CN109880182A - 二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料技术领域，公开了一种双醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法和应用。本发明通过高碘酸盐氧化羧甲基纤维素成功地制备了二醛羧甲基纤维素(DCMC)；作为一种高效的交联剂，DCMC通过席夫碱反应使丝胶蛋白中的‑NH₂与DCMC中的‑CHO之间形成席夫碱，从而与丝胶蛋白形成广泛的交联，进而提高了丝胶膜的机械性能和稳定性。DCMC/SS复合膜表现出优异的亲水性，稳定性，血液相容性和细胞相容性；本发明将大大推进基于丝胶蛋白的生物材料在诸如伤口敷料，组织工程和再生医学等领域中的应用。

Description

二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法和应用。

背景技术

家蚕产生的丝胶蛋白是世界上最丰富的天然生物大分子之一，主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成。丝素蛋白作为优异的生物材料在组织工程中应用广泛。丝胶蛋白(SS)是一种球状蛋白质，在蚕丝中主要以“胶水”的形式将两股丝素蛋白结合在一起形成稳定的丝素-丝胶蛋白二元结构。丝胶由十几种氨基酸组成，其中大多数具有较强的极性侧链基团如羧基、羟基和氨基，因此容易与其他活性基团交联。丝胶中丝氨酸含量较高(32.3％)，赋予其高亲水性。丝胶保持部分去折叠状态，无规卷曲含量为63％。丝胶作为一种天然蛋白质，具有良好的生物相容性，低免疫原性，生物降解性，促细胞粘附和增殖活性。丝胶本身可以形成水凝胶、薄膜和海绵，是一种在组织工程和再生医学领域有广阔前景的生物材料。然而，丝胶蛋白在生物医学应用中的主要挑战是其无定形结构和由此造成的脆弱的机械性能。丝胶材料的力学性能不能满足应用要求，空气干燥后的丝胶膜易脆裂，易溶于生理盐水。因此，进一步改善丝胶蛋白的机械性能和稳定性对拓展其在生物医学材料中的应用十分必要。

迄今为止，学者们已经利用各种方法来改善丝胶蛋白的性质，包括使其与天然纤维，高分子聚合物和纳米材料交联、共混和共聚。当前，生物可降解材料领域中的主要材料是各种多糖及其衍生物。水溶性的羧甲基纤维素(CMC)具有优异的生物相容性、生物降解性以及清除活性氧(ROS)的能力。CMC是自然界中含量最丰富的多糖之一，经济、可再生、环保。二醛多糖是一种由天然多糖衍生的交联剂。与甲醛和戊二醛相比，二醛多糖中纤维素较长的侧链降低了其对细胞的通透性，因此具有优异的生物相容性。为了提高CMC的反应性，有学者用高碘酸盐氧化羧甲基纤维素以获得高反应活性的二醛羧甲基纤维素(DCMC)。通过高碘酸盐氧化，CMC可以特异性切开1,4-葡聚糖的C2-C3键，使之产生具有两个醛基的开环产物。两个醛基的出现使DCMC成为众多纤维素基生物材料中一种优异的交联剂。DCMC中的醛基可通过-C＝N-键(Schiff碱，即甲亚胺，R-CH＝NR'，R'≠H)与赖氨酸的ε-氨基和精氨酸的ζ-氨基反应，以改善丝胶的性质。

综上所述，现有技术存在的问题是：丝胶蛋白在生物医学应用中的主要挑战是丝胶蛋白的无定型结构导致其机械性能差；丝胶材料的力学性能不能满足应用要求，空气干燥后丝胶膜易脆裂，易溶于生理盐水，这些缺陷极大限制了丝胶膜在伤口敷料等领域的应用。

解决上述技术问题的难度和意义：丝胶作为一种天然生物大分子，如何在保持良好的生物相容性和可降解性的同时改善其机械性能差，易溶解于水的不足，对于扩展丝胶蛋白在组织工程和再生医学等领域的应用具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法和应用。

本发明是这样实现的，一种二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法，所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法包括以下步骤：

第一步，将0.048g二醛羧甲基纤维素DCMC溶解在2mL 60℃的水中，得到24％w/v的溶液；

第二步，在60℃下将8mL丝胶溶液3.75％，w/v加入到DCMC溶液中并持续搅拌1小时；

第三步，将混合物转移到培养皿中并在37℃下风干制得DCMC/SS膜。

进一步，所述第一步的二醛羧甲基纤维素的制备方法包括：将CMC 1g和高碘酸钠0.98g溶解在30mL水中，用盐酸HCl调节混合溶液pH至3.5；然后移至用锡箔纸包裹的离心管中，并在40℃下孵育6小时；将孵育后的溶液取出加入4-7倍体积的乙醇使得到的DCMC沉淀，依次用水和乙醇洗涤三次后，将沉淀的DCMC风干并储存在-4℃。

进一步，所述二醛羧甲基纤维素中醛含量的测定方法包括：将二醛羧甲基纤维素DCMC粉末0.5g溶解在25mL水中，然后用氢氧化钠NaOH调节至pH5.0，然后将盐酸羟胺H₂NOH·HCl 0.05g/mL，pH 5.0,20mL加入到DCMC溶液中，在40℃下搅拌4小时；然后用1.0mol/LNaOH滴定释放的盐酸，将NaOH消耗体积记录为V_d，以同等条件滴定CMC，并将消耗的氢氧化钠体积记录为V_c，DCMC中的醛基含量AC通过下式计算：

C_NaOH＝1.0mol/L，m是DCMC的质量，以g计；242.16是DCMC中重复单元的分子量，每个测试重复三次。

进一步，所述第一步的丝胶溶液的制备方法包括：将蚕茧剪成碎片，在0.1MPa、120℃下煮沸20分钟，将丝胶溶解到水中，通过过滤除去丝胶蛋白包裹的丝素蛋白，将得到的丝胶蛋白溶液冻干并储存在-20℃。

本发明的另一目的在于提供一种由所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法制备的二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜。

本发明的另一目的在于提供一种所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜在生物医学中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的检测方法，所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的检测方法包括：

(1)使用Thermo Fisher Nicolet iz10在25℃下记录CMC，DCMC和DCMC/SS复合膜的FT-IR光谱，波长扫描范围为850至4000cm^-1，分辨率为2cm^-1，每个样品扫描16次；

(2)通过JEOL扫描电子显微镜JCM-5000观测膜的表面形态；使用双面胶带将样品固定在铝柱台上，并在镀金120s后放大10000倍，以15kV的加速电压拍摄SEM图像；

(3)测量DCMC/SS复合薄膜的拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量，实验参照D828-97标准方法；首先测量膜的厚度以进行机械性能分析，将每组薄膜分别制备得到八个矩形条，宽10mm，长25mm，夹具之间的标距长度为15mm，牵引速度为2mm/min，拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量分别由相应的应力-应变曲线计算获得；

(4)溶胀性能：将干膜裁剪成20mm×20mm的矩形条，称重记为W₀，然后将膜浸入10mL水中；以12小时为时间间隔，测量3个时刻点，每个时刻点测量时，将膜取出并除去膜表面多余的水后，称重记为W_S，膜的溶胀比SR计算如下：

(5)润湿性：首先，将矩形DCMC/SS膜20mm×20mm，长×宽放置在样品平台上；然后，用精密注射器将一滴水5μL滴于膜表面上；最后，使用krüss液滴形状分析软件调整基线并测量液滴边界切线之间的左右接触角，每个薄膜测试五次，所有测试均在23±2℃和50±3％的相对湿度下进行；

(6)水溶性：将膜切成20mm×20mm的矩形条，并在65℃下干燥至恒重W_sol，然后浸入10mL PBS缓冲液pH 4.0,7.4,10.0的6孔细胞板中，密封板孔，在不同时间间隔，取出膜，洗涤，干燥并称重W₁，样品的总可溶物质计算如下：

每个膜测试三次，取平均值用于计算；

(7)热重分析：使用热重分析仪评估DCMC/SS膜的热稳定性，在25℃-800℃，氮气保护下以10℃/min的加热速率进行实验，以避免热氧化反应；

(8)溶血试验：从健康无疾病的兔子体内收集血液，用枸橼酸葡萄糖液处理以进行抗凝血实验，以800rpm/min离心血液，收集红细胞沉淀并重悬于10mL PBS缓冲液pH 7.4中，将膜15mm×15mm浸入无菌PBS缓冲液pH 7.4中，37℃下孵育30分钟后，将处理过的薄膜浸没在红细胞重悬液中，并在37℃下孵育1小时；然后，将样品以1,000rpm/min离心5分钟，最后用分光光度计读取上清液在540nm处吸光度值，所有样品测试3次，将水和PBS分别作为阳性P和阴性N对照，溶血率根据以下公式计算：

(9)细胞相容性：将小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和5％CO₂的Dulbecco's改良Eagle培养基DMEM中于37℃，95％相对湿度下培养，将圆形无菌DCMC膜置于96孔板底部，再将NIH3T3细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种在96孔板中；24小时后，向每孔中加入10μL CCK8溶液，然后将细胞在37℃下培养3小时；最后，用Glomax MultiDetectionSystem在450nm处测定溶液的吸光度，每组内的细胞活力表示为处理组细胞吸光度与未处理细胞吸光度的百分比；对于每个实验测试三个样品；此外，通过LIVE/DEAD染色评估DCMC/SS膜的细胞毒性，以同上的方法铺板24小时后，将细胞与染色液在37℃下孵育15分钟，然后在Olympus荧光显微镜IX71观察，每个样品测试三次。

本发明的优点及积极效果为：本发明通过高碘酸盐氧化羧甲基纤维素成功地制备了二醛羧甲基纤维素(DCMC)；作为一种高效的交联剂，DCMC通过席夫碱反应使丝胶蛋白中的-NH₂与DCMC中的-CHO之间形成席夫碱，从而使丝胶蛋白与DCMC形成复合结构，提高丝胶的机械性能和稳定性。DCMC/SS复合膜表现出优异的亲水性、稳定性、血液相容性和细胞相容性。本发明将大大推进基于丝胶蛋白的生物材料在诸如伤口敷料、组织工程和再生医学等领域中的应用。

附图说明

图1是本发明实施提供的二醛羧甲基纤维素与丝胶蛋白交联剂的测定方法流程图。

图2是本发明实施提供的DCMC/SS复合薄膜的制备和生物相容性试验示意图。

图3是本发明实施提供的CMC和DCMC(A)和DCMC/SS复合膜(B)的FT-IR光谱图。

图4是本发明实施提供的不同DCMC比率(g/g)的DCMC/SS复合薄膜的SEM表面形貌：(A)4.0％，(B)8.0％，(C)12.0％，(D)16.0％。

图5是本发明实施提供的不同DCMC含量DCMC/SS复合薄膜的力学性能：(A)应力-应变曲线；(B)抗拉强度；(C)断裂伸长率和(D)杨氏模量。

图6是本发明实施提供的DCMC/SS薄膜的水溶性和在水中的溶胀性。(A)溶胀比；(B)DCMC/SS薄膜的水溶性；不同膜的水接触角D4(C)，D8(D)，D12(E)，D16(F)。

图7是本发明实施提供的DCMC/SS复合薄膜的热稳定性；(A)TGA曲线，(B)DTG曲线。

图8是本发明实施提供的血液相容性和细胞相容性测定；(A)DCMC/SS薄膜的溶血率；(B)生长在复合膜上的NIH3T3细胞的存活率；(C)LIVE/DEAD染色测定以评估DCMC/SS复合膜对NIH3T3细胞的毒性。比例尺，100μm。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的二醛羧甲基纤维素与丝胶蛋白交联剂的测定方法包括以下步骤：

S101：将0.048g二醛羧甲基纤维素DCMC溶解在2mL 60℃的水中，得到24％w/v的溶液；

S102：在60℃下将8mL丝胶溶液3.75％，w/v加入到DCMC溶液中并持续搅拌1小时；

S103：将混合物转移到培养皿中并在37℃下风干制得DCMC/SS膜。

本发明提供的DCMC/SS复合膜检测方法如下：

(1)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

使用Thermo FisherNicolet iz10(MA，USA)在25℃下记录CMC，DCMC和DCMC/SS复合膜的FT-IR光谱。从850至4000cm^-1收集光谱，分辨率为2cm^-1。每个样品扫描16次。

(2)扫描电子显微镜(SEM)

通过JEOL扫描电子显微镜JCM-5000(Tokyo，Japan)观测膜的表面形态。使用双面胶带将样品安装在铝柱台上，并在镀金120s后放大10000倍，以15kV的加速电压拍摄SEM图像。

(3)机械性能

测量DCMC/SS复合薄膜的拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量，实验参照D828-97标准方法进行。首先测量膜的厚度以进行机械性能分析。将每组薄膜分别制备得八个矩形条(宽10mm，长25mm)。夹具之间的标距长度为15mm，牵引速度为2mm/min。拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量分别由相应的应力-应变曲线最终确定。

(4)溶胀性能

DCMC/SS薄膜的溶胀性能参照进行测量。将干膜裁剪20mm×20mm的矩形条，称重记为W₀，然后将膜浸入10mL水中。以12小时为时间间隔，测量3个时刻点。每个时刻点测量时，将膜取出并除去膜表面多余的水后，称重记为W_S。膜的溶胀比(SR)计算如下：

(5)润湿性

首先，将矩形DCMC/SS膜(30mm×20mm，长×宽)放置在样品平台上。然后，用精密注射器将一滴水(5μL)滴于膜表面上。最后，使用krüss液滴形状分析软件调整基线并测量液滴边界切线之间的左右接触角。每个薄膜测量五次。所有测试均在23±2℃和50±3％的相对湿度下进行。

(6)水溶性

本发明的方法测量复合膜的总可溶物质(TSM)以研究DCMC/SS复合膜的水溶性。将膜切成20mm×20mm的矩形条，并在65℃下干燥至恒重(Wsol)，然后浸入10mL PBS缓冲液(pH4.0,7.4,10.0)的6孔细胞板中。密封板孔以防止水分蒸发。在不同的时间间隔，取出膜，洗涤，干燥并称重(W1)。样品的总可溶物质计算如下：

每次试验重复三次，取平均值计算。

(7)热重分析(TGA)

本发明使用TA公司的TGA-Q50(DE，USA)热重分析仪评估DCMC/SS膜的热稳定性。在25℃-800℃，氮气氛下以10℃/min的加热速率进行实验，以避免热氧化反应。

(8)溶血试验

实验在体外进行溶血测定以检查DCMC/SS膜的血液相容性。从健康无疾病的兔子体内收集血液，用枸橼酸葡萄糖液处理进行抗凝血实验。以800rpm/min离心血液，收集红细胞沉淀并重悬于10mL PBS缓冲液(pH 7.4)中。将膜(15mm×15mm)浸入无菌PBS缓冲液(pH7.4)中，37℃下孵育30分钟后，将处理过的薄膜浸没在红细胞重悬液中，并在37℃下孵育1小时。然后，将样品以1,000rpm/min离心5分钟，最后用分光光度计读取上清液在540nm处吸光度。所有样品测试3次。将水和PBS分别作为阳性(P)和阴性(N)对照。溶血率根据以下公式计算：

(9)细胞相容性

将小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和5％CO₂的Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中于37℃，95％相对湿度下培养。将圆形无菌DCMC膜(直径＝10mm)置于96孔板底部，再将NIH3T3细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种在96孔板中。24小时后，向每孔中加入10μL CCK8溶液。然后将细胞在37℃下孵育3小时。最后，用Glomax MultiDetection System(Promega，USA)在450nm测定溶液的吸光度。每组内的细胞活力表示为处理组细胞吸光度与未处理细胞吸光度的百分比。每个实验测试三个样品。此外，通过LIVE/DEAD染色评估DCMC/SS膜的细胞毒性。以同上的方法铺板24小时后，将细胞与染色液在37℃下孵育15分钟，然后在Olympus荧光显微镜IX71(Tokyo，Japan)上观察。每个样品测试三次。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例：

1、材料和方法

1.1化学品和试剂选取；

家蚕茧由中国西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。CMC(Mw90,000Da)和盐酸羟胺购自Aladdin(中国上海)。高碘酸钠购自Sangon(中国上海)。超纯水通过Millipore Milli-QPlus***(MA，USA)制备并用于后续实验。其他所有化学试剂均为分析级。

1.2二醛羧甲基纤维素(DCMC)的制备；

将CMC(1g)和高碘酸钠(0.98g)溶解在30mL水中。用盐酸(HCl)调节混合溶液pH至3.5，然后移至用锡箔纸包裹的离心管中，并在40℃下孵育6小时。将孵育后的溶液取出加入4-7倍体积的乙醇使得到的DCMC沉淀。依次用水和乙醇洗涤三次后，将沉淀的DCMC风干并储存在-4℃。

1.3醛含量的测定；

将DCMC粉末(0.5g)溶解在25mL水中，然后用氢氧化钠(NaOH)调节至pH 5.0。然后将盐酸羟胺(H₂NOH·HCl)(0.05g/mL，pH 5.0,20mL)加入到DCMC溶液中，在40℃下搅拌4小时，然后用1.0mol/L NaOH滴定释放的盐酸。将NaOH消耗体积记录为V_d。以同等条件滴定CMC，并将消耗的氢氧化钠体积记录为V_c。DCMC中的醛基含量(AC)可通过下式计算：

当C_NaOH＝1.0mol/L时，m是DCMC的质量，以g计。242.16为DCMC中重复单元的分子量。每个测试重复三次。

1.4丝胶蛋白的制备；

将蚕茧剪成碎片，然后在0.1MPa、120℃下煮沸20分钟，以将丝胶蛋白溶解到水中。通过过滤除去丝胶蛋白包裹的丝素蛋白。将得到的丝胶蛋白溶液冻干并储存在-20℃。

1.5DCMC/SS复合薄膜的制备。

DCMC/SS复合膜的制备简要描述如下。首先，分别将0.012g,0.024g,0.036g，0.048g DCMC溶解在2mL 60℃的水中，得到6％，12％，18％和24％(w/v)的溶液。然后，在60℃下将8mL丝胶溶液(3.75％，w/v)加入到DCMC溶液中并持续搅拌1小时。最后，将混合物转移到培养皿中并在37℃下风干制得DCMC/SS膜，记为Dx，其中x分别对应于使用的DCMC的质量与丝胶质量的百分比。在测试之前，将所得复合膜储存在23±2℃和50±3％相对湿度下。

1.6傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

本发明使用Thermo FisherNicolet iz10(MA，USA)在25℃下记录CMC，DCMC和DCMC/SS复合膜的FT-IR光谱。从850至4000cm^-1收集光谱，分辨率为2cm^-1。每个样品扫描16次。

1.7扫描电子显微镜(SEM)

通过JEOL扫描电子显微镜JCM-5000(Tokyo，Japan)观测膜的表面形态。使用双面胶带将样品安装在铝柱台上，并在镀金120s后放大10000倍，以15kV的加速电压拍摄SEM图像。

1.8力学性能

测量DCMC/SS复合薄膜的拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量，实验参照D828-97标准方法进行。首先测量膜的厚度以进行机械性能分析。将每组薄膜分别制备得八个矩形条(宽10mm，长25mm)。夹具之间的标距长度为15mm，牵引速度为2mm/min。拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量分别由相应的应力-应变曲线最终确定。

1.9溶胀性能

DCMC/SS薄膜的溶胀性能进行测量。将干膜裁剪20mm×20mm的矩形条，称重记为W₀，然后将膜浸入10mL水中。以12小时为时间间隔，测量3个时刻点。每个时刻点测量时，将膜取出并除去膜表面多余的水后，称重记为W_S。膜的溶胀比(SR)计算如下：

1.10润湿性

首先，将矩形DCMC/SS膜(30mm×20mm，长×宽)放置在样品平台上。然后，用精密注射器将一滴水(5μL)滴于膜表面上。最后，使用krüss液滴形状分析软件调整基线并测量液滴边界切线之间的左右接触角。每个薄膜测量五次。所有测试均在23±2℃和50±3％的相对湿度下进行。

1.11水溶性

本发明测量复合膜的总可溶物质(TSM)以研究DCMC/SS复合膜的水溶性。将膜切成20mm×20mm的矩形条，并在65℃下干燥至恒重(Wsol)，然后浸入10mLPBS缓冲液(pH 4.0,7.4,10.0)的6孔细胞板中。密封板孔以防止水分蒸发。以不同的时间间隔，取出膜，洗涤，干燥并称重(W1)。样品的总可溶物质计算如下：

每个膜测试三次，平均值用于计算。

1.12热重分析(TGA)

本发明使用TA公司的TGA-Q50(DE，USA)热重分析仪评估DCMC/SS膜的热稳定性。在25℃-800℃，氮气氛下以10℃/min的加热速率进行实验，以避免热氧化反应。

1.13溶血试验

本发明在体外进行溶血测定以检查DCMC/SS膜的血液相容性。从健康无疾病的兔子体内收集血液，用枸橼酸葡萄糖液处理进行抗凝血实验。以800rpm/min离心血液，收集红细胞沉淀并重悬于10mL PBS缓冲液(pH 7.4)中。将膜(15mm×15mm)浸入无菌PBS缓冲液(pH7.4)中，37℃下孵育30分钟后，将处理过的薄膜浸没在红细胞重悬液中，并在37℃下孵育1小时。然后，将样品以1,000rpm/min离心5分钟，最后用分光光度计读取上清液在540nm处吸光度。所有样品测试3次。将水和PBS分别作为阳性(P)和阴性(N)对照。溶血率根据以下公式计算：

1.14细胞相容性

将小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和5％CO₂的Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中于37℃，95％相对湿度下培养。将圆形无菌DCMC膜(直径＝10mm)置于96孔板底部，再将NIH3T3细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种在96孔板中。24小时后，向每孔中加入10μL CCK8溶液。然后将细胞在37℃下孵育3小时。最后，用Glomax MultiDetection System(Promega，USA)在450nm测定溶液的吸光度。每组内的细胞活力表示为处理组细胞吸光度与未处理细胞吸光度的百分比。对于每个实验，测试至少三个样品。此外，通过LIVE/DEAD染色评估DCMC/SS膜的细胞毒性。以同上的方法铺板24小时后，将细胞与染色液在37℃下孵育15分钟，然后在Olympus荧光显微镜IX71(Tokyo，Japan)上观察。每个样品测试三次。

2、结果

为了改善丝胶蛋白固有的脆性并扩展其在生物材料中的应用，开发了一种DCMC交联丝胶蛋白的策略，以增强丝胶蛋白膜的机械性能。丝胶蛋白来自于蚕丝。通过高碘酸盐氧化CMC制备DCMC。通过席夫碱反应将丝胶与DCMC交联，得到DCMC/SS复合膜，并进一步测试了DCMC/SS薄膜的溶血性和细胞相容性，证实复合膜具有生物医学应用的潜能。DCMC/SS薄膜的制备及生物相容性测试如图2所示。

2.1 FT-IR光谱

本发明测量了DCMC和DCMC/SS薄膜的FT-IR光谱。在DCMC的FT-IR光谱中出现了位于1732cm^-1的新谱带(图3A)，其对应于醛基羰基的C＝O振动。在CMC和DCMC薄膜的FT-IR光谱中，于892cm^-1处观察到醛基与相邻羟基之间的半缩醛键振动。如图3B所示，在所有FT-IR光谱中出现3278,3080,1620,1516和1240cm^-1处的五个条带，分别对应于丝胶蛋白的酰胺A，B，I，II和III。酰胺I，II和III带通常与C＝O伸缩振动，C-N伸缩和N-H弯曲振动的组合以及N-H与C-N伸缩振动的组合相关。DCMC膜中的酰胺B，I，II和III带几乎没有变化，而酰胺A带与丝胶的酰胺A带相比转移到更低波数(图3B)，表明DCMC和丝胶之间形成了氢键相互作用。值得注意的是，随着DCMC含量的增加，酰胺A带不断向低波数移动。然而，对于1660cm^-1处C＝N(席夫碱)振动带的消失，可能是被酰胺I带掩盖所致。

2.2 SEM

用SEM评估DCMC和丝胶复合膜的表观形貌。图4A显示D4膜表面较为光滑且均一，尽管在其表面出现了一些颗粒但数量稀少。随着DCMC含量的增加，在DCMC/SS薄膜表面上观察到越来越多的微小斑点(图4B-D)，这些电镜下尺寸细微的小斑点为与丝胶膜交联的DCMC。D16薄膜的表面则呈现出大量斑点和粗糙度增加，表明DCMC与丝胶蛋白之间形成了良好的交联。

2.3 DCMC/SS复合薄膜的力学性能

包括应力-应变曲线，拉伸强度，断裂伸长率和DCMC/SS复合薄膜的杨氏模量的机械性能如图5所示。由于含有大量的无规卷曲结构，丝胶表现得像无定形材料。丝胶薄膜在干燥状态下非常脆弱。D4复合薄膜具有最高的断裂伸长率，最低的拉伸强度和杨氏模量。随着DCMC含量的增加，复合膜的断裂伸长率降低，而拉伸强度和杨氏模量增加。D12的拉伸强度为41.02±1.110MPa，这在所有测试薄膜中最高。与D12相比，D16的抗拉强度下降，这可能是由于局部应力集中对膜造成的影响，导致实际断裂强度低于理论值。使用聚乙烯醇(PVA)与丝胶蛋白混合以改善丝胶蛋白的机械性能。然而，由于PVA和丝胶蛋白之间通过氢键而不是像Schiff碱这样的共价键与丝胶结合，因此丝胶膜的机械性能的改善是有限的。结果表明，DCMC的醛基可以与丝胶的氨基形成共价键，提高了DCMC/SS复合膜的机械性能。

2.4溶胀行为和水溶性

实验结果显示复合膜的溶胀比约为130％(图6A)，表明交联后的复合膜同样具有优异的亲水性。12小时后，膜的溶胀率几乎没有变化，因为膜的总可及表面已被水分子完全饱和。注意到D4在给定时间点具有最高的溶胀比。在将DCMC含量从4％增加到16％的同时，溶胀比逐渐降低。DCMC/SS薄膜的溶胀率取决于亲水性和交联度。丝胶蛋白和DCMC之间的交联减少了它与水分子的相互作用并阻止了丝胶蛋白侧链的运动，导致溶胀比的降低。

复合膜的水溶性主要受亲水-疏水相互作用影响。测量水溶性以分析在不同pH条件下复合膜的溶失行为(图6B)。结果表明，丝胶蛋白和DCMC之间的交联改善了丝胶的稳定性。在中性环境中，薄膜的总可溶物质(TSM)小于3％，表明复合薄膜具有良好的稳定性。在pH 4和pH 10下TSM的增加可能是由于在这些条件下膜的电荷增加。TSM随着DCMC含量的增加而降低，表明DCMC与丝胶的交联有效地增强了丝胶的稳定性。

2.5润湿性测量

固体表面的润湿性通常通过杨氏方程表征薄膜的水接触角。结果显示D4，D8，D12，D16薄膜的水接触角在45°和80.6°之间(图6C-F)，证实这些复合薄膜是亲水的。薄膜表面的亲水基团是影响水接触角的关键因素。随着DCMC含量的增加，膜的水接触角逐渐增大，表明席夫碱反应消耗了膜表面上的亲水基团，导致复合膜的润湿性降低。

2.6 TGA

利用TGA表征DCMC/SS复合膜的热稳定性。所有薄膜在25-700℃的温度范围内表现出类似的趋势，具有三个主要的热降解阶段(图7A)。质量损失的第一阶段发生在25-220℃，反映了薄膜吸附的水的蒸发。第二阶段(220-310℃)的质量损失是由于丝胶蛋白和DCMC的侧链的降解造成。在310-550℃发生了显著的质量损失，这可能与丝胶蛋白的主链基团的分解和DCMC的分解有关。结果表明，在经历第二阶段后，膜的质量损失增加至60％。与机械性能类似，几乎在每个特定温度下，DCMC含量越高，膜的剩余质量越多。二阶导数(DTG)分析进一步证实了上述观察结果(图7B)。结果表明，DCMC与丝胶的交联延缓了DCMC/SS复合膜的热降解，提高了丝胶的热稳定性。

2.7血液相容性

本发明通过测量复合膜与红细胞孵育后的溶血率评估DCMC/SS膜的血液相容性。本发明评估血液相容性。根据医疗器械标准，复合薄膜的溶血率不应超过5％。结果表明，D4，D8，D12和D16薄膜的溶血率极低(<2.5％)(图8A)，表明DCMC/SS薄膜几乎不影响红细胞膜的稳定性。随着DCMC含量的增加，复合膜的溶血率逐渐降低，这可能是由于DCMC交联导致丝胶蛋白表面活性氨基(-NH₂)含量降低所致。因此，DCMC/SS复合膜具有优异的血液相容性，适于生物医学应用。

2.8细胞相容性

通过将NIH3T3细胞接种在复合膜上，24小时后评估DCMC/SS膜的细胞毒性。D4，D8，D12，D16膜和对照之间的细胞存活率没有显著的差异(图8B)，表明DCMC/SS复合膜对NIH3T3细胞具有优异的细胞相容性。

将NIH3T3细胞接种于复合膜上，24小时后进行LIVE/DEAD染色。在荧光显微镜图像中，活细胞染成绿色，而死细胞染成红色。结果显示，在D4，D8，D12，D16膜存在下，大多数细胞被染成绿色。与对照组相比，实验组中的细胞无明显的差异(图8C)，表明DCMC/SS膜对NIH3T3细胞具有优异的细胞相容性，是一种良好的生物交联剂，而甲醛和戊二醛则具有部分细胞毒性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法，其特征在于，所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法包括以下步骤：

第一步，将0.048g二醛羧甲基纤维素DCMC溶解在2mL 60℃的水中，得到24％w/v的溶液；

第二步，在60℃下将8mL丝胶溶液3.75％，w/v加入到DCMC溶液中并持续搅拌1小时；

第三步，将混合物转移到培养皿中并在37℃下风干制得DCMC/SS膜。

2.如权利要求1所述的二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法，其特征在于，所述第一步的二醛羧甲基纤维素的制备方法包括：将CMC 1g和高碘酸钠0.98g溶解在30mL水中，用盐酸HCl调节混合溶液pH至3.5；然后移至用锡箔纸包裹的离心管中，并在40℃下孵育6小时；将孵育后的溶液取出加入4-7倍体积的乙醇使得到的DCMC沉淀，依次用水和乙醇洗涤三次后，将沉淀的DCMC风干并储存在-4℃。

3.如权利要求2所述的二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法，其特征在于，所述二醛羧甲基纤维素中醛含量的测定方法包括：将二醛羧甲基纤维素DCMC粉末0.5g溶解在25mL水中，然后用氢氧化钠NaOH调节至pH 5.0，然后将盐酸羟胺H₂NOH·HCl 0.05g/mL，pH 5.0,20mL加入到DCMC溶液中，在40℃下搅拌4小时；然后用1.0mol/LNaOH滴定释放的盐酸，将NaOH消耗体积记录为V_d，以同等条件滴定CMC，并将消耗的氢氧化钠体积记录为V_c，DCMC中的醛基含量AC通过下式计算：

C_NaOH＝1.0mol/L，m是DCMC的质量，以g计；242.16是DCMC中重复单元的分子量，每个测试重复三次。

4.如权利要求1所述的二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法，其特征在于，所述第一步的丝胶溶液的制备方法包括：将蚕茧剪成碎片，在0.1MPa、120℃下煮沸20分钟，将丝胶溶解到水中，通过过滤除去丝胶蛋白包裹的丝素蛋白，将得到的丝胶蛋白溶液冻干并储存在-20℃。

5.一种由权利要求1～4任意一项所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的制备方法制备的二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜。

6.一种如权利要求5所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜在生物医学中的应用。

7.一种如权利要求5所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的检测方法，其特征在于，所述二醛羧甲基纤维素/丝胶蛋白复合膜的检测方法包括：

(1)使用Thermo Fisher Nicolet iz10在25℃下记录CMC，DCMC和DCMC/SS复合膜的FT-IR光谱，波长扫描范围为850至4000cm^-1，分辨率为2cm^-1，每个样品扫描16次；

(2)通过JEOL扫描电子显微镜JCM-5000观测膜的表面形态；使用双面胶带将样品固定在铝柱台上，并在镀金120s后放大10000倍，以15kV的加速电压拍摄SEM图像；

(3)测量DCMC/SS复合薄膜的拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量，实验参照D828-97标准方法；首先测量膜的厚度以进行机械性能分析，将每组薄膜分别制备得到八个矩形条，宽10mm，长25mm，夹具之间的标距长度为15mm，牵引速度为2mm/min，拉伸强度，断裂伸长率和杨氏模量分别由相应的应力-应变曲线计算获得；

(4)DCMC/SS薄膜的溶胀性能测量，将干膜裁剪成20mm×20mm的矩形条，称重记为W₀，然后将膜浸入10mL水中；以12小时为时间间隔，测量3个时刻点，每个时刻点测量时，将膜取出并除去膜表面多余的水后，称重记为W_S，膜的溶胀比SR计算如下：

(5)润湿性：首先，将矩形DCMC/SS膜0mm×20mm，长×宽放置在样品平台上；然后，用精密注射器将一滴水5μL滴于膜表面上；最后，使用krüss液滴形状分析软件调整基线并测量液滴边界切线之间的左右接触角，每个薄膜测试五次，所有测试均在23±2℃和50±3％的相对湿度下进行；

(6)水溶性：将膜切成20mm×20mm的矩形条，并在65℃下干燥至恒重W_sol，然后浸入10mLPBS缓冲液pH 4.0,7.4,10.0的6孔细胞板中，密封板孔，在不同的时间间隔，取出膜，洗涤，干燥并称重W₁，样品的总可溶物质(TSM)计算如下：

每个膜测试三次，取平均值用于计算；

(7)热重分析：使用热重分析仪评估DCMC/SS膜的热稳定性，在25℃-800℃，氮气保护下以10℃/min的加热速率进行实验，以避免热氧化反应；

(8)溶血试验：从健康无疾病的兔子体内收集血液，用枸橼酸葡萄糖液处理以进行抗凝血实验，以800rpm/min离心血液，收集红细胞沉淀并重悬于10mL PBS缓冲液pH 7.4中，将膜15mm×15mm浸入无菌PBS缓冲液pH 7.4中，37℃下孵育30分钟后，将处理过的薄膜浸没在红细胞重悬液中，并在37℃下孵育1小时；然后，将样品以1,000rpm/min离心5分钟，最后用分光光度计读取上清液在540nm处吸光度值，所有样品测试3次，将水和PBS分别作为阳性P和阴性N对照，溶血率根据以下公式计算：

(9)细胞相容性：将小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和5％CO₂的Dulbecco's改良Eagle培养基DMEM中于37℃，95％相对湿度下培养，将圆形无菌DCMC膜置于96孔板底部，再将NIH3T3细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种在96孔板中；24小时后，向每孔中加入10μL CCK8溶液，然后将细胞在37℃下培养3小时；最后，用Glomax MultiDetectionSystem在450nm处测定溶液的吸光度，每组内的细胞活力表示为处理组细胞吸光度与未处理细胞吸光度的百分比；对于每个实验测试三个样品；此外，通过LIVE/DEAD染色评估DCMC/SS膜的细胞毒性，以同上的方法铺板24小时后，将细胞与染色液在37℃下孵育15分钟，然后在Olympus荧光显微镜IX71观察，每个样品测试三次。