CN109884222B - 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 - Google Patents
一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109884222B CN109884222B CN201910044474.9A CN201910044474A CN109884222B CN 109884222 B CN109884222 B CN 109884222B CN 201910044474 A CN201910044474 A CN 201910044474A CN 109884222 B CN109884222 B CN 109884222B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- caulis sinomenii
- peak
- rutinoside
- solution
- fingerprint
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法。该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映小花清风藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的小花清风藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度和峰形好，柱效高。
Description
技术领域
本发明涉及一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，属于药品技术的领域。
背景技术
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分***研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。
小花清风藤Sabia parviflora Wall.ex Roxb.为清风藤科Sabiaceae清风藤属Sabia植物，是贵州苗族、布依族等民族治疗肝炎、风湿痹痛、跌打损伤等疾病的常用药物。现代研究表明，小花清风藤及同属多种植物主要含生物碱类、黄酮类及三萜类成分，具有很好的抗病毒、保肝、降酶、抗炎等作用。近年来，作者在国家自然科学基金、贵州省一流学科建设等项目的资助下对小花清风藤及其同属植物开展了包括资源调查、引种栽培、生药鉴定、药材质量、化学成分、药理药效等方面的深入研究，发现小花清风藤具有较高的开发利用价值，但质量控制方面的研究还比较薄弱。鉴于中药指纹图谱在质量控制和鉴定方面具有突出优势，作者团队在对清风藤属药用植物资源、化学成分等进行***研究的基础上，对小花清风藤的化学指纹图谱进行了深入研究，研究成果即为本发明。
发明内容
本发明目的在于，提供一种小花清风藤药材的HPLC指纹图谱建立方法。该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映小花清风藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的小花清风藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度和峰形好，柱效高。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素-3-O-龙胆双糖苷、Camellianoside、Tsubakioside A、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品，加70％乙醇溶液溶解，摇匀，制成槲皮素-3-O-龙胆双糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、Camellianoside质量浓度为0.250mg/mL、Tsubakioside A质量浓度为0.0675mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、异鼠李素-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0500mg/mL的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定小花清风藤粉末1g，精密加70％乙醇溶液溶解，称定重量，超声提取，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得；
(3)指纹图谱建立的色谱条件：色谱柱：Thermo Accucore-C18，150×4.6mm，2.6μm；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液为A相，乙腈为B相，0.1％磷酸水溶液为C相；梯度洗脱，检测波长为360nm，流速为1mL/min，柱温30℃，进样量10μL；记录谱图得到小花清风藤药材的HPLC指纹图谱；
(4)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次小花清风藤建立其HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有峰，这些共有峰构成了小花清风藤的指纹特征，建立了共有模式，作为小花清风藤药材的标准指纹图谱。
前述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法中，所述供试品溶液这样制备：精密称定小花清风藤粉末1g，置50mL具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15mL，称定重量，超声提取60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。
前述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法中，超声提取时，功率为100W，频率为80Hz。
前述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法中，梯度洗脱时，梯度洗脱程序是：0-5min：5％→12％的A和3％→6％的B；5-15min：12％→10％的A和6％→8％的B；15-20min：10％→20％的A和8％→10％的B；20-35min：20％→53％的A和10％→28％的B；35-45min：53％的A和28％的B；45-50min：53％→70％的A和28％→30％的B；50-60min：70％→65％的A和30％→35％的B。
前述的小花清风藤药材的HPLC指纹图谱建立方法中，所述15个共有峰中，1号峰为槲皮素-3-O-龙胆双糖苷，2号峰为Camellianoside，3号峰为Tsubakioside A，4号峰为山奈酚-3-O-芸香糖苷，6号峰为异鼠李素-3-O-芸香糖苷。
前述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法中，所述15个共有峰，以6号峰异鼠李素-3-O-芸香糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.444-0.447、0.515-0.518、0.714-0.719、0.831-0.833、0.943-0.945、1.000、1.107-1.117、1.551-1.557、1.629-1.635、1.646-1.653、1.664-1.671、1.776-1.784、1.804-1.813、2.250-2.260、2.282-2.292。
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究。
实验例：小花清风藤的HPLC指纹图谱研究
1仪器与试药
1.1仪器
Thermo UltiMate-3000型高效液相色谱仪，DAD检测器(德国Thermo公司)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Thermo Hytimate-C18(150×4.6mm，2.6μm)。
1.2试药
甲醇(美国天地有限公司，色谱纯。国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙腈(美国天地有限公司，色谱纯)；四氢呋喃(天津市大茂化学试剂厂，色谱纯)；乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(重庆川东化工有限公司，分析纯)；甲酸(天津市科技化学试剂有限公司，分析纯)；实验用水为重蒸馏水。
槲皮素-3-O-龙胆双糖苷，Camellianoside，Tsubakioside A，山奈酚-3-O-芸香糖苷，异鼠李素-3-O-芸香糖苷，以上对照品均通过ODS-A-HG C18反向层析柱以及Ailgent1100型半制备液相等分离手技术，自行从小花清风藤茎和叶中分离的单体化合物，结合1H-NMR和13C-NMR等波谱数据鉴定各化合物结构，利用HPLC峰面积归一化法计算，其质量分数均大于98％，可供含量测定对照品用。
1.3供试品的来源
实验用样品均由作者亲自采自于贵州、云南、广西等省区，并经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为清风藤科(Sabiaceae)植物小花清风藤(Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.)的叶，植物凭证标本保存于贵州中医药大学生药实验室。样品信息详见表1。
表1小花清风藤样品来源信息
2方法与结果
2.1色谱条件的确定
色谱柱：Thermo Accucore-C18(150×4.6mm,2.6μm)；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速1.0mL/min；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表2。
表2流动相梯度洗脱程序
2.2供试品溶液的制备
取样品粉末约1g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15mL，称定重量，超声提取(功率100W、频率80Hz)60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。
2.3对照品溶液的制备
分别精密称取槲皮素-3-O-龙胆双糖苷、Camellianoside、Tsubakioside A、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品适量，加70％乙醇溶液溶解并定容刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.0625mg/mL、0.250mg/mL、0.0675mg/mL、0.0625mg/mL、0.0500mg/mL的混合对照品溶液。
2.4方法学考察
2.4.1专属性试验
为了考察供试品溶液的提取溶剂和流动相的干扰情况，以提取溶剂70％乙醇溶液，按“2.1”项下色谱条件进行专属性试验测定，结果为采集的色谱图中无干扰溶剂峰出现，表明提取溶剂及流动相基本无干扰。(见图1)
2.4.2完整性试验
取S1药材(贵州省镇宁县)粉末约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。为考察采集指纹图谱的完整性，记录60min后，以30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液(65:35:0)流动相比例继续洗脱至120min，结果为色谱图中60min后无色谱峰信息，表明采集60min色谱图即可完整记录小花清风藤的化学成分信息。(见图2)
2.4.3精密度试验
取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样六次，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-O-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(1号)、Camellianoside(2号)、Tsubakioside A(3号)和山奈酚-3-O-芸香糖苷(4号)的相对保留时间的RSD值分别为0.16％、0.16％、0.28％、0.083％；相对峰面积的RSD值分别为0.54％、1.19％、0.50％、0.45％；均小于2.0％，结果表明仪器精密度良好。(见表3，图3)
表3精密度实验结果
2.4.4重复性试验
取S1药材(贵州省镇宁县)粉末6份，每份约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-O-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(1号)、Camellianoside(2号)、Tsubakioside A(3号)和山奈酚-3-O-芸香糖苷(4号)的保留时间的RSD值分别为0.084％、0086％、0.038％、0.079％；相对峰面积的RSD值分别为1.0％、0.63％、0.77％、1.9％；均小于2.0％，表明该方法重复性良好。(见表4，图4)
表4重复性试验结果
2.4.5稳定性试验
取S1药材(贵州省镇宁县)粉末，约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h依法测定，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-O-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(1号)、Camellianoside(2号)、Tsubakioside A(3号)和山奈酚-3-O-芸香糖苷(4号)的保留时间的RSD值分别为0.065％、0.077％、0.047％、0.030％；相对峰面积的RSD值分别为0.92％、0.55％、0.32％、1.6％；均小于2.0％，结果表明供试品溶液在24h内保持稳定。(见表5，图5)
表5稳定性试验结果
2.5指纹图谱的建立与相似度评价
2.5.1指纹图谱的建立
将11批小花清风藤药材粉末分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录60min的色谱。对比色谱图共得到15个共有峰；记录其保留时间和共有峰峰面积，见表6和表8；其中供试品溶液中1、2、3、4、6号峰与混合对照品比对归属为槲皮素-3-O-龙胆双糖苷、Camellianoside、Tsubakioside A、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷，以6号峰异鼠李素-3-O-芸香糖苷作为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值，结果表明，各共有指纹峰相对保留时间、峰面积比值相对稳定，见表7和表9，符合中药指纹图谱的技术要求。
表6 11批小花清风藤药材叶的15个特征峰的保留时间(min)
| 序号 | F<sub>1</sub> | F<sub>2</sub> | F<sub>3</sub> | F<sub>4</sub> | F<sub>5</sub> | F<sub>6</sub>(S) | F<sub>7</sub> | F<sub>8</sub> | F<sub>9</sub> | F<sub>10</sub> | F<sub>11</sub> | F<sub>12</sub> | F<sub>13</sub> | F<sub>14</sub> | F<sub>15</sub> |
| S1 | 10.430 | 12.107 | 16.817 | 19.483 | 22.090 | 23.380 | 26.103 | 36.360 | 38.187 | 38.600 | 39.020 | 41.640 | 42.310 | 52.747 | 53.507 |
| S2 | 10.390 | 12.090 | 16.763 | 19.443 | 22.080 | 23.380 | 26.077 | 36.363 | 38.200 | 38.607 | 39.023 | 41.673 | 42.337 | 52.757 | 53.510 |
| S3 | 10.433 | 12.100 | 16.777 | 19.453 | 22.067 | 23.393 | 26.080 | 36.347 | 38.180 | 38.583 | 39.000 | 41.627 | 42.280 | 52.740 | 53.497 |
| S4 | 10.420 | 12.090 | 16.780 | 19.447 | 22.063 | 23.360 | 26.083 | 36.343 | 38.157 | 38.580 | 39.003 | 41.610 | 42.283 | 52.760 | 53.507 |
| S5 | 10.437 | 12.017 | 16.680 | 19.390 | 22.047 | 23.347 | 26.060 | 36.350 | 38.170 | 38.593 | 39.013 | 41.643 | 42.317 | 52.760 | 53.510 |
| S6 | 10.443 | 12.133 | 16.847 | 19.517 | 22.110 | 23.433 | 25.933 | 36.343 | 38.177 | 38.577 | 38.990 | 41.617 | 42.270 | 52.720 | 53.467 |
| S7 | 10.438 | 12.107 | 16.817 | 19.487 | 22.090 | 23.400 | 26.097 | 36.340 | 38.183 | 38.567 | 38.977 | 41.597 | 42.243 | 52.717 | 53.467 |
| S8 | 10.443 | 12.043 | 16.733 | 19.443 | 22.060 | 23.367 | 26.083 | 36.327 | 38.150 | 38.550 | 38.963 | 41.567 | 42.223 | 52.720 | 53.467 |
| S9 | 10.440 | 12.087 | 16.783 | 19.463 | 22.073 | 23.367 | 26.093 | 36.333 | 38.160 | 38.560 | 38.973 | 41.583 | 42.237 | 52.713 | 53.463 |
| S10 | 10.443 | 12.063 | 16.767 | 19.457 | 22.067 | 23.363 | 26.087 | 36.323 | 38.143 | 38.550 | 38.967 | 41.567 | 42.227 | 52.717 | 53.463 |
| S11 | 10.443 | 12.053 | 16.720 | 19.430 | 22.063 | 23.383 | 26.073 | 36.327 | 38.153 | 38.553 | 38.967 | 41.573 | 42.227 | 52.717 | 53.463 |
表7 11批小花清风藤药材叶的15个特征峰的相对保留时间
| 序号 | F<sub>1</sub> | F<sub>2</sub> | F<sub>3</sub> | F<sub>4</sub> | F<sub>5</sub> | F<sub>6</sub>(S) | F<sub>7</sub> | F<sub>8</sub> | F<sub>9</sub> | F<sub>10</sub> | F<sub>11</sub> | F<sub>12</sub> | F<sub>13</sub> | F<sub>14</sub> | F<sub>15</sub> |
| S1 | 0.446 | 0.518 | 0.719 | 0.833 | 0.945 | 1.000 | 1.116 | 1.555 | 1.633 | 1.651 | 1.669 | 1.781 | 1.810 | 2.256 | 2.289 |
| S2 | 0.444 | 0.517 | 0.717 | 0.832 | 0.944 | 1.000 | 1.115 | 1.555 | 1.634 | 1.651 | 1.669 | 1.782 | 1.811 | 2.257 | 2.289 |
| S3 | 0.446 | 0.517 | 0.717 | 0.832 | 0.943 | 1.000 | 1.115 | 1.554 | 1.632 | 1.649 | 1.667 | 1.779 | 1.807 | 2.255 | 2.287 |
| S4 | 0.446 | 0.518 | 0.718 | 0.832 | 0.944 | 1.000 | 1.117 | 1.556 | 1.633 | 1.652 | 1.670 | 1.781 | 1.810 | 2.259 | 2.291 |
| S5 | 0.447 | 0.515 | 0.714 | 0.831 | 0.944 | 1.000 | 1.116 | 1.557 | 1.635 | 1.653 | 1.671 | 1.784 | 1.813 | 2.260 | 2.292 |
| S6 | 0.446 | 0.518 | 0.719 | 0.833 | 0.944 | 1.000 | 1.107 | 1.551 | 1.629 | 1.646 | 1.664 | 1.776 | 1.804 | 2.250 | 2.282 |
| S7 | 0.446 | 0.517 | 0.719 | 0.833 | 0.944 | 1.000 | 1.115 | 1.553 | 1.632 | 1.648 | 1.666 | 1.778 | 1.805 | 2.253 | 2.285 |
| S8 | 0.447 | 0.515 | 0.716 | 0.832 | 0.944 | 1.000 | 1.116 | 1.555 | 1.633 | 1.650 | 1.667 | 1.779 | 1.807 | 2.256 | 2.288 |
| S9 | 0.447 | 0.517 | 0.718 | 0.833 | 0.945 | 1.000 | 1.117 | 1.555 | 1.633 | 1.650 | 1.668 | 1.780 | 1.808 | 2.256 | 2.288 |
| S10 | 0.447 | 0.516 | 0.718 | 0.833 | 0.945 | 1.000 | 1.117 | 1.555 | 1.633 | 1.650 | 1.668 | 1.779 | 1.807 | 2.256 | 2.288 |
| S11 | 0.447 | 0.515 | 0.715 | 0.831 | 0.944 | 1.000 | 1.115 | 1.554 | 1.632 | 1.649 | 1.666 | 1.778 | 1.806 | 2.255 | 2.286 |
| 平均值 | 0.446 | 0.517 | 0.717 | 0.832 | 0.944 | 1.000 | 1.115 | 1.55 | 1.633 | 1.650 | 1.67 | 1.78 | 1.808 | 2.256 | 2.288 |
| RSD/％ | 0.20 | 0.23 | 0.23 | 0.095 | 0.064 | 0 | 025 | 0.10 | 0.092 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.15 | 0.12 | 0.12 |
表8 11批小花清风藤药材叶的15个特征峰的峰面积结果
| 序号 | F<sub>1</sub> | F<sub>2</sub> | F<sub>3</sub> | F<sub>4</sub> | F<sub>5</sub> | F<sub>6</sub>(S) | F<sub>7</sub> | F<sub>8</sub> | F<sub>9</sub> | F<sub>10</sub> | F<sub>11</sub> | F<sub>12</sub> | F<sub>13</sub> | F<sub>14</sub> | F<sub>15</sub> |
| S1 | 22.6681 | 81.4019 | 33.6046 | 6.3652 | 16.2135 | 17.3574 | 3.1195 | 1.5031 | 2.4676 | 8.1478 | 1.1191 | 12.8512 | 1.4358 | 2.4492 | 4.4361 |
| S2 | 5.1379 | 14.5497 | 9.5478 | 8.4082 | 5.9568 | 4.5198 | 0.4455 | 2.2973 | 4.3179 | 15.1276 | 1.7261 | 27.9482 | 24199 | 4.5620 | 8.3865 |
| S3 | 0.7236 | 25.3992 | 12.2883 | 6.7380 | 7.9613 | 5.2783 | 1.6378 | 2.7493 | 4.5661 | 17.8988 | 1.9498 | 30.4072 | 2.4274 | 2.8144 | 4.4816 |
| S4 | 1.5256 | 33.5166 | 5.3214 | 0.8443 | 7.0014 | 2.1980 | 1.2336 | 0.3022 | 0.6011 | 2.3721 | 0.3507 | 4.6980 | 0.4896 | 6.4887 | 27.8631 |
| S5 | 1.8281 | 49.4992 | 17.6173 | 3.0260 | 4.6972 | 1.6780 | 3.0343 | 0.4453 | 0.8111 | 2.5829 | 0.3698 | 4.6500 | 0.5193 | 4.0844 | 13.1361 |
| S6 | 15.8214 | 63.7139 | 38.5395 | 9.0725 | 7.5938 | 13.8495 | 2.7954 | 2.5737 | 4.0588 | 15.3862 | 2.0155 | 23.6898 | 3.5474 | 1.0008 | 1.0774 |
| S7 | 6.2345 | 37.3923 | 11.5335 | 3.5893 | 13.8555 | 8.1630 | 2.1910 | 4.3658 | 7.3410 | 22.1462 | 3.0973 | 32.1558 | 4.3356 | 0.4330 | 0.3257 |
| S8 | 4.5015 | 62.2667 | 16.1834 | 1.6681 | 13.0942 | 7.7243 | 0.4424 | 1.7186 | 3.1482 | 10.0092 | 1.3934 | 17.3711 | 2.6274 | 1.7391 | 1.6520 |
| S9 | 9.6455 | 44.9911 | 15.3760 | 4.8478 | 8.6056 | 10.5138 | 1.5522 | 2.0313 | 3.5999 | 11.9723 | 1.6653 | 19.6869 | 2.8670 | 0.9519 | 1.3684 |
| S10 | 3.6301 | 56.2180 | 17.5943 | 8.8428 | 4.5452 | 4.0078 | 3.2934 | 0.9361 | 1.9184 | 5.1264 | 0.7412 | 9.6621 | 1.4946 | 1.5410 | 1.9348 |
| S11 | 6.5610 | 30.3622 | 6.5568 | 6.1679 | 7.4684 | 6.9428 | 1.4685 | 1.8445 | 3.1080 | 11.7335 | 1.6628 | 19.4244 | 2.7588 | 1.7175 | 2.3523 |
表9 11批小花清风藤药材叶的15个特征峰的峰面积比值
| 序号 | F<sub>1</sub> | F<sub>2</sub> | F<sub>3</sub> | F<sub>4</sub> | F<sub>5</sub> | F<sub>6</sub>(S) | F<sub>7</sub> | F<sub>8</sub> | F<sub>9</sub> | F<sub>10</sub> | F<sub>11</sub> | F<sub>12</sub> | F<sub>13</sub> | F<sub>14</sub> | F<sub>15</sub> |
| S1 | 1.305 | 4.690 | 1.936 | 0.367 | 0.934 | 1.000 | 0.180 | 0.087 | 0.142 | 0.469 | 0.064 | 0.740 | 0.083 | 0.141 | 0.256 |
| S2 | 1.137 | 3.219 | 2.112 | 1.860 | 1.318 | 1.000 | 0.099 | 0.508 | 0.955 | 3.347 | 0.382 | 6.184 | 0.535 | 1.009 | 1.856 |
| S3 | 0.137 | 4.812 | 2.328 | 1.277 | 1.508 | 1.000 | 0.310 | 0.521 | 0.865 | 3.391 | 0.369 | 5.761 | 0.460 | 0.533 | 0.849 |
| S4 | 0.740 | 15.249 | 2.421 | 0.384 | 3.185 | 1.000 | 0.561 | 0.137 | 0.273 | 1.079 | 0.160 | 2.137 | 0.223 | 2.952 | 12.677 |
| \S5 | 1.089 | 29.499 | 10.499 | 1.803 | 2.799 | 1.000 | 1.808 | 0.265 | 0.483 | 1.539 | 0.220 | 2.771 | 0.309 | 2.434 | 7.828 |
| S6 | 1.142 | 4.600 | 2.783 | 0.655 | 0.548 | 1.000 | 0.202 | 0.186 | 0.293 | 1.111 | 0.146 | 1.711 | 0.256 | 0.072 | 0.078 |
| S7 | 0.764 | 4.581 | 1.413 | 0.440 | 1.697 | 1.000 | 0.268 | 0.535 | 0.899 | 2.713 | 0.379 | 3.939 | 0.531 | 0.053 | 0.040 |
| S8 | 0.583 | 8.061 | 2.095 | 0.216 | 1.695 | 1.000 | 0.057 | 0.222 | 0.408 | 1.296 | 0.180 | 2.249 | 0.340 | 0.225 | 0.214 |
| S9 | 0.917 | 4.279 | 1.462 | 0.461 | 0.819 | 1.000 | 0.148 | 0.193 | 0.342 | 1.139 | 0.158 | 1.872 | 0.273 | 0.091 | 0.130 |
| S10 | 0.906 | 14.027 | 4.390 | 2.206 | 1.134 | 1.000 | 0.822 | 0.234 | 0.479 | 1.279 | 0.185 | 2.411 | 0.373 | 0.385 | 0.483 |
| S11 | 0.945 | 4.373 | 0.944 | 0.888 | 1.076 | 1.000 | 0.212 | 0.266 | 0.448 | 1.690 | 0.239 | 2.799 | 0.397 | 0.247 | 0.339 |
| 平均值 | 0.879 | 8.854 | 2.944 | 0.960 | 1.519 | 1.003 | 0.424 | 0.287 | 0.508 | 1.858 | 0.226 | 2.961 | 0.344 | 0.740 | 2.25 |
| RSD/％ | 36.7 | 90.2 | 90.1 | 73.9 | 53.6 | 0 | 120.2 | 55.7 | 54.2 | 49.9 | 47.3 | 56.9 | 39.6 | 136.5 | 183.8 |
2.5.2相似度评价结果
将11批小花清风藤药材的HPLC图谱导入指纹图谱软件(2004A版)，设定S1为参照谱，采用多点校正，时间窗宽度为0.5，对照图谱生成方法为中位数法，建立指纹图谱见图6，生成的共有峰对照图谱见图7，5个特征成分的紫外吸收光谱图见8。相似度计算评价结果表明，各产地小花清风藤药材的指纹图谱相似度计算结果除了S9、S10和S11外，其他批次的指纹图谱相似度在0.80以上，说明不同产地的小花清风藤药材化学成分相对较一致，结果见表10。
表10相似度评价结果
2.6化学计量分析
仅从相似度差别上很难全面反应映不同批样品间的异同。故进一步采用SPSS16.0软件对不同批次小花清风藤药材指纹图谱的共有峰数据进行聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)。
2.6.1聚类分析(HCA)
采用SPSS 16.0统计分析软件，以***聚类法中的组间距离法、矢量余弦距离作为样品测度，对11批次小花清风藤药材的各峰面积标准化数据进行聚类分析，并绘制树状图，见图9。当判别条件距离为20时，大致分为三大类，Ⅰ类包括S4，S5，S10；Ⅱ类包括S1，S6；Ⅲ类包括S2，S3，S7，S8，S9，S11。当判别条件距离为5时，可分为九大类：云南省罗平县(S10)、贵州省镇宁县(S1)、贵州省兴义市(S11)、贵州省安龙县(S7)、广西省西林县(S9)、云南省师宗县(S8)的样品单独聚为一类，广西省田林县(S2)和贵州中医药大学引种(S3)号样品聚为一类，可见云、贵、广三省由于地势地貌、海拔气候等多个环境因素的影响，导致药材内在化学成分含量存在区别；贵州省册亨县坡妹镇(S6)单独聚为一类，S4与S5为贵州省册亨县的邻镇聚为一类，可见即便是同一产地也有个别批次药材质量存在差异；各批次样品之间的相关性与相似度分析结果较为一致。
2.6.2主成分分析(PCA)
为了更直接地评价15个共有成分对样品的分辨能力，以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据，采用SPSS16.0版软件对11批小花清风藤药材样品进行PCA分析，求出相关矩阵的特征值及其方差，见表11。以特征值＞1为提取标准，得到前3个因子的累计方差贡献率为87.375％。PCA碎石图见图10，率先提取出来的3个因子的坡度较为陡峭而后续形成的坡度较为平缓，故选择这3个因子为主要成分1、2、3。主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向。除了共有峰F7、F14、F15对主成分1成负相关，其余的均正相关，其中以F8～F13的贡献最大；共有峰F1～F7对主成分2成正相关，共有峰F8～F15对主成分2成负相关，其中F1～F3、F6和F7对主成分2贡献最大；除F3、F4、F7、F10和F12对主成分3成负相关，其余的均正相关，F5对主成分3的贡献最大，见表12。
表11特征值与方差贡献率
表12主成分载荷矩阵
对上述主成分载荷值进行计算，得出各主成分的线性模型：其中，Z1、Z2、Z3分别表示第1、2、3个主成分，Z代表结合3个主成分得到的综合主成分，X1～X15分别表示15个共有峰峰面积的标准化数据。将各样本数据代入上述模型后，得到各批次样本的主成分得分，见表13；S1的综合得分最高，质量最好，其次是S6和S7号批样品；并以样品的第1、2、3主成分得分做三维散点图，见图11，11批样品的分类结果与HCA结果较为一致。
Z1＝0.404X1+0.290X2+0.284X3+0.394X4+0.506X5+0.596X6-0.030X7+0.938X8+0.926X9+0.920X10+0.949X11+0.876X12+0.942X13-0.779X14-0.80X15；
Z2＝0.798X1+0.940X2+0.867X3+0.220X4+0.349X5+0.706X6+0.690X7-0.275X8-0.323X9-0.346X10-0.277X11-0.415X12-0.186X13-0.298X14-0.231X15；
Z3＝0.135X1+0.183X2-0.140X3-0.791X4+0.740X5+0.216X6-0.412X7+0.054X8+0.047X9-0.017X10+0.054X11-0.069X12+0.110X13+0.138X14+0.244X15；
Z＝1.337X1+1.413X2+1.011X3-0.177X4+1.595X5+1.518X6+0.248X7+0.717X8+0.650X9+0.557X10+0.726X11+0.329X12+0.866X13-0.939X14-0.787X15
表13样本主成分得分
3结论
本实验采用二极管阵列检测器，分别考察了220nm、254nm、270nm、360nm的检测波长，结果表明在360nm波长下能较好反映各成分的紫外吸收，色谱信息丰富且基线平稳，因此选择360nm；对色谱柱Phenomenex Synergi Hydro-RP 80A(250×4.6mm，5μm)、Phenomenex Kinetex-C18(100×4.6mm，2.6μm)、Thermo Accucore-C18(150×4.6mm，2.6μm)、Thermo Hyperil(250×4.6mm，5μm)进行分析比较，测定结果表明，Thermo Accucore-C18(150×4.6mm，2.6μm)色谱柱较其他三种色谱柱出峰较多，且分离度较好，故选择该柱进行指纹图谱分析；在流动相上分别对甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.1％冰乙酸水、甲醇-乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-乙腈-0.1％甲酸水、四氢呋喃-水、5％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、甲醇-5％四氢呋喃乙腈溶液-0.1％磷酸水溶液、10％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、20％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、40％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液等14种流动相***梯度洗脱分离情况进行试验比较，结果表明使用30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相时色谱峰分离效果最好，大部分色谱峰达到基线分离，且各色谱峰纯度较高；分别设置柱温为25℃、30℃和35℃，比较其分离效果，结果表明柱温为30℃时分离效果和色谱峰的对称性较好，故选择30℃。本实验对提取方法(超声、回流、冷浸)，提取溶剂(甲醇、乙醇)，提取溶剂的比例(50％、60％、70％、80％、90％)，料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)进行考察，综上确定“2.2”项供试品溶液的制备。
本发明建立5个黄酮类化学成分的小花清风藤药材指纹图谱鉴别方法，可较全面地反映该药材的内在品质。通过对得到的15个共有色谱峰依次运用相似度分析、聚类分析和主成分分析3种方法较全面地进行分析，结果显示样品间的共有峰相对保留时间差异较小，但峰面积却存在一定差异，表明不同产地小花清风藤药材所含化学成分较为一致；本发明为小花清风藤药材的质量评价建立了一套较为完善的科学体系，可作为小花清风藤药材基源鉴定和质量控制的科学依据。
以上试验表明，该建立的方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，本发明为完善小花清风藤药材的质量评价体系、药材基源鉴定和质量控制的提供了科学依据。
与现有技术相比，该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映小花清风藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的小花清风藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度和峰形好，柱效高。
附图说明
图1是专属性试验HPLC色谱叠加图；其中，A-70％乙醇溶液；B-混合对照品溶液；C-供试品溶液；
图2是完整性试验HPLC色谱叠加图；
图3是精密度试验HPLC色谱叠加图；
图4是重复性试验HPLC色谱叠加图；
图5是稳定性试验HPLC色谱叠加图；
图6是11批小花清风藤药材HPLC共有模式叠加图(时间窗宽度为0.5，中位数法)；
图7是小花清风藤药材HPLC对照指纹图谱；Ⅰ-混合对照品图谱；Ⅱ-共有峰对照指纹图谱；1-槲皮素-3-O-龙胆双糖苷；2-Camellianoside；3-Tsubakioside A；4-山奈酚-3-O-芸香糖苷；6-异鼠李素-3-O-芸香糖苷；
图8是供试品与混合对照溶液的紫外吸收光谱图；
图9是11批小花清风藤药材聚类分析树状图；
图10是主成分碎石图；
图11是11批小花清风藤药材主成分得分图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例：
一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素-3-O-龙胆双糖苷、Camellianoside、Tsubakioside A、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品，加70％乙醇溶液溶解，摇匀，制成槲皮素-3-O-龙胆双糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、Camellianoside质量浓度为0.250mg/mL、Tsubakioside A质量浓度为0.0675mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、异鼠李素-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0500mg/mL的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定小花清风藤粉末1g，置50mL具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15mL，称定重量，在功率为100W，频率为80Hz条件下超声提取60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得；
(3)指纹图谱建立的色谱条件：色谱柱：Thermo Accucore-C18，150×4.6mm，2.6μm；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液为A相，乙腈为B相，0.1％磷酸水溶液为C相；梯度洗脱，检测波长为360nm，流速为1mL/min，柱温30℃，进样量10μL；记录谱图得到小花清风藤药材的HPLC指纹图谱；梯度洗脱程序：0-5min：A(5％→12％)和B(3％→6％)；5-15min：A(12％→10％)和B(6％→8％)；15-20min：A(10％→20％)和B(8％→10％)；20-35min：A(20％→53％)和B(10％→28％)；35-45min：A(53％)和B(28％)；45-50min：A(53％→70％)和B(28％→30％)；50-60min：A(70％→65％)和B(30％→35％)。
所述15个共有峰中，1号峰为槲皮素-3-O-龙胆双糖苷，2号峰为Camellianoside，3号峰为Tsubakioside A，4号峰为山奈酚-3-O-芸香糖苷，6号峰为异鼠李素-3-O-芸香糖苷；
所述15个共有峰，以6号峰异鼠李素-3-O-芸香糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.444-0.447、0.515-0.518、0.714-0.719、0.831-0.833、0.943-0.945、1.000、1.107-1.117、1.551-1.557、1.629-1.635、1.646-1.653、1.664-1.671、1.776-1.784、1.804-1.813、2.250-2.260、2.282-2.292。
Claims (5)
1.一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素-3-O-龙胆双糖苷、Camellianoside、Tsubakioside A、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品，加70％乙醇溶液溶解，摇匀，制成槲皮素-3-O-龙胆双糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、Camellianoside质量浓度为0.250mg/mL、Tsubakioside A质量浓度为0.0675mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0625mg/mL、异鼠李素-3-O-芸香糖苷质量浓度为0.0500mg/mL的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定小花清风藤粉末，精密加70％乙醇溶液溶解，称定重量，超声提取，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得；
(3)指纹图谱建立的色谱条件：色谱柱：ThermoAccucore-C18，150×4.6mm，2.6μm；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液为A相，乙腈为B相，0.1％磷酸水溶液为C相；梯度洗脱，检测波长为360nm，流速为1mL/min，柱温30℃，进样量10μL；记录谱图得到小花清风藤药材的HPLC指纹图谱；梯度洗脱时，梯度洗脱程序是：0-5min：5％→12％的A和3％→6％的B；5-15min：12％→10％的A和6％→8％的B；15-20min：10％→20％的A和8％→10％的B；20-35min：20％→53％的A和10％→28％的B；35-45min：53％的A和28％的B；45-50min：53％→70％的A和28％→30％的B；50-60min：70％→65％的A和30％→35％的B；
(4)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次小花清风藤建立其HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有峰，这些共有峰构成了小花清风藤的指纹特征，建立了共有模式，作为小花清风藤药材的标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于：所述供试品溶液这样制备：精密称定小花清风藤粉末1g，置50mL具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15mL，称定重量，超声提取60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。
3.如权利要求1或2所述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于：超声提取时，功率为100W，频率为80Hz。
4.如权利要求1所述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于：所述15个共有峰中，1号峰为槲皮素-3-O-龙胆双糖苷，2号峰为Camellianoside，3号峰为TsubakiosideA，4号峰为山奈酚-3-O-芸香糖苷，6号峰为异鼠李素-3-O-芸香糖苷。
5.如权利要求1所述的小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于：所述15个共有峰，以6号峰异鼠李素-3-O-芸香糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.444-0.447、0.515-0.518、0.714-0.719、0.831-0.833、0.943-0.945、1.000、1.107-1.117、1.551-1.557、1.629-1.635、1.646-1.653、1.664-1.671、1.776-1.784、1.804-1.813、2.250-2.260、2.282-2.292。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910044474.9A CN109884222B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910044474.9A CN109884222B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109884222A CN109884222A (zh) | 2019-06-14 |
| CN109884222B true CN109884222B (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=66926200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910044474.9A Active CN109884222B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109884222B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112444578B (zh) * | 2020-11-27 | 2022-07-08 | 四川新绿色药业科技发展有限公司 | 一种木贼药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建及检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008038849A1 (en) * | 2006-09-29 | 2008-04-03 | Korea Institute Of Science And Technology | Pharmaceutical composition comprising an extract from opuntia ficus-indica |
| CN101690756A (zh) * | 2009-08-28 | 2010-04-07 | 贵州百灵企业集团制药股份有限公司 | 胆炎康胶囊的检测方法 |
| WO2010143058A1 (en) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Generex Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the prevention and treatment of heart failure |
| CN104597152A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-05-06 | 上海现代中医药股份有限公司 | 一种青风藤指纹图谱的测定方法 |
-
2019
- 2019-01-17 CN CN201910044474.9A patent/CN109884222B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008038849A1 (en) * | 2006-09-29 | 2008-04-03 | Korea Institute Of Science And Technology | Pharmaceutical composition comprising an extract from opuntia ficus-indica |
| WO2010143058A1 (en) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Generex Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the prevention and treatment of heart failure |
| CN101690756A (zh) * | 2009-08-28 | 2010-04-07 | 贵州百灵企业集团制药股份有限公司 | 胆炎康胶囊的检测方法 |
| CN104597152A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-05-06 | 上海现代中医药股份有限公司 | 一种青风藤指纹图谱的测定方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Identification of Botanical Biomarkers in Argentinean Diplotaxis Honeys: Flavonoids and Glucosinolates;PILAR TRUCHADO等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20101231;第58卷;第12678-12685页 * |
| JOSÉMARÍA FUENTES-ALVENTOSA等.Identification of Flavonoid Diglycosides in Several Genotypes of Asparagus from the Huétor-Tájar Population Variety.《Journal of Agricultural Food Chemistry》.2007,第55卷 * |
| 高效液相法同时测定银杏叶中11种成分的含量;吕金丽等;《中国中药杂志》;20170301(第05期);第931-935页 * |
| 高效液相色谱法测定小花清风藤中槲皮素的含量;刘易蓉等;《贵州医药》;20060412(第04期);第363-364页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109884222A (zh) | 2019-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107356691B (zh) | 建曲指纹图谱的检测方法 | |
| CN110702813B (zh) | 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法 | |
| CN103149300A (zh) | 黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱 | |
| Kim et al. | Chemical fingerprinting of Codonopsis pilosula and simultaneous analysis of its major components by HPLC–UV | |
| CN115060822B (zh) | 基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法 | |
| CN107727754B (zh) | 一种小金制剂的hplc指纹图谱检测方法 | |
| Liu et al. | Chemometric analysis based on HPLC multi-wavelength fingerprints for prediction of antioxidant components in Turpiniae Folium | |
| CN110297060B (zh) | 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 | |
| Li et al. | Metabolic discrimination of different Rhodiola species using 1H-NMR and GEP combinational chemometrics | |
| CN109884222B (zh) | 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法 | |
| CN107367567A (zh) | 芪枣口服液的指纹图谱构建及其质量检测方法 | |
| CN103869019A (zh) | 一种凤冈锌硒茶的hplc指纹图谱的建立方法 | |
| CN114152705A (zh) | 苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法 | |
| CN112710765A (zh) | 一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用 | |
| CN108254470A (zh) | 地黄中糖类成分的同时测定及其指纹图谱构建方法 | |
| Liang et al. | Fingerprint analysis of Hibiscus mutabilis L. leaves based on ultra performance liquid chromatography with photodiode array detector combined with similarity analysis and hierarchical clustering analysis methods | |
| Chunnian et al. | Quick comparison of Radix Paeonia Alba, Radix Paeonia Rubra, and Cortex Moutan by high performance liquid chromatography coupled with monolithic columns and their chemical pattern recognition | |
| CN111948330A (zh) | 仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法 | |
| CN108918696B (zh) | 一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法 | |
| CN113917009B (zh) | 北柴胡非皂苷类成分hplc指纹图谱的构建方法及应用 | |
| CN102119997A (zh) | 川麦冬hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 | |
| CN109856254B (zh) | 龙眼叶乙酸乙酯部位hplc指纹图谱的建立方法 | |
| CN113341031A (zh) | 鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法 | |
| CN106483220B (zh) | 一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法 | |
| CN113267582B (zh) | 一种斯赤列指纹图谱的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 550025 Dongqing South Road, Daxuecheng, Huaxi District, Guiyang City, Guizhou Province Applicant after: Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Address before: 550025 Dongqing South Road, Daxuecheng, Huaxi District, Guiyang City, Guizhou Province Applicant before: GUIYANG College OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |