表明，空白辅料溶液对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，专属性良好。
3、定量限
按照实施例3所述方法制备对照品溶液，经过液-液萃取的待测溶液，经稀释，按照实施例3的色谱条件进行检测，结果表明，在S/N约为10时，盐酸氨基脲的浓度为4.86ng/ml，相当于卡络磺钠浓度的0.003％。
4、线性
分别取相当于盐酸氨基脲为48.6ng、809.3ng、1618.6ng、4046.5ng、6474.4ng、8093.0ng、9711.6ng与12139.5ng的对照品溶液置10ml容量瓶中，按照实施例3步骤(1)所述方法进行衍生反应，经液-液萃取后的线性系列溶液，按照实施例3色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲测定浓度在4.86ng/ml～1213.95ng/ml的范围内，线性方程为y＝4972.4x+4535.9，相关系数r＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。
5、回收率
分别精密量取卡络磺钠氯化钠注射液2.0ml，共9份，置10ml容量瓶中，分别加入实施例3步骤b所述方法对照品贮备液0.5ml、1.0ml与1.5ml，各3份，按照实施例3步骤(1)所述衍生方法进行衍生反应，经液-液萃取后的高、中、低回收溶液，按照实施例3所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲回收率在97％～101％之间，RSD＜1.0％，回收率符合要求。
6、重复性
分别精密量取卡络磺钠氯化钠注射液2.0ml，共6份，置10ml容量瓶中，按照本实施例3步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的重复性系列溶液，按照本发明所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲含量结果RSD＜1.0％，重复性符合要求。
7、溶液稳定性
供试品溶液置室温条件下放置，在24小时内供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰峰面积RSD为1.5％，结果表明，供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。
试验例4注射用卡络磺钠分析方法验证
方法学验证所用注射用卡络磺钠规格为20mg。
1、分析方法
同实施例4，得色谱图(见图6)
2、专属性
按照注射用卡络磺钠说明书处方配制空白制剂溶液，按照实施例4所述方法制备供试品溶液，经过液-液萃取的空白辅料溶液，按照实施例4所述色谱条件进行分析，结果表明，空白辅料溶液对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，专属性良好。
3、定量限
按照实施例4所述方法制备对照品溶液，经过液-液萃取的待测溶液，经稀释，按照实施例4所述色谱条件进行检测，结果表明，在S/N约为10时，盐酸氨基脲的浓度为4.86ng/ml，相当于卡络磺钠浓度的0.0005％。
4、线性
分别取相当于盐酸氨基脲为48.6ng、809.3ng、1618.6ng、4046.5ng、6474.4ng、8093.0ng、9711.6ng与12139.5ng的对照品溶液置10ml容量瓶中，按照实施例4步骤(1)所述衍生方法进行衍生反应，经液-液萃取后的线性系列溶液，按照实施例4步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲测定浓度在4.86ng/ml～1213.95ng/ml的范围内，线性方程为y＝4972.4x+4535.9，相关系数r＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。
5、回收率
取本品1瓶(20mg)，置20ml容量瓶中(共9份)，分别加入实施例4步骤b所述对照品贮备液1.0ml、2.0ml与3.0ml，各3份，按照实施例4步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的高、中、低回收溶液，按照本发明所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲回收率在98％～101％之间，RSD＜1.0％，回收率符合要求。
6、重复性
取本品1瓶(20mg)，置20ml容量瓶中，共6份，按照实施例4步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的重复性系列溶液，按照实施例4步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲含量结果RSD＜1.0％，重复性符合要求。
7、溶液稳定性
供试品溶液置室温条件下放置，在24小时内供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰峰面积RSD为1.0％，结果表明，供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。
试验例5卡络磺钠片分析方法验证
方法学验证所用卡络磺钠片规格为10mg。
1、分析方法
同实施例5，得色谱图(见图7)
2、专属性
按照卡络磺钠片说明书处方配制空白制剂溶液，按照实施例5所述方法制备供试品溶液，经过液-液萃取的空白辅料溶液，按照实施例5所述的色谱条件进行分析，结果表明，空白辅料溶液对2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰无干扰，专属性良好。
3、定量限
按照实施例5所述方法制备对照品溶液，经过液-液萃取的待测溶液，经稀释，按照实施例5的色谱条件进行检测，结果表明，在S/N约为10时，盐酸氨基脲的浓度为4.86ng/ml，相当于卡络磺钠浓度的0.0005％。
4、线性
分别取相当于盐酸氨基脲为48.6ng、809.3ng、1618.6ng、4046.5ng、6474.4ng、8093.0ng、9711.6ng与12139.5ng的对照品溶液置10ml容量瓶中，按照实施例5步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的线性系列溶液，按照实施例5步骤(3)所述色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲测定浓度在4.86ng/ml～1213.95ng/ml的范围内，线性方程为y＝4972.4x+4535.9，相关系数r＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。
5、回收率
取本品1片(10mg)，置10ml容量瓶中(共9份)，分别加入所述方法对照品贮备液0.5ml、1.0ml与1.5ml，各3份，按照实施例5步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的高、中、低回收溶液，按照实施例5所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲回收率在98％～101％之间，RSD＜1.0％，回收率符合要求。
6、重复性
取本品1片(10mg)，置10ml容量瓶中，共6份，按照实施例5步骤(1)所述的衍生方法进行衍生，经液-液萃取后的重复性系列溶液，按照实施例5步骤(3)所述的色谱条件进行检测，结果表明，盐酸氨基脲含量结果RSD＜1.0％，重复性符合要求。
7、溶液稳定性
供试品溶液置室温条件下放置，在24小时内供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰峰面积RSD为0.9％，结果表明，供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。
试验证明：本发明卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法，能测定不同剂型的卡络磺钠制剂的盐酸氨基脲含量，具有较好的通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为卡络磺钠及其制剂的盐酸氨基脲含量的质量控制提供了有效保障，具有良好的应用前景。
Claims (14)
1.一种卡络磺钠及其制剂的检测样品配置方法，其特征在于：它包括如下步骤：
分别取待测样品，盐酸氨基脲对照品和空白，加水和甲醇溶解，调节pH值3.5～5.5，摇匀，再加入2-萘甲醛溶液，用水定容，摇匀，室温下反应1h～5h，过滤，续滤液加正己烷萃取，离心，取底层水溶液反复萃取，离心，即得。
2.根据权利要求1所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述待测样品或盐酸氨基脲对照品与甲醇和2-萘甲醛溶液的质量体积比为1～10mg: 2～5ml: 1ml；所述用水定容至待测样品或盐酸氨基脲对照品浓度为0.1～1 mg/ml；所述溶解为超声溶解，时间为5min～40min。
3.根据权利要求2所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述待测样品或盐酸氨基脲对照品与甲醇和2-萘甲醛溶液的质量体积比为1～10mg:4ml:1ml。
4.根据权利要求2所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述超声溶解时间为20min。
5.根据权利要求1所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述空白中加甲醇与2-萘甲醛溶液的体积比为2:1～5:1；所述空白中用水定容至甲醇浓度为0.2ml/ml～0.5ml/ml。
6.根据权利要求5所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述空白中加甲醇与2-萘甲醛溶液的体积比为4:1；所述空白中用水定容至甲醇浓度为0.4ml/ml。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述2-萘甲醛溶液是将2-萘甲醛溶解于95％乙醇制成浓度为10mg/ml的溶液。
8.根据权利要求1所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述调节pH值所用试剂为盐酸、磷酸、硫酸或冰醋酸。
9.根据权利要求8所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述调节pH值所用试剂为盐酸溶液，其浓度为3→1000。
10.根据权利要求1所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述室温下反应2h。
11.根据权利要求1所述的检测样品配置方法，其特征在于：所述续滤液与正己烷的体积比为1:2；所述离心的转速为4000rpm，时间为3min。
12.一种卡络磺钠及其制剂中盐酸氨基脲的含量测定方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)取权利要求1所得待测样品溶液、对照品溶液、空白溶液；
(2)分别将步骤(1)溶液注入高效液相色谱仪，得色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；等度洗脱程序：A相:B相＝65:35；
(3)计算含量
按照外标法计算样品中盐酸氨基脲的含量，具体计算公式如下：
所述A对为对照品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲的峰面积；A样为供试品溶液中2-萘甲醛缩氨基脲对应的峰面积；C对为对照品溶液中盐酸氨基脲的浓度μg/ml；C样为供试品溶液中卡络磺钠的浓度mg/ml。
13.根据权利要求12所述的含量测定方法，其特征在于：所述空白溶液色谱图中色谱峰对待测样品溶液和/或对照品溶液色谱图中的2-萘甲醛缩氨基脲色谱峰应无干扰，如存在干扰，待测样品溶液、对照品溶液和空白溶液应再次萃取离心。
14.根据权利要求12所述的含量测定方法，其特征在于：步骤(2)所述色谱条件中流速为1.0ml/min，柱温为室温，检测波长为272nm±10nm，进样体积为20μl。
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