CN109868260A - 一种car-t细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CAR‑T细胞的制备方法，其包括：采集供者的外周血单个核细胞；分选出CD3+T淋巴细胞，并进行激活培养；将带有目的基因的慢病毒载体感染激活的T淋巴细胞，并在转染时添加了一定比例的DMSO；转染后换液，并继续对转染后的T细胞进行扩增培养，获得CAR‑T细胞终产品。本发明在病毒载体转染步骤中，添加适量的DMSO，显著地降低了病毒转染所需的MOI，从而降低病毒的用量，提高了CAR‑T细胞的转染效率，大大降低了制备成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种CAR-T细胞的制备方法。
背景技术
CAR-T技术，即Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。目前在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
CART细胞制备的一般过程，包括从富含免疫细胞的血样采集，T细胞的分选与激活，T细胞的转染，T细胞的扩增，最终制剂的制备。其中，将目标基因转导进入T细胞的转染过程，大多采用慢病毒(Lentivirus)感染的方式。由于慢病毒性状的特点，稳定、可靠、大量的慢病毒制备现在是CAR-T细胞制备领域的一项瓶颈。
如何能显著降低T细胞制备病毒转染过程中病毒的用量，从而提升制备效率、显著降低CAR-T细胞生产成本，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种CAR-T细胞的制备方法，通过降低感染时的MOI(multiplicity of infection，感染复数)方式，大大降低病毒载体的用量，由此显著提升T细胞感染后的CAR的表达比例。大大降低了CAR-T细胞制备过程中，病毒载体制备的压力，节省了制备成本。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)采集供者的外周血单个核细胞；
2)从步骤1)采集的外周血单个核细胞中分选出CD3+T淋巴细胞；
3)对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％；
4)将带有目的基因的慢病毒载体感染经过步骤3)激活培养后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，且转染时在培养基中按照每100ml培养基添加0.1-5ml的比例添加DMSO；
5)对经步骤4)转染后的T淋巴细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，获得CAR-T细胞终产品。
上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤2)中分选后的CD3+T淋巴细胞含量需达到5.0-10×106/kg以上。
上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤3)中T淋巴细胞激活培养24-36小时后进行所述步骤4)。
上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤4)转染时，T淋巴细胞的密度控制在10-100万细胞/ml。
上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤4)病毒感染的时间为18-36小时。
上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤5)所述回输要求为T细胞比例不低于60％，CAR-T细胞比例不低于2％。
本发明在CAR-T细胞制备过程中，将目的CAR基因转导到T细胞时，在转导培养基中添加一定量的DMSO，通过降低感染时的MOI方式，大大降低病毒载体的用量。
DMSO(二甲基亚砜)，是一种两性化合物，分子包括极性的母体和两个非极性基团。对细胞生理状态，以及病毒感染细胞的影响是很复杂的。有研究认为，DMSO可以使细胞周期捕获，例如DMSO可逆地使人淋巴细胞捕获在G1期，从而抑制IL-6诱导的细胞分化作用。DMSO可以恢复细胞培养中细胞接触抑制引起的细胞生长停止和抑制细胞密度依赖性凋亡的发生。在一些骨髓细胞中，DMSO是一种很好的细胞分化诱导因子，可诱导许多细胞可逆性地捕获在G1期。另外，DMSO还可保护CHO细胞免于热或超热中子诱导的细胞死亡和突变。DMSO对抑制细胞的凋亡也是有作用的。但到目前为止，未发现对DMSO影响病毒感染的报道。
本发明在利用慢病毒制备CAR-T细胞的过程中，其中，在病毒载体转染步骤中，添加适量的DMSO，显著地降低了病毒转染的MOI，从而降低了病毒的用量，提高了CAR-T细胞的转染效率，以及降低了制备成本。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞，即分选得到的CD3+T淋巴细胞含量需达到5.0-10×106/kg以上。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为50:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，且转染时在培养基中按照每100ml培养基添加1ml的比例添加DMSO，；转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.2×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为3.5×107，培养第三天后细胞数量为1.2×108，培养第4天后细胞数量为1.9×108，培养第5天后细胞数量为5.8×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为32.3％，转染后培养第3天为45.5％，转染后培养第4天为66.2％，转染后培养第5天为69.3％。
实施例2
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，起始细胞数量为1.2×108，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为10:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，且转染时在培养基中按照每100ml培养基添加1ml的比例添加DMSO；转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.2×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为3.7×107，培养第三天后细胞数量为1.3×108，培养第4天后细胞数量为2.0×108，培养第5天后细胞数量为6.0×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为20.5％，转染后培养第3天为33.5％，转染后培养第4天为65.3％，转染后培养第5天为66.0％。
对照组1
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，起始细胞数量为1.2×108，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为50:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％；转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.0×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为3.7×107，培养第三天后细胞数量为1.48×108，培养第4天后细胞数量为2.3×108，培养第5天后细胞数量为6.0×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为23.5％，转染后培养第3天为37.5％，转染后培养第4天为63.4％，转染后培养第5天为60.0％。
对照组2
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，起始细胞数量为1.2×108，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为10:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.5×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为4.5×107，培养第三天后细胞数量为1.9×108，培养第4天后细胞数量为2.5×108，培养第5天后细胞数量为6.5×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为13.5％，转染后培养第3天为23.5％，转染后培养第4天为30.5％，转染后培养第5天为39.3％。
阳性对照组1
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，起始细胞数量为1.2×108，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为50:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，并在培养液中加入助转剂Polybrene(聚凝胺)至终浓度为7.5μg/ml；转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.1×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为2.8×107，培养第三天后细胞数量为0.8×108，培养第4天后细胞数量为1.5×108，培养第5天后细胞数量为3.8×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为26.5％，转染后培养第3天为39.0％，转染后培养第4天为65.2％，转染后培养第5天为62.1％。
阳性对照组2
采集供者的外周血单个核细胞，将一定量的免疫微球磁珠，如结合了CD3/CD28的Dynabeads添加到外周血单个核细胞中，从而分选得到高纯度的CD3+T淋巴细胞。对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，起始细胞数量为1.2×108，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。激活培养48小时后，将带有目的基因的慢病毒载体按照MOI为10:1的比例感染激活后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，并在培养液中加入助转剂Polybrene(聚凝胺)至终浓度为7.5μg/ml；转染12-36小时后换液，此时细胞数量为4.1×107，继续对转染后的T细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，培养第1天后细胞数量为2.8×107，培养第三天后细胞数量为1.0×108，培养第4天后细胞数量为1.6×108，培养第5天后细胞数量为3.8×108。
经检测，转染后的CAR-T细胞比例依次为：转染后培养第1天为19.9％，转染后培养第3天为30.6％，转染后培养第4天为45.5％，转染后培养第5天为49.1％。
Polybrene是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。通过上述阳性对照组1和2可以看到，Polybrene使CAR-T比例上升的作用非常有限，并且其细胞毒性比较大，影响细胞扩增的速率，且去除也很麻烦，同时Polybrene也是一种多聚物，成分并非单一。
从上述实验结果来看，尽管Polybrene对促进CAR-T的细胞转染有一定的效果，但其效果与DMSO促进细胞转染的效果相比，非常有限。采用Polybrene最终制备的CAR-T细胞比例明显不如DMSO实验组。
从实验结果中还可以看出DMSO能够降低转染的MOI，降低制备中病毒使用量(病毒生产时限速步骤)，而Polybrene是不具有降低病毒转染MOI作用。
综上所述，由于DMSO使用安全，对CAR-T产业化具有很大的实际意义。
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。
Claims (6)
1.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集供者的外周血单个核细胞；
2)从步骤1)采集的外周血单个核细胞中分选出CD3+T淋巴细胞；
3)对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％；
4)将带有目的基因的慢病毒载体感染经过步骤3)激活培养后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO2浓度为5％，且转染时在培养基中按照每100ml培养基添加0.1-5ml的比例添加DMSO；
5)对经步骤4)转染后的T淋巴细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5％，获得CAR-T细胞终产品。
2.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤2)中分选后的CD3+T淋巴细胞含量需达到5.0-10×106/kg以上。
3.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤3)中T淋巴细胞激活培养24-36小时后进行所述步骤4)。
4.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)转染时，T淋巴细胞的密度控制在10-100万细胞/ml。
5.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)病毒感染的时间为18-36小时。
6.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤5)所述回输要求为T细胞比例不低于60％，CAR-T细胞比例不低于2％。
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