CN104790216B - 一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法 - Google Patents
一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：(1)用静电纺丝制备PVA/PEI纳米纤维膜，并真空干燥；(2)经过干燥后，用戊二醛进行交联；(3)通过EDC·HCl和NHS活化叶酸FA的羧基，将羧基活化后的FA与带有一端羧基和一端氨基的聚乙二醇PEG反应，得到FA‑PEG‑COOH；(4)活化FA‑PEG‑COOH上的羧基，将FA‑PEG‑COOH加入到PVA/PEI纳米纤维膜中，摇床反应得到叶酸功能化纳米纤维；再加入三乙胺和乙酸酐乙酰化处理，洗涤、干燥，即可。本发明制备的纳米纤维具有良好的生物相容性和结构稳定性，并且捕获癌细胞所需时间短、特异性强，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于靶向捕获癌细胞纳米材料的制备领域，特别涉及一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)是肿瘤转移过程中在血液循环***中存活的肿瘤细胞，该细胞的生成被认为是肿瘤发生转移的必要前提。恶性肿瘤是我国死亡率最高的重大疾病之一，90％以上肿瘤患者的死亡都是由于肿瘤转移所致。侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特征之一，肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化(EMT)，从而具有流动特性，进入外周血中，就形成了循环肿瘤细胞(CTC)。CTC的检测有助于研究肿瘤转移机制、指导肿瘤治疗、判断治疗效果、为推断预后提供可靠参考，是国内外肿瘤治疗关注的焦点。
纳米材料由于其尺寸较小(1-100nm)，具有特殊的光学、电子学和磁学等性质受到越来越多的关注。据报道证明纳米结构可以很好地促进其与细胞间的相互作用，大大提高捕获效果。随着纳米科学与技术的发展，人们获得了结构可控的、表面功能化的纳米材料和纳米结构，靶向CTC表面标志物的特异性识别分子修饰的纳米材料对CTC细胞的检测研究受到了科学家的广泛关注，并取得了令人瞩目的成果。2013年，《自然》(Nature)杂志将CTC纳米检测列为最具创新性和转化潜力的肿瘤诊断新方法[MARX V.Tracking metastasis andtricking cancer[J].Nature,2013,494(7435):133-8.]。
静电纺丝技术因为其设备简单，操作容易以及高效等特点，并且通过其制备的纳米纤维比表面积高、均一性好以及纤维形貌可调可控等优点，而成为近年来备受关注、应用最多的制备纳米纤维的方法。使用该方法可以制备出直径10nm～10μm的超细纤维，在催化剂载体、生物医学、增强材料、过滤材料、电极材料、传感器等方面都有很好的应用。
聚乙烯醇(PVA)具有优异的生物可降解性、生物相容性，在外科用缝合线、体内植入材料、药物载体及组织工程支架方面有着广泛的应用。PVA是一种半晶状聚合物，具备较高的化学稳定性和热稳定性。PVA无毒，对动物体没有负面影响，与皮肤接触不会造成任何损伤。聚乙烯亚胺(PEI)表面含有大量氨基，表面易修饰，且与PVA混纺可以很容易实现表面交联，提高其水稳定性，目前正受到越来越广泛的关注。
目前，抗体、多肽、E-选择素等细胞配体已被功能化修饰至纳米纤维表面，并应用于癌细胞的特异性捕获。文献[ZHA Z B,COHN C,DAI Z F,et al.Nanofibrous lipidmembranes capable of functionally immobilizing antibodies and capturingspecific cells[J].Adv Mater,2011,23(30):3435-40.]中表明叶酸(FA)与叶酸受体(FR)有很高的亲和力。叶酸受体(FR)在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性。FR是细胞摄取叶酸的重要途径，其机制为受体介导的内吞效应，这种机制具有亲和力高、特异性强的特点，有良好的物质转运潜能。叶酸是包括DNA合成、DNA修复和细胞***在内的很多生物过程所需的一种必要维他命。“正常”细胞表达数量相对较少的三个叶酸受体FRα、FRβ和FRγ，而它们在癌细胞中普遍过度表达FRα和FRβ。能够过度表达叶酸受体的癌症细胞包括卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌和造血系骨髓细胞癌等。
有文献报道[Zhao,Y.,et al.,Dendrimer-functionalized electrospuncellulose acetate nanofibers for targeted cancer cell captureapplications.Journal Of Materials Chemistry B,2014.2(42):p.7384-7393.]，通过将叶酸与树状大分子结合，并修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面，对癌细胞特异性地捕获。该方法操作复杂，自组装的步骤繁琐，且成本昂贵。
聚乙烯亚胺(PEI)表面含有大量氨基，易修饰，且成本低廉，检索国内外相关文献和专利结果表明：通过运用聚乙烯亚胺(PEI)进行表面修饰，用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，该方法制备的靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺聚乙烯醇/聚乙烯亚胺(PVA/PEI)纳米纤维材料可用于特异性捕获癌细胞；该发明制备的癌细胞捕获材料具有制备工艺简单、特异性强、可短时间内靶向捕获癌细胞等优点，在癌症的早期诊断方面具有很好的应用前景。
本发明的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
(1)以水为溶剂，聚乙烯醇PVA与聚乙烯亚胺PEI按照质量比为3:1配制纺丝液，通过静电纺丝制备得到PVA/PEI纳米纤维膜；
(2)将步骤(1)中制备得到的PVA/PEI纳米纤维膜与戊二醛溶液在干燥器中进行交联反应，得到不溶于水的交联PVA/PEI纳米纤维膜；
(3)以二甲基亚砜DMSO为反应溶剂，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化叶酸FA的羧基，将活化后的FA加入到带有一端羧基和一端氨基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中，进行酰胺化反应，然后透析，冷冻干燥，得到FA-PEG-COOH；
(4)用EDC·HCl和NHS活化步骤(3)中得到的FA-PEG-COOH的羧基，将活化后的FA-PEG-COOH加入到步骤(2)中得到的纳米纤维膜中，摇床反应3-5天，得到叶酸功能化修饰的纳米纤维，加入三乙胺和乙酸酐进行乙酰化处理，洗涤，干燥，即得叶酸功能化纳米纤维。
所述步骤(1)中PVA的重均分子量MW为88000，PEI的重均分子量MW为25000。
所述步骤(1)中纺丝液中PVA的浓度为12wt％。
所述步骤(1)中静电纺丝技术的参数为：电压为18.6kv，流速设置为0.3ml/h，纺丝距离设置为25cm，环境湿度为40-50％。
所述步骤(2)中得到的交联后纳米纤维的表面颜色由交联前的白色变为棕色。
所述步骤(3)中NH2-PEG-COOH的MW为2000。
所述步骤(3)中投料摩尔比为FA:EDC·HCl:NHS:NH2-PEG-COOH＝2.5:2:2:1。
所述步骤(4)中投料摩尔比为FA-PEG-COOH:EDC·HCl:NHS＝1:5:5。
所述步骤(4)中乙酰化的条件为三乙胺和乙酸酐的摩尔量均为5倍于PEI的表面氨基的摩尔量，反应时间为1天。
所述步骤(4)中得到叶酸功能化纳米纤维应用于表面高叶酸受体表达的癌细胞的特异性捕获。
本发明中FA-PEG-COOH的制备过程：
NH2-PEG-COOH的MW为2000；FA的分子量为441.4；EDC·HCl的分子量为191.7；NHS的分子量为115.09。称取NH2-PEG-COOH 79.42mg，溶于7ml的DMSO中。称取FA43.82mg，溶于5mlDMSO中。EDC·HCl和NHS分别为15.22mg和9.14mg各溶于1ml DMSO中。用EDC·HCl和NHS活化FA羧基3小时后，加入到NH2-PEG-COOH中，在磁力搅拌器上混合反应3天。
反应结束后，将反应液放入截留分子量为1000的透析袋中，用夹子夹紧，在纯水中透析3天，让未反应的小分子透出，尽可能地提高整个体系的纯度。透析完成后，把反应液转移到50ml的离心管中，放入-80℃冰箱1小时，使其冷冻结冰。把冷冻好的样品，快速取出，放入冻干机中，冻干3天后，就可以得到粉末状的FA-PEG-COOH。
本发明以靶向分子叶酸功能化纳米纤维为基质，通过培养叶酸受体高表达人脑胶质瘤细胞(U87MG)和叶酸受体低表达小鼠成纤维细胞(L929)探究其特异性捕获癌细胞的效果。
本发明通过核磁共振(NMR)对FA-PEG-COOH的结合效率进行了表征。借助扫描电镜(SEM)对戊二醛交联前后的纳米纤维和靶向分子修饰后的纤维形貌进行表征，利用傅里叶变换-红外光谱(FTIR)对其结构进行表征。通过强力测试仪对纤维的力学性能进行表征。通过紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)对纤维的溶血率进行表征。最后，通过在材料上培养细胞，借助共聚焦显微镜(CLSM)及细胞计数器，研究材料对癌细胞的特异捕获性能。
和对照的未经靶向分子叶酸功能化纳米纤维捕获癌细胞的效果相比，本发明制备的材料能够显著地提高对人脑胶质瘤细胞(U87MG)的捕获能力，因此本发明制备的靶向分子叶酸功能化纳米纤维能够作为新型材料用于癌细胞的特异性捕获。
核磁共振(NMR)、扫描电镜(SEM)、傅里叶变换-红外光谱(FTIR)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、固定强力测试仪、U87MG细胞捕获定性试验(激光共聚焦显微镜(CLSM))、U87MG及L929细胞捕获定量试验结果分别如下：
(1)核磁共振(1HNMR)测试结果
1HNMR图谱表征叶酸(FA)与聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)制备得到FA-PEG-COOH的效率，参见说明书附图1。FA与NH2-PEG-COOH的反应原理，主要是羧基和氨基的酰胺化反应。在ppm强度为3～4之间，为NH2-PEG-COOH中聚乙二醇中的-CH2-质子峰，由d表示。观察FA的结构，在ppm强度为8.7处、7.5处和6.8处，均为FA中的质子峰，分别由a、b和c来表示。其中，a、b、c的质子峰之比为1:2:2。通过，d和a的信号峰积分面积分之比进行计算，从而得出，在本次FA-PEG-COOH的制备中，每个PEG上连接了0.8个FA。
(2)扫描电镜图(SEM)结果
SEM图用于表征纳米纤维的形貌和直径大小。参见说明书附图2，所得到的PVA/PEI纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为425nm。参见说明书附图3，经过戊二醛蒸汽交联后，纤维形貌依然良好，交联后的纳米纤维平均直径为493nm，这与之前未经交联处理的PVA/PEI纳米纤维的平均直径439nm相差了70nm左右，说明了戊二醛交联PVA/PEI纤维上，造成的纤维直径变大。同时，交联后纤维膜颜色由白色变棕色，这主要是因为PEI上的氨基与戊二醛上的醛基发生缩醛反应引起的。
参见说明书附图4和附图5，将对照材料mPEG-COOH和FA-PEG-COOH修饰到交联后的PVA/PEI纳米纤维表面后，纤维的形貌发生卷曲，并且平均直径略有增加，分别为599nm和625nm，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。
(3)傅里叶变换-红外光谱(FTIR)结果
FTIR结果表明，戊二醛已经成功交联到PVA/PEI纳米纤维上，且FA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH成功修饰到戊二醛交联后的PVA/PEI纳米纤维表面。参见说明书附图6。3350cm-1处是PVA羟基的特征峰，交联后的峰变宽变强，这主要是与PEI上的氨基、戊二醛的醛基的相互作用造成的。2940cm-1处是-CH2-的特征峰。1650cm-1处是氨基N-H键的特征峰，从该峰中可以发现交联后的纳米纤维上面仍保留有部分氨基，这是为后续纳米纤维的表面功能化修饰做好准备。1600cm-1处是交联前后的PVA/PEI纳米纤维主要的不同之处，这是交联后的纳米纤维的的新峰，这表示了C＝N键的生成，意味着PEI的部分氨基与戊二醛的醛基结合，进一步说明了交联的成功。
从附图6中还可以发现，在1600cm-1位置处，两者有着明显的差别，这主要是由于FA-PEG-COOH与PVA/PEI纳米纤维通过酰胺化反应产生的。因此，经过FA-PEG-COOH修饰前后的主要不同之处在于，酰胺键的产生。PEG-FA图谱中，1720cm-1和1690cm-1表示FA-PEG-COOH中2个羧基的特征峰，而在FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维上，羧基的特征峰消失，酰胺键的特征峰产生，1600cm-1处为伯酰胺，以此来判断FA-PEG-COOH成功与PVA/PEI纳米纤维结合。同理，在mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维上也存在1600cm-1的特征峰，这也是由mPEG-COOH修饰到PVA/PEI纳米纤维上所产生的酰胺键，证明mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的也制备完成。从叶酸分子的结构中可以发现，叶酸存在一个苯环结构，苯环在1450cm-1-1600cm-1之间有特征峰，一般是有2～4个吸收峰。在该图谱中，明显得看到了FA-PEG-COOH与FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维上，在1500cm-1附近存在4个吸收峰，也进一步证明了叶酸分子(FA)修饰到了纳米纤维表面。
(4)固定强力测试仪测定纤维的力学性能
固定强力测试仪评价了纤维的力学性能，参见说明书附图7所示。从表1中也可以发现，交联后的断裂应力(2.75±0.13Mpa)较交联前(0.77±0.18MPa)明显提高，而交联后的断裂应变(13.59±1.43％)较交联前(55.37±5.71％)则大幅度减少，说明交联后膜开始变脆。交联后纤维膜的杨氏模量则提高很大，从交联前的4.61±0.43MPa增大为交联后的53.78±6.38MPa，进一步说明材料经交联后纤维膜抵抗外界拉伸的能力增强，韧性减小，机械强力增加。而经过FA-PEG-COOH修饰后，纳米纤维的断裂应力为2.27±0.18MPa，经过mPEG-COOH修饰后，纳米纤维的断裂应力为2.14±0.29MPa，经过修饰后，纳米纤维的断裂应力与修饰前的断裂应力(2.75±0.13MPa)稍显下降，这主要是由于经过修饰反应，纤维发生了溶胀，从而导致断裂应力下降。而断裂应变没有显著变化，均在15％左右。因此，经过修饰后纤维的杨氏模量(41.80±2.45MPa和43.56±2.72MPa)较修饰前(53.78±6.38MPa)要小，修饰后FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维和mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的机械性能良好。
(5)紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)测定纤维溶血率
UV-Vis表征了经过FA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰后的纤维材料对血液的生物相容性。测试结果参见说明书附图8所示。在400-800nm范围内，对照H2O中上清液的吸光值明显较高，这表明血红蛋白含量较高，即血红细胞在水中完全涨破，出现严重的溶血现象，但是在FA-PEG-PVA/PEI-Ac、mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维以及对照PBS中，上清液吸光值很低，说明未发生红细胞涨破。从图中的溶血照片中也可以看出，Eppendorf管H2O组中血红细胞基本上被全部破坏，而PBS和实验材料组不存在明显的溶血现象，未胀破的血红细胞则可以通过离心分离出来。不同样品置于人血红细胞中培养2h，取出材料并离心后测试上清液在541nm处的吸光值。此吸光值越高代表上清液中血红蛋白的含量越高，也就代表红细胞胀破的程度越高，溶血现象越严重。通过计算得知，经过FA-PEG-COOH和对照材料mPEG修饰后的纤维材料的溶血率分别为1.98％和3.02％，均小于5％，证明所制备材料血液相容性良好。
(6)U87MG细胞捕获定性试验结果
以具有叶酸受体高表达的人脑胶质瘤细胞(U87MG)为模型细胞来检验两种材料FA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维捕获U87MG细胞的效果。参见说明书附图9。FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维和对照材料mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维在10min、20min、40min、60min、120min，5个时间点上的细胞生长状况。从图9中，可以发现不管是FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维和对照材料mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维，随着时间的延长，细胞的量都明显的增多。尤其在60min后，细胞大量生长，并且聚集起来。在相同时间下，FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维和对照材料mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维进行对比，可以进行靶向效果的评价。在10min和20min的观察中，两种材料的细胞生长都不明显，但是从40min中，带有靶向基团的材料上细胞的量明显的增多，对照材料上的细胞很少。从60min开始，两种材料的细胞都开始大量生长，但是从整体上的量来分析，带有靶向基团的FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维比对照材料mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维有着明显的优势，以此可以判断，其靶向捕获效果较好。通过增加放大倍数，可以明显的看到纤维的形貌，并且与细胞在各时间点上的状态(图10)。在10min，可以明显的看到细胞被纤维紧紧的包裹，证明两者之间有着明显的结合效果。随着时间的延长，细胞形态也在慢慢的发生着改变。在60min和120min，可以看到细胞已经呈现聚集状态，这也进一步说明纳米纤维的高孔隙率和高比表面以及可吸附性能为细胞捕获提供了一个很好的环境。
(7)U87MG及L929细胞捕获定量试验结果
以高FR表达的U87MG细胞及低FR表达的L929细胞两种模型细胞来检验两种材料FA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维特异性捕获细胞的效果。参见说明书附图11，试验结果表明，对于U87MG细胞而言，细胞捕获效率均随着时间的增加而提高。靶向材料与非靶向材料表现出明显差异。这种优势主要归因于FA介导的靶向捕获。参见说明书附图12，对于L929细胞而言，无论是FA-PEG-PVA/PEI-Ac，还是mPEG-PVA/PEI-Ac，其捕获细胞效率同样随着时间的增加而提高，但是，靶向材料与非靶向材料间并没有表现出明显的差别。这可能是因为随着时间的延长，细胞会非特异性粘附在纳米纤维表面。
本发明采用静电纺丝法制备聚乙烯醇/聚乙烯亚胺(PVA/PEI)纳米纤维，充分利用纳米纤维比表面积大、孔隙率高且能够模拟细胞外基质结构的特性，有利于细胞与材料间的有效接触并促进其相互作用，同时结合靶向分子的特异性细胞结合能力，可达到靶向捕获癌细胞的目的。
有益效果
(1)本方法制备的靶向分子叶酸功能化纳米纤维材料具有良好的形貌、结构稳定性及血液相容性；
(2)本方法制备的靶向分子叶酸功能化纳米纤维材料可用于靶向捕获高叶酸受体表达的癌细胞；
(3)本发明制备的癌细胞捕获材料具有原料价格低廉，制备工艺简单，捕获癌细胞所需时间短、特异性强等优点，在癌症的早期诊断方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1是实施例3中FA-PEG-COOH的核磁共振氢谱图；
图2是实施例1中PVA/PEI纳米纤维的SEM表征图及直径分布图；
图3是实施例2中戊二醛交联后的PVA/PEI纳米纤维的SEM表征图及直径分布图；
图4是对比例1中mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的SEM表征图及直径分布图；
图5是实施例4中叶酸功能化纳米纤维FA-PEG-PVA/PEI-Ac的SEM表征图及直径分布图；
图6是红外图谱；其中，(1)是实施例1中PVA/PEI纳米纤维的红外曲线；(2)是实施例2中戊二醛交联后的PVA/PEI纳米纤维的红外曲线；(3)是对比例1中mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的红外曲线；(4)是实施例4中叶酸功能化纳米纤维FA-PEG-PVA/PEI-Ac的红外曲线；(5)是实施例3中FA-PEG-COOH的红外曲线；
图7是实施例1中的PVA/PEI纳米纤维、实施例2中的戊二醛交联后的纳米纤维、对比例1中的mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维和实施例4中的FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的应力-应变曲线；
图8是实施例5中FA-PEG-PVA/PEI-Ac和对比例2中mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维对血液相容性评价的紫外吸收图谱；
图9是实施例6中FA-PEG-PVA/PEI-Ac和mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维对U87MG细胞捕获的共聚焦显微镜图片；
图10是实施例6中FA-PEG-PVA/PEI-Ac和mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维在630X油镜下，对U87MG细胞捕获的共聚焦显微镜图片；
图11是实施例6中FA-PEG-PVA/PEI-Ac和mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维在不同时间内(10min、20min、40min、60min、120min)捕获U87MG细胞的捕获效率；
图12是对比例3中FA-PEG-PVA/PEI-Ac和mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维在不同时间内(10min、20min、40min、60min、120min)捕获L929细胞的捕获效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
以水为溶剂配置12wt％的PVA溶液，同时用玻璃棒缓慢搅拌约30分钟直至PVA粉末完全溶胀。然后，在烧杯中放入一个转子，把其放在磁力搅拌器上80℃水浴加热搅拌3小时，静置冷却。然后，质量比PVA:PEI＝3:1加入PEI，以水为溶剂，通过超声震荡溶解以及磁力搅拌过夜，使其分散均匀，配置成PVA/PEI混纺液。静电纺丝实验在室温，湿度小于50％的条件下进行。静电纺装置由高压电源(可以提供0～40kV的直流电压)、注射泵、注射器、内径为1.0毫米的不锈钢针头及一块接地的收集铝板。纺丝过程中的工艺参数设置为：电压为18.6kv，流速设置为0.3ml/h，纺丝距离设置为25cm。纺好的纤维膜真空干燥至少24h。SEM结果显示所得到的PVA/PEI纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为425nm，如图2所示。测试PVA/PEI纳米纤维的力学性能，如图7和表1所示。
实施例2
采用戊二醛蒸汽交联法对实施1得到的PVI/PEI纳米纤维进行交联处理，其具体操作过程为，将纤维膜套在盛有20ml 25％戊二醛溶液的培养皿上方，将两者一起放入干燥器中，抽真空交联18h。把交联好后的纤维膜放入水中漂洗，即可取下，此时可以发现纤维膜已经不溶于水，即改性处理完成。然后用去离子水洗涤3-5次，放入真空干燥箱12-24h。SEM结果显示，经过戊二醛蒸汽交联后，纤维形貌依然良好，交联后的纳米纤维平均直径为493nm，这与之前未经疏水处理的PVA/PEI纳米纤维的平均直径425nm相差了70nm左右，说明了戊二醛交联PVA/PEI纤维上，造成的纤维直径变大，如图3所示。FTIR结果表明，戊二醛已成功交联到纳米纤维上，如图6所示。测试戊二醛交联后的纳米纤维的力学性能，如图7和表1所示。
实施例3
制备FA-PEG-COOH。已知NH2-PEG-COOH的MW为2000；FA的分子量为441.4；EDC·HCl的分子量为191.7；NHS的分子量为115.09。称取NH2-PEG-COOH 79.42mg，溶于5ml的DMSO中。以FA:EDC·HCl:NHS:NH2-PEG-COOH摩尔比＝2.5:2:2:1计算所需FA的质量为43.82mg，溶于5ml DMSO中。所需的EDC·HCl和NHS分别为15.22mg和9.14mg，分别溶于1ml DMSO中。通过EDC·HCl和NHS活化FA中的羧基，反应时间为3h。活化羧基3小时后的FA，加入到NH2-PEG-COOH中，在磁力搅拌器上混合反应3天。
反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析3天(6x2L)。然后进行冷冻干燥处理，得到FA-PEG-COOH反应产物。图1所示1H NMR图谱表示每个PEG分子上修饰了0.8个FA。
实施例4
将FA-PEG-COOH修饰在实施例2获得的交联纳米纤维。在25mg的纳米纤维膜中，PEI的质量为6.25mg，可以参与酰胺化反应的氨基为0.1167mol。以羧基：氨基摩尔比＝1：10计算，所需的FA-PEG-COOH为0.01167mol，质量为27.4mg。以FA-PEG-COOH:EDC·HCl:NHS摩尔比＝1:5:5计算，EDC·HCl的量为11.19mg，NHS的量为6.7mg分别溶于1ml水中，缓慢逐滴加入到含有27.4mg FA-PEG-COOH的10ml水溶液中，从而以总体积为15ml的反应体系进行活化反应。3小时后，将15ml的FA-PEG-COOH反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应3天。
以5倍过量进行乙酰化处理，本实验中三乙胺的浓度为0.727g/ml，计算所需的体积为81.2μl，乙酸酐的浓度为1.08g/ml，计算所需的体积为55.2μl。其操作过程为，先加入三乙胺，混合半小时后，再加入乙酸酐，反应1天，使纳米纤维表面的氨基全部乙酰化。
扫描电镜结果表明FA-PEG-COOH功能化纳米纤维表面后，纤维的形貌发生卷曲，并且平均直径略有增加，为625nm，如图5所示，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。FTIR(图6)表明FA-PEG-COOH已成功修饰到纳米纤维表面。测试FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的力学性能，如图7和表1所示。
实施例5
取肝素锂稳定的健康成年人全血5mL，离心3min(转速为3000r/min)，用PBS洗涤沉淀3次，得红细胞。用PBS按照1：35的比例配置成人红细胞悬浊液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2mL人红细胞悬浊液分别溶于0.8mLPBS中和0.8mL蒸馏水中。然后，将所配置的人红细胞悬浊液再稀释5倍，按照纤维毡质量与稀释5倍后人红细胞悬浊液体积之比为2mg：mL，将FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维浸入稀释5倍后人血红细胞悬浊液中，取4个平行样，在37℃环境下孵育2h。然后，取出纤维毡，将两个对照组及浸泡过纤维毡的人红细胞悬浊液离心1min(1000rpm)，取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在400-800nm范围内的紫外吸收，并测试上清液在541nm处的吸光值，评价材料的溶血性。计算得到FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的溶血率为1.98％(图8)。
实施例6
以高叶酸受体表达的人脑胶质瘤细胞(U87MG)为模型细胞来检验实施例4制备的FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维与对比例1制备的mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维特异性捕获U87MG细胞的效果。将纳米纤维从铝箔上揭下，剪成圆形(Φ＝14mm)，然后将样品放入24孔培养板，用钢环固定。不同时间点的样品要放置在不同的培养板中，每个样品4个平行样。放好样品后，加入约1mL的75％酒精浸泡2h，同时，开紫外灯杀菌。杀菌完毕后，吸出酒精，用PBS溶液浸泡漂洗3次，每次20分钟。最后用400μL纯的DMEM培养基浸泡，放入CO2培养箱过夜。
从培养箱取出24孔培养板，吸出之前加入的纯的培养基。U87MG细胞的种植密度为105个每孔，培养不同时间后(10min、20min、40min、60min、120min)，吸取上清液，并且用PBS将纤维毡清洗三遍，收集PBS清洗液使之与上清液混合，离心5min，速度为1000rpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数，计算得知两种纤维毡表面在不同时间内捕获U87MG细胞的数量。激光共聚焦显微镜结果定性表明叶酸功能化的纳米纤维可以捕获更多的U87MG细胞(图9)，通过630X的油镜观察叶酸功能化的纳米纤维与细胞的结合情况良好(图10)。细胞计数结果表明，经过40min、60min、120min培养后，FA-PEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维捕获癌细胞的数量远远高于mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维，且两种材料捕获细胞的数量具有显著性差异(图11)。
对比例1
以羧基：氨基摩尔比＝1：10计算，所需的mPEG-COOH为0.01167mol，质量为23.34mg。用EDC·HCl和NHS活化羧基的方法对mPEG中的羧基进行活化，以PEG-COOH:EDC·HCl:NHS摩尔比＝1:5:5计算，EDC·HCl的量为11.19mg，NHS的量为6.7mg分别溶于1ml水中，缓慢逐滴加入到含有mPEG-COOH的10ml水溶液中，从而以总体积为15ml的反应体系进行活化反应。3小时后，将15ml的mPEG-COOH反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应3天。
以5倍过量进行乙酰化处理，本实验中三乙胺的浓度为0.727g/ml，计算所需的体积为81.2μl，乙酸酐的浓度为1.08g/ml，计算所需的体积为55.2μl。其操作过程为，先加入三乙胺，混合半小时后，再加入乙酸酐，反应1天，使纳米纤维表面的氨基全部乙酰化。
扫描电镜结果表明mPEG-COOH功能化纳米纤维表面后，纤维的形貌发生卷曲，并且平均直径略有增加，为599nm(图4)，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。FTIR(图6)表明mPEG-COOH已成功修饰到纳米纤维表面。测试产物mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的力学性能，如图7和表1所示。
表1静电纺PVA/PEI(实施例1)、交联PVA/PEI(实施例2)、mPEG-PVA/PEI-Ac(对比例1)及FA-PEG-PVA/PEI-Ac(实施例4)纳米纤维毡机械性能参数表。每个数据都代表独立的实验，所有数据都表示为平均值±标准偏差(n＝5)。
| 样品 | 断裂应力(Mpa) | 断裂应变(％) | 杨氏模量(Mpa) |
| PVA/PEI | 0.77±0.18 | 55.37±5.71 | 4.61±0.43 |
| 交联PVA/PEI | 2.75±0.13 | 13.59±1.43 | 53.78±6.38 |
| mPEG-PVA/PEI-Ac | 2.14±0.29 | 16.17±1.36 | 41.80±2.45 |
| FA-PEG-PVA/PEI-Ac | 2.27±0.18 | 14.39±2.09 | 43.56±2.72 |
对比例2
取肝素锂稳定的健康成年人全血5mL，离心3min(转速为3000r/min)，用PBS洗涤沉淀3次，得红细胞。用PBS按照1：35的比例配置成人红细胞悬浊液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2mL人红细胞悬浊液分别溶于0.8mLPBS中和0.8mL蒸馏水中。然后，将所配置的人红细胞悬浊液再稀释5倍，按照纤维毡质量：稀释5倍后人红细胞悬浊液体积之比为2mg/mL将mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维浸入稀释5倍后人血红细胞悬浊液中，取4个平行样，在37℃环境下孵育2h。然后，取出纤维毡，将两个对照组及浸泡过纤维毡的人红细胞悬浊液离心1min(1000rpm)，取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在400-800nm范围内的紫外吸收曲线，并测试上清液在541nm处的吸光值，评价材料的溶血性。计算得到mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的溶血率为3.02％(图8)。
对比例3
以不具备叶酸受体高表达的小鼠成纤维细胞(L929)为模型细胞来检验实施例4制备的FA-PEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维及对比例1制备的mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维捕获不含叶酸受体的L929细胞的效果。材料处理方法同实施例6。所用培养基为含有10％FBS的DMEM培养基。L929细胞的种植密度为105个每孔，培养不同时间后(10min、20min、40min、60min、120min)，吸取上清液，并且用PBS将纤维毡清洗三遍，收集PBS清洗液使之与上清液混合。离心5min，速度为1000rpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数。计算得知两种纤维毡表面在不同时间内捕获L929细胞的数量，细胞计数结果显示培养不同时间后两种材料捕获L929细胞的数量几乎一致(图12)。
Claims (8)
1.一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
(1)以水为溶剂，聚乙烯醇PVA与聚乙烯亚胺PEI按照质量比为3:1配制纺丝液，通过静电纺丝制备得到PVA/PEI纳米纤维膜，并真空干燥；
(2)将步骤(1)中制备得到的PVA/PEI纳米纤维膜与戊二醛溶液在干燥器中进行交联反应，得到不溶于水的交联PVA/PEI纳米纤维膜；
(3)以二甲基亚砜DMSO为反应溶剂，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化叶酸FA的羧基，将活化后的FA加入到带有一端羧基和一端氨基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中，进行酰胺化反应，然后透析，冷冻干燥，得到FA-PEG-COOH；
(4)用EDC·HCl和NHS活化步骤(3)中FA-PEG-COOH的羧基，将活化后的FA-PEG-COOH加入到步骤(2)得到的纳米纤维膜中，摇床反应3-5天，得到叶酸功能化修饰的纳米纤维，加入三乙胺和乙酸酐进行乙酰化，洗涤，干燥，即得叶酸功能化纳米纤维；其中，投料摩尔比为FA-PEG-COOH:EDC·HCl:NHS＝1:5:5。
2.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中PVA的重均分子量MW为88000，PEI的重均分子量MW为25000。
3.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中纺丝液中PVA的浓度为12wt％。
4.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中静电纺丝技术的参数为：电压为18.6kv，流速设置为0.3ml/h，纺丝距离设置为25cm，环境湿度为40-50％。
5.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中NH2-PEG-COOH的MW为2000。
6.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中投料摩尔比为FA:EDC·HCl:NHS:NH2-PEG-COOH＝2.5:2:2:1。
7.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中乙酰化的条件为三乙胺和乙酸酐的摩尔量均为5倍于PEI的表面氨基的摩尔量，反应时间1天。
8.根据权利要求1所述的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中叶酸功能化纳米纤维应用于表面高叶酸受体表达的癌细胞的特异性捕获。
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