CN109799602A - 一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法，该装置包括：激光发射模块产生非线性的激发脉冲光；线扫描模块获取激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；光学显微模块在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发样品产生发射光信号；同步滤波模块探测样品的发射光信号，并对发射光信号进行滤波；重建模块根据同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取样品的重构图像。本发明可有效地抑制杂散光造成的信号串扰，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、深穿透深度等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

Description

一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法

技术领域

本发明实施例涉及光学技术领域，尤其涉及一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法。

背景技术

光学显微成像具有非侵入式、高灵敏度、高分辨率、成像尺度灵活等优点，已成为生物医学研究必备的技术手段。目前，光学显微成像已不仅应用于生物动态过程研究，还应用于临床疾病诊断等诸多领域。但是，由于生物组织具有各向异性与非均匀性，光在生物组织中传播时将经历随机折射与散射，造成信号串扰，降低成像的信噪比。

为了克服生物组织散射的影响，人们发展了激光扫描共聚焦显微技术，即通过在探测端引入共焦针孔滤除散射引起的杂散光，从而提高了成像的信噪比。但是，由于该技术是基于单光子吸收效应，整个激发光路中都将激发出荧光，造成不容忽视的光毒性。多光子显微技术的出现，巧妙地解决了上述问题。所谓多光子显微技术，是指基于非线性光学效应产生光信号的方法。

与单光子吸收效应不同，非线性光学效应需要瞬间吸收多个光子才能发生，其产生概率非常低，通常仅在聚焦焦点处产生，从而实现局域激发。此外，由于非线性光学效应需要采用更长的波长激发，这不仅降低了光毒性，也可有效地对抗散射，提高成像深度。

常规的多光子显微技术大多采用点扫描方式进行逐点成像，由于扫描元件的机械惯性，其成像速度存在着瓶颈制约。为了提高成像速度，可以借鉴宽场成像的概念，因此出现了时空聚焦技术，即通过时域、空域两个维度对激发光脉冲进行聚焦，实现宽场层析激发。

根据激发区域的形状，时空聚焦显微技术可分为线扫时空聚焦显微和面激发时空聚焦显微。其中，前者在物镜焦面上实现了条形(线)激发，故仅需在与其垂直的方向进行扫描即可进行二维成像，故称为线扫时空聚焦显微。需要指出的是，尽管时空聚焦显微技术基于非线性光学效应实现了深层组织的宽场层析激发，但是其所激发出光信号仍将受到组织散射的影响，造成信号串扰，故在采用宽场探测时成像深度仍将受限。

发明内容

针对上述问题，本发明实施例提供一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法。

第一方面，本发明实施例提供一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置，包括：

激光发射模块，用于产生非线性的激发脉冲光；

线扫描模块，用于获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

光学显微模块，用于在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

同步滤波模块，用于探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

重建模块，用于根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。

第二方面，本发明实施例提供一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像方法，包括：

产生非线性的激发脉冲光；

获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。

本发明实施例提供的一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置及方法，可有效地抑制杂散光造成的信号串扰，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、深穿透深度等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图；

图2为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的原理图；

图3为本发明一实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图；

图4为本发明又一实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图；

图5为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图，如图1所示，该装置包括：激光发射模块101、线扫描模块102、光学显微模块103、同步滤波模块104和重建模块105，其中：

激光发射模块101，用于产生非线性的激发脉冲光；

线扫描模块102，用于获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

光学显微模块103，用于在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

同步滤波模块104，用于探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

重建模块105，用于根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。

激光发射模块101参数非线性的激发脉冲光，线扫描模块102是基于时空聚焦的线扫描***，获取激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得激发脉冲光对样品进行扫描，光学显微模块103在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发样品产生发射光信号，同步滤波模块104探测样品的发射光信号，并对发射光信号进行滤波，同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步，重建模块105根据同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取样品的重构图像。

本发明实施例提供的一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置，可有效地抑制杂散光造成的信号串扰，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、深穿透深度等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

在上述实施例的基础上，优选地，还包括光束变换模块，所述光束变换模块位于所述线扫描模块之前，所述光束变换模块用于调整所述激发脉冲光的光束尺寸。

该光显微成像装置还包括光束变换模块，光束变换模块位于激光发射模块之后，线扫描模块之前，光束变换模块用于调制激发脉冲光的光束尺寸。

在上述实施例的基础上，优选地，所述线扫描模块包括光学衍射元件、透镜和光学扫描元件，所述光学衍射元件位于所述透镜的物方焦面，所述光学扫描元件位于所述透镜的像方焦面，所述光学衍射元件用于获取调整后的激发脉冲光的角色散，所述光学扫描元件用于获取调整后的激发脉冲光的可变偏转角。

具体地，线扫描模块置于光束变换模块之后，具体包括光学衍射元件、透镜和光学扫描元件，光学衍射元件及光学扫描元件分别置于透镜的物方焦面与像方焦面；光学衍射元件用于引入激发脉冲光束的角色散，光学扫描元件用于引入激发脉冲光束的可变偏转角；

光学显微模块置于上述光学扫描元件之后，包括透镜组及显微物镜，由透镜组连接上述光学扫描元件及显微物镜后入瞳面，并构成4f***，用于在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以激发组织样品并基于非线性光学效应产生发射光信号；

同步滤波模块，置于基于时空聚焦的线扫描***中发射光信号经显微物镜收集并反向传输的光学扫描元件之后，包括滤波片、二维探测器，用于选出样品的发射光信号并进行光信号探测；其中，二维探测器的信息获取与基于时空聚焦的线扫描***的触发信号同步。

重建模块将二维探测器所探测的信息进行计算重建，恢复出高质量信号。

进一步地，激光发射模块为超短脉冲激光光源，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿***，用于预补偿超短脉冲在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

进一步地，基于时空聚焦技术的线扫描***还包括置于光学衍射元件沿激发光传播方向经透镜后的傅里叶面处的自适应光学元件，用于进行光谱相位整形，进一步克服生物样品散射对层析激发质量的影响。

超短脉冲激光光源及光束变换模块中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，可选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源。

超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，可选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源。

光束变换模块为伽利略望远镜***或开普勒望远镜***。

超短脉冲激光光源及光束变换模块提供产生非线性光学信号的激发光中非线性光学信号通过双光子吸收荧光效应、三光子吸收荧光效应、双光子激发-荧光共振能量转移效应、二次谐波产生效应、三次谐波产生效应、受激拉曼散射效应或相干反斯托克斯拉曼散射效应中的任一种产生。

线扫描模块中，光学衍射元件可选用光栅、变形镜、空间光调制器或其他光学衍射元件；光学扫描元件选用振镜、多面镜或声光调制器等。

同步滤波模块中，滤波片选用二色镜、带通滤波片、低通滤波片或长通滤波片。

二维面探测器置于生物样品激发面的共轭面，其在聚焦线垂直方向的宽度由样品共轭像的设计尺寸决定。

二维面探测器选用电荷耦合元件(CCD)、电子倍增电荷耦合元件(EMCCD)或科学级互补金属氧化物半导体器件(sCMOS)等。

图2为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的原理图，图2a所示为线扫时空聚焦的激发效果图，其中上半部分的横线为聚焦线，底图为神经元细胞的示意图。图2b对原始信号分布、经散射后信号分布及采用常规探测方案、本发明所提出的扩展探测及计算重建进行了说明。

具体如下：利用非线性光学效应并结合时空聚焦技术(美国发明专利US20080151238A1)可在生物样品上产生具有高轴向分辨率的聚焦线(x方向)，所激发的光信号在二维光电探测面(S_x,S_y)上成像，其中S_y方向即为聚焦线的垂直方向。通过在样品的y方向进行扫描，并进行同步扩展探测(与常规探测方案不同，此处为二维探测)，可获得样品在激发线上所产生的光信号。

对该二维信息进行计算重建，可恢复出样品中沿激发线上的高质量信号。改变振镜的偏转角，可获得纵向(y轴)不同位置处的光信号。此外，利用该技术的轴向层析能力进行轴向扫描(即改变移动样品与显微物镜的相对位置)，可获得样品不同深度的光信号；进一步地，利用该技术的高速显微成像能力进行延时信息采集(即采集不同时刻的动态信息)，可获得样品的(x,y,z,t)四维信息。

本发明实施例所提出的一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置可有效地抑制杂散光造成的信号串扰，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、深穿透深度等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

图3为本发明一实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图，如图3所示，该装置包括激光发射模块301、光束变换模块、线扫描模块、光学显微模块、同步滤波模块、重建模块，样品放置在样品台315上。

其中，激光发射模块301采用飞秒激光器(如Coherent Chameleon Discovery系列)，光束变换模块采用由透镜302和柱透镜303构成的开普勒望远镜***(为4f***)；线扫描模块包括透射光栅304、透镜305和扫描振镜307；光学显微模块包括两个透镜308、309和显微物镜310；同步滤波模块包括二色镜306，低通滤波片311，透镜312和二维面探测器313(采用sCMOS或EMCCD)。

上述元器件的相对位置关系为：

透镜302与柱透镜303构成4f***进行扩束，透射光栅304置于柱透镜303的像面处，透镜305将透射光栅304成像在扫描振镜307处，透镜308与309构成4f***使得扫描振镜307与显微物镜310的入瞳面共轭，透镜312与透镜308构成4f***使得物面成像在二维面探测器313。

图3中还示意出了计算机314，用于控制扫描振镜307的偏转角度，并对二维面探测器313采集到的二维信息进行计算重建。

该实施例中超短脉冲激光光源301所发出的激光束经透镜302、柱透镜303扩束(改变激光束的直径)后入射到透射光栅304，在透射光栅304的作用下该超短脉冲光束产生角色散(目的是使得该引入角色散的光束经后续光学元件后充满物镜的后焦面)，经透镜305准直后透过二色镜306投射到扫描振镜307上并引入可变偏转角(该偏转角由振镜驱动电压驱动，根据扫描区域设定偏转角度)，最后经由透镜308、309及显微物镜310在生物样品中的物镜焦面上产生聚焦线。

由非线性光学效应所产生的光信号经显微物镜310收集后反向传输，依次经过透镜309、308及扫描振镜307，并被二色镜306反射。之后，该信号光束依次经过低通滤波片311、透镜312，最后进入二维面探测器313进行二维信号探测，由计算机314进行计算重建恢复出一维信息。

需要注意的是，扫描振镜307的行扫描触发信号与二维面探测器313的帧触发信号同步。

采用上述技术方案，可获得生物样品沿聚焦线的信息。驱动扫描振镜307进行纵向(y轴)扫描，可获得生物样本在聚焦面内的二维信息。

通过移动显微物镜310进行轴向扫描，可获得样品三维不同深度处的信息。若进行延时信息采集，可获得样品的(x,y,z,t)四维信息。

图4为本发明又一实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置的结构示意图，如图4所示，图4中与图3的区别在于增设了自适应光学元件以提高聚焦线的质量。

本实施例装置包括激光发射模块及光束变换模块、线扫描模块、光学显微模块、同步滤波模块、重建模块，生物样品放置在样品台420上；其中，激光发射模块401采用飞秒激光器(如Coherent Chameleon Discovery系列)，光束变换模块采用由透镜402和柱透镜403构成的开普勒望远镜***(为4f***)；

基于时空聚焦的线扫描模块包括透射光栅404，五个透镜405、407、408、410、411，设置于透镜405和407之间的自适应光学元件406(本实施例采用空间光调制器)，扫描振镜412；光学显微模块包括两个透镜413、414，显微物镜415；同步滤波模块包括二色镜409，低通滤波片416，普通透镜417，二维面探测器418(采用sCMOS或EMCCD)。

上述元器件的相对位置关系为：

透镜402与柱透镜403构成4f***进行扩束，透射光栅404置于柱透镜403的像面处，透镜405将透射光栅404成像在空间光调制器406处，透镜407与408、透镜410与411、透镜413与414分别构成3组串联的4f***使得空间光调制器406与扫描振镜412及显微物镜415的入瞳面共轭，透镜417与410构成4f***使得物面成像在二维面探测器418。

图4中还示意出了计算机419，用于控制扫描振镜412的偏转角度，并对二维面探测器418采集到的二维信息进行计算重建。

该实施例中，激光发射模块401所发出的激光束经透镜402、柱透镜403扩束后入射到透射光栅404，在透射光栅404的作用下该超短脉冲光束产生角色散，经透镜405准直后投射到空间光调制器406进行光谱相位整形，以进一步克服组织散射的影响，之后依次经过透镜407、透镜408、二色镜409、透镜410、透镜411在扫描振镜412上引入可变偏转角，最后经由透镜413、414及显微物镜415在生物样品中的物镜焦面上产生聚焦线。

由非线性光学效应所产生的光信号经显微物镜415收集后反向传输，依次经过透镜414、透镜413、扫描振镜412、透镜411、透镜410，并被二色镜409反射。

之后，该信号光束依次经过低通滤波片416、透镜417，最后进入二维面探测器418进行二维信号探测，由计算机419进行计算重建恢复出一维信息。

需要注意的是，扫描振镜412的行扫描触发信号与二维面探测器419的帧触发信号同步；空间光调制器406是采用自适应光学方法测量波前畸变并施加补偿波前，确保聚焦线的高轴向分辨率。采用上述技术方案，可获得生物样品沿聚焦线的信息。

驱动扫描振镜412进行纵向(y轴)扫描，可获得生物样本在聚焦面内的二维信息。通过移动显微物镜415进行轴向扫描，可获得样品三维不同深度处的信息。

若进行延时信息采集，可获得样品的(x,y,z,t)四维信息。

实际实验中，考虑到所需激发光功率可能大于空间光调制器的光损伤阈值，还可能需要在空间光调制器406之前增加透镜组，使得光束在垂直于光谱扩展的方向上展开至光强低于空间光调制器的光损伤阈值及以下。

图5为本发明实施例一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像方法的流程图，如图5所示，该方法包括：

S1，产生非线性的激发脉冲光；

S2，获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

S3，在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

S4，探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

S5，根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。

本发明实施例提出的一种提高线扫时空聚焦显微成像深度的方法，具体包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴(设定激光聚焦所形成的激发线方向为横向，即x轴；扫描方向为纵向，即y轴)，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定成像采集周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的激发线(沿x方向，通过改变振镜的偏转角可实现聚焦线的y方向扫描)；

4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出光信号，该光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经由振镜后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光；

5)通过置于样品中聚焦线的共轭位置处的面阵探测器进行扩展探测，即对激发线上所产生的光信号进行(S_x,S_y)二维探测；

6)将所探测的(S_x,S_y)二维信息进行计算重建；

7)根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品不同纵向(y轴)位置处的光信号，直至扫描遍历XY目标区域；其中，面阵探测器与振镜的触发信号同步；

8)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得不同深度(z轴)位置处的光信号，直至扫描遍历XYZ目标区域；当前扫描周期结束，执行步骤9)；

9)根据设定的成像采集周期重复步骤3)-步骤6)进行延时显微成像，直至达到设定的扫描总时长，完成线扫描时空聚焦显微成像。

本发明实施例提供的一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像方法，可有效地抑制杂散光造成的信号串扰，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、深穿透深度等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。

通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到各实施方式可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件。基于这样的理解，上述技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如ROM/RAM、磁碟、光盘等，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行各个实施例或者实施例的某些部分所述的方法。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像装置，其特征在于，包括：

激光发射模块，用于产生非线性的激发脉冲光；

线扫描模块，用于获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

光学显微模块，用于在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

同步滤波模块，用于探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

重建模块，用于根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。

2.根据权利要求1所述装置，其特征在于，还包括光束变换模块，所述光束变换模块位于所述线扫描模块之前，所述光束变换模块用于调整所述激发脉冲光的光束尺寸。

3.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述线扫描模块包括光学衍射元件、透镜和光学扫描元件，所述光学衍射元件位于所述透镜的物方焦面，所述光学扫描元件位于所述透镜的像方焦面，所述光学衍射元件用于获取调整后的激发脉冲光的角色散，所述光学扫描元件用于获取调整后的激发脉冲光的可变偏转角。

4.根据权利要求3所述装置，其特征在于，所述线扫描模块还包括自适应光学元件，所述自适应光学元件位于所述透镜之前，用于对调整后的激发脉冲的光谱相位进行整形。

5.根据权利要求3所述装置，其特征在于，所述光学显微模块包括透镜组和显微物镜，所述透镜组构成4f***，并且所述光学扫描元件与所述光学显微镜的入瞳面共轭。

6.根据权利要求5所述装置，其特征在于，还包括：色散预补偿模块，所述色散预补偿模块用于补偿所述激发脉冲光到达所述显微物镜聚焦面前所累积的色散。

7.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述激光发射模块为飞秒脉冲激光器或皮秒脉冲激光器。

8.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述光束变换模块为伽利略望远镜或开普勒望远镜。

9.一种基于线扫描时空聚焦的光显微成像方法，其特征在于，包括：

产生非线性的激发脉冲光；

获取所述激发脉冲光的角色散和偏转角，并使得所述激发脉冲光对样品进行扫描；

在所述样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以基于非线性光学效应激发所述样品产生发射光信号；

探测所述样品的发射光信号，并对所述发射光信号进行滤波，所述同步滤波模块的触发信号和所述线扫描模块的触发信号同步；

根据所述同步滤波模块探测到的发射光信号进行二维重建，获取所述样品的重构图像。