CN109870439A - 光学相干层析和双光子荧光同步成像*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜。本发明的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，通过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方法有效减少了***硬件，实现了光学相干层析技术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用，达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。

Description

光学相干层析和双光子荧光同步成像***

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，特别涉及一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***。

背景技术

在生物组织荧光成像中，双光子显微镜具有非侵入，高分辨率，高成像深度等特点，是一种常见的显微成像工具。相较于单光子荧光成像，其优点是荧光仅在聚焦焦点处激发，从而提高了成像信噪比和分辨率，在生物成像领域得到广泛应用。而光学相干层析成像技术(Optical Coherence Tomography,OCT)是一种光学断层成像技术，能实现高分辨率的断层扫描和三维重建。将二者结合同步成像，能提供观测样本的多方位信息。

专利(一种偏振光学相干层析与偏振多光子显微的双模成像***,CN106383087A)提到将双光子成像与OCT相结合，二者用同一组扫描振镜，然而双光子成像是横向扫描，光学相干层析是纵向断层扫描，在横向方向速度非常慢，将大大限制成像的速度，整体成像速度较慢。文章(Combined two-photon microscopy and optical coherence tomographyusing individually optimized sources[J],Optics Express,2011)将双光子***和光学相干层析成像***的光路独立扫描后再耦合进成像光路，所以两套***扫描没有同步，并且用两组振镜也增加了***的复杂性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜；

所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。

优选的是，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。

优选的是，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。

优选的是，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。

优选的是，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直；

所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直；

所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。

优选的是，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f***，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f***的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f***，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f***的透镜焦点位置。

优选的是，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析***或者扫频源光学相干层析***。

优选的是，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。

优选的是，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光，而飞秒激光激发样品产生的荧光被其反射到所述双光子荧光成像模块。

优选的是，所述双光子光源为飞秒激光器，其发出920nm的飞秒脉冲平行光源，光斑直径为1mm。

本发明的有益效果是：本发明的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，通过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方法有效减少了***硬件，实现了光学相干层析技术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用，达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。

附图说明

图1为本发明的光学相干层析和双光子荧光同步成像***的光路结构示意图；

图2为本发明的一种实施例中采用谱域光学相干层析***的光路结构示意图；

图3为本发明的一种实施例中共用扫描模块的共用振镜扫描的扫描轨迹图。

附图标记说明：

1—双光子光源；2—快轴扫描模块；3—第一二向色镜；4—共用扫描模块；5—双光子荧光成像模块；6—成像显微物镜；7—慢轴扫描模块；8—光学相干层析模块；9—样品；10—第二二向色镜；21—快轴扫描振镜；22—快轴聚焦透镜；41—共用扫描振镜；42—共用聚焦透镜；43—第一透镜；44—第二透镜；51—成像聚焦透镜；52—滤光片；53—探测器；71—慢轴扫描振镜；72—慢轴聚焦透镜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本实施例的一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***，包括双光子光源1、快轴扫描模块2、慢轴扫描模块7、第一二向色镜3、共用扫描模块4、光学相干层析模块8、第二二向色镜10、双光子荧光成像模块5以及成像显微物镜6；

其中，光学相干层析模块8中发出的样品光经过慢轴扫描模块7后透射第一二向色镜3，双光子光源1发出的飞秒激光经过快轴扫描模块2后被第一二向色镜3反射，与透射第一二向色镜3的样品光相结合，共同经过共用扫描模块4后透射二向色镜，再经过成像显微物镜6后照射到样品9上；飞秒激光激发样品9产生的荧光经成像显微物镜6后被第二二向色镜10反射至双光子荧光成像模块5进行荧光成像，样品光照射到样品9上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经成像显微物镜6、透射第二二向色镜10、共用扫描模块4、透射第一二向色镜3、慢轴扫描模块7后进入光学相干层析模块8进行层析成像。

双光子荧光成像模块5包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜51、滤光片52和探测器53，样品9被激发后发出的荧光经第二二向色镜10反射后，依次经成像聚焦透镜51聚焦、滤光片52滤除杂散光后由探测器53接收，进行荧光成像。

快轴扫描模块2包括快轴扫描振镜21和快轴聚焦透镜22；用于双光子荧光成像***，偏转扫描光束，实现对样品9的行扫描。快轴扫描振镜21的扫描轴方向与共用扫描振镜41的扫描方向相互垂直，且快轴扫描振镜21的扫描轴分别与双光子光源1发出光的光轴以及快轴聚焦透镜22的光轴垂直。在一种实施例中，快轴扫描振镜21包括MEMS振镜、共振式振镜或者多面振镜，快轴扫描振镜21设定的扫描速度为16KHz，镜面大小为3mm x 4mm，型号为EOPC SC-30。

慢轴扫描模块7包括慢轴扫描振镜71和慢轴聚焦透镜72，用于光学相干层析***，偏转光学相干层析光束，实现对样品9的场扫描。慢轴扫描振镜71的扫描轴方向与快轴扫描振镜21的扫描方向相互平行，且慢轴扫描振镜71的扫描轴分别与光学相干层析模块8发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜72的光轴垂直。在一种实施例中，慢轴扫描振镜71设定的扫描速度为0.1Hz。

共用扫描模块4包括依次设置的共用扫描振镜41、共用聚焦透镜42和中继透镜组，用于将光学相干层析模块8和双光子光源1的飞秒激光光同时偏转，实现光学相干层析对样品9的行扫描及双光子荧光成像***对样品9的场扫描。本实施例中中继透镜组包括第一透镜43和第二透镜44；样品光依次经过共用扫描振镜41、共用聚焦透镜42、第一透镜43和第二透镜44，到达第二二向色镜10。共用扫描振镜41与快轴扫描振镜21的扫描方向相互垂直，且共用扫描振镜41的扫描轴分别与共用聚焦透镜42、中继透镜组以及共用扫描模块4的扫描透镜的光轴垂直。在一种实施例中，共用扫描振镜41设定扫描速度为30Hz，镜面大小10mm x5mm。

慢轴聚焦透镜72和共用聚焦透镜42构成4f***，慢轴扫描振镜71和共用扫描振镜41位于4f***的透镜焦点位置；快轴聚焦透镜22和共用聚焦透镜42构成4f***，快轴扫描振镜21和共用扫描振镜41位于4f***的透镜焦点位置。在一种实施例中，慢轴聚焦透镜72的f＝40mm，共用聚焦透镜42的f＝60mm，快轴聚焦透镜22的f＝20mm。对于中继透镜组的第一透镜43、第二透镜44构成4f***，共用扫描振镜41和成像显微物镜6分别位于第一透镜43和第二透镜44的焦点，即共用扫描模块4发出的光束需要依次经过两个聚焦透镜(第一透镜43和第二透镜44)进入成像显微物镜6的瞳面，这两个聚焦透镜的f＝30mm。

在一种实施例中，双光子光源1为飞秒激光器，型号为Calmar CFL-05TFF，其发出920nm的飞秒脉冲平行光源，光斑直径为1mm，重复频率80Mhz,脉冲宽度100fs。

第一二向色镜3截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射光学相干层析模块8发出的样品光以及样品9反射的成像光均，且反射双光子光源1发出的飞秒激光。

在一种实施例中，第二二向色镜10截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射双光子光源1发出的飞秒激光、光学相干层析模块8发出的样品光以及样品9反射的成像光，而飞秒激光激发样品9产生的荧光被其反射到双光子荧光成像模块5。

光学相干层析模块8发出的样品光经过慢轴扫描模块7且透射第一二向色镜3，双光子光源1发出的飞秒激光经过快轴扫描模块2后被第一二向色镜3反射，与透射第一二向色镜3的样品光相结合，共同经过共用扫描模块4后透射二向色镜，再经过成像显微物镜6后照射到样品9上进行同步照明成像。双光子光源1发出的飞秒激光激发样品9产生荧光，荧光经过成像显微物镜6后，由第二二向色镜10反射，经成像聚焦透镜51聚焦以及滤光片52滤除杂散光后，由探测器53所接收，进行荧光成像。样品光照射到样品9上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经成像显微物镜6、透射第二二向色镜10、共用扫描模块4、透射第一二向色镜3、慢轴扫描模块7后进入光学相干层析模块8，在光学相干层析模块8中干涉成像。

本发明中通过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方法有效减少***硬件，实现光学相干层析技术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用，达到样品9荧光快速面成像和断层成像的目的。如图3所示为共用扫描模块4的振镜扫描的轨迹图：图3(左)为点共焦扫描轨迹，完成一次扫描时间1/30(Hz)＝33.3(ms)；图3(中)为光学相干层析扫描轨迹图；图中每一条扫描线均对应于点共焦扫描的整幅图像扫描，如图3(右)所示，光学相干层析完整的扫描时间为1/0.1(Hz)＝10s。

光学相干层析模块8包括谱域光学相干层析***或者扫频源光学相干层析***。当采用谱域光学相干层析***时，光学相干层析光源811为宽带光源，比如半导体激光器，半导体激光器的中心波长为830nm，带宽80nm，而采用扫频源光学层析***时，光学相干层析光源811采用扫频源。在本实施例中为谱域光学相干层析***。光学相干层析模块8包括光学相干层析光源、干涉仪、参考臂和探测光路；用于对样品9进行深度成像。当然光学相干层析模块8还可以采用另外的结构形式，比如单耦合器结构或者双耦合器结构或者环形器结构等，形式比较多样化。

在一种实施例中，参照图2，在光学相干层析模块88中，光学相干层析光源811(本实施例中为半导体激光器)发出的光经过20:80的耦合器812后，其中80％的光经过准直器814、补偿镜815，并被平面反射镜816反射后再次由准直器814接收，另外20％的光到达准直器813作为样品光，并从准直器813出射。在干涉仪812处实现参考光与发射至样品9处光束的分离，且在干涉仪812处形成干涉，具体是光学相干层析光源811在干涉仪812处分离，其中干涉仪812为耦合器，耦合器的光束分配比例为20：80，其中80％的光束进入参考臂内，且在参考臂内被原路反射至干涉仪812内，而另外20％的光束作为样品光经过一准直镜813进入慢轴扫描模块7内，具体先射至慢轴扫描振镜71，慢轴扫描振镜71将其反射至慢轴聚焦透镜72，且在聚焦后透射第一二向色镜3进入共用扫描模块4内，依次经过共用扫描模块4的共用扫描振镜41、共用聚焦透镜42和中继透镜组中的第一透镜43和第二透镜44，经过第二二向色镜10后，在成像显微物镜6的作用下聚焦至样品9，样品9反射的成像光将原路返回至干涉仪812处，且与参考臂内反射的参考光产生干涉，干涉光束进入探测光路内。

其中，对于探测光路，其主要包括光栅819以及层析光探测器821，当采用谱域光学相干层析***时，该层析光探测器821为光谱仪，当采用扫频源光学层析***时，层析光探测器821为线阵相机，干涉光束依次经过两个准直镜817(818)以形成平行光束，平行光束经过光栅819时，将各个频谱的光束分离，且通过聚焦透镜820聚焦作用后被层析光探测器821接收。对于参考臂，其主要包括准直镜814、补偿镜815以及反射镜816，三者位于同一光轴上，且沿干涉仪812分出的参考光方向，准直镜814、补偿镜815以及反射镜816依次设置，即参考光依次经过准直镜814、补偿镜815以及反射镜816，且通过反射镜816反射后，参考光依次经过补偿镜815与准直镜814进入干涉仪812内与样品光干涉。

本发明中，双光子光路与共聚焦扫描光路相似，共聚焦通过在探测光路与成像焦点共轭位置加一个针孔以滤除成像焦点以外的杂散光，而双光子只有焦点处能激发荧光，因此无需加针孔就有相似的效果。由于没有加针孔，双光子的探测器53无需置于共轭位置。荧光会在传播过程中被损耗，为了收集更多荧光，本发明中探测器53放置离成像显微物镜6较近的位置，而不是在光源的共轭位置。

本发明中，通过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方法有效减少***硬件，实现光学相干层析技术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用，达到样品9荧光快速面成像和断层成像的目的。

将光学相干层析和双光子荧光成像***相结合时，如果二者的扫描振镜完全独立，则需要四个单独的振镜，***复杂；并且由于没有公共的振镜扫描，二者成像很难完全同步。如果两种成像用同一组振镜，整体的成像速度较慢。以本专利实施方案中的谱域光学相干层析成像为例，光学相干层析在扫描成像时，首先对深度方向进行成像，成像速度由相机的速度决定，本实施方案中相机最大成像速度为200KHz。然后由两个振镜在横向进行二维扫描，横向上一个扫描点所需时间为1/200KHz＝5μs，若横向扫描点为1000×1000，则一次完整的三维扫描最少需要5μs×1000×1000＝5s。双光子荧光成像仅有横向扫描，如本专利实施方案的振镜进行扫描，成像速度较快33.3ms即可完成一次完整的横向二维扫描。若这两种成像方式共用同一组振镜，双光子荧光扫描速度将会被光学相干层析的横向成像速度大大限制。

本发明提出一种两***共用一个扫描振镜，并结合两个单独的扫描振镜实现各自的二维扫描。因此，双光子荧光能维持较快的成像速度，同时有一个共用的振镜将使二者的扫描同步，并且减少了***的硬件。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜；

所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。

2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。

3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。

4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。

5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直；

所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直；

所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。

6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f***，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f***的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f***，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f***的透镜焦点位置。

7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析***或者扫频源光学相干层析***。

8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。

9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光，而飞秒激光激发样品产生的荧光被其反射到所述双光子荧光成像模块。

10.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像***，其特征在于，所述双光子光源为飞秒激光器，其发出920nm的飞秒脉冲平行光源，光斑直径为1mm。