CN109868246B - 一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法 - Google Patents
一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。本发明包括以下步骤:首先利用碱性蛋白酶酶解林蛙油制备林蛙油酶解液,并按照林蛙油酶解液20%‑30%,海藻糖15%‑25%,抗坏血酸3%‑5%的比例配制冻干保护剂,然后将培养离心获得的罗伊氏乳杆菌菌体加入到配制好并除菌的冻干保护剂中混匀,其中菌体与保护剂的体积质量比为1:1‑10,最终将混匀后的菌悬液真空冷冻干燥。使用该冻干保护剂,罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的存活率在60%以上。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。
背景技术
乳酸菌作为一种重要的益生菌,近些年来被广泛的应用于食品、医药、养殖等行业中。本专利选取的罗伊氏乳杆菌属于太空诱变菌株,经研究后表明该菌株的抗冻性以及贮藏过程中稳定性较差,但具有保护胃黏膜、调节肠道菌群以及抗炎抗过敏的作用。目前在婴幼儿和成人保健食品、功能性固体饮料以及营养食品中均有应用。
林蛙油是一种传统的保健食品,含有丰富的蛋白质、α-亚麻酸、亚油酸和油酸等成分,具有抗疲劳、抗衰老和调节内分泌的功效。林蛙油溶于水后粘度和流动性较差,不利于食用和吸收。利用酶解法水解林蛙油制备林蛙油肽,既改善了林蛙油的溶解性,又提高了林蛙油的功能性。
目前乳酸菌菌粉主要通过真空冷冻干燥的方法制备,真空冷冻干燥技术可以降低酶的活性和菌体的死亡率,充分去除菌体中的水分便于菌粉的运输和保存。但有研究表明冻干过程中形成的冰晶会破坏菌体细胞的细胞膜和磷脂分子层,膜内物质外流,膜内外渗透压失衡,最终导致菌体死亡。真空冷冻干燥过程中压强和温度改变也会破坏蛋白质和DNA的空间构型,导致菌体复水后生理活性下降甚至菌体的死亡。
菌种的冻干保护剂可以降低冻干过程对菌体的伤害,通过与磷脂双分子层或者膜蛋白的结合弱化冰晶对菌体的破坏,也可以通过转变膜脂质等成分的相转变温度来抑制冰晶的形成。目前益生菌适用的冻干保护剂主要有蛋白质类、糖类、醇类、氨基酸、抗坏血酸等,但目前还未能检索到使用林蛙卵蛋白水解物和真菌提取物作为保护剂的文献。本专利使用林蛙卵蛋白水解物和猴头菇提取物作为罗伊氏乳杆菌的冻干保护剂,对罗伊氏乳杆菌太空诱变菌株具有较好的保护作用,并同时提高了其在贮藏过程中的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。本发明能有效提高罗伊氏乳杆菌冻干后的存活率和生物活性。
本发明第一方面提供了一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法,主要包括以下组分:林蛙油酶解液、海藻糖、抗坏血酸。
在本发明的一实施方案中,所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂包括以下比例的成分:林蛙油酶解液20%-30%,海藻糖15%-25%,抗坏血酸3%-5%。
优选的所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂,包括以下组分:林蛙油酶解液25%,海藻糖20%,抗坏血酸3%。
本发明第二方面提供了一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的制备方法,包括以下步骤:制备林蛙油酶解液,称量各组分配制冻干保护剂。
按1:20的比例向精选林蛙油中加入蒸馏水,浸泡溶胀一定时间,匀浆后按0.5%加入碱性蛋白酶,酶解时间一定时间后,85℃20分钟灭酶,3000r/min20分钟离心分离,上清液活性炭吸附(40℃,2%的活性炭处理1h),过滤冷却,即得林蛙油酶解液。
将称好的林蛙油酶解液、海藻糖、抗坏血酸充分溶解于pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,然后使用微滤膜除菌,备用。
在本发明的一实施方案中,所述冻干保护制备方法步骤中,pH=6.5的磷酸盐缓冲液为4℃。
在本发明的一实施方案中,所述冻干保护制备方法步骤中,微滤膜的孔径为0.2μm。
本发明第三方面提供了如权利1要求所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂、如权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂的制备方法在制备罗伊氏乳杆菌冻干菌粉中的应用。
在本发明的一实施方案中,所述的罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备包括以下步骤:将罗伊氏乳杆菌活化、培养,离心得到菌泥,按照菌泥与冻干保护剂1:1-10的重量体积比加入冻干保护剂混合均匀,真空冷冻干燥,得到罗伊氏乳杆菌冻干菌粉。
优选的,所述菌体与保护剂的质量体积比为1:8。
下面结合具体实例对本发明进行详尽的描述,应当指出,本发明是范例性的,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明原理和范围的条件下对本发明技术方案的细节和进行修改或者替换,这些修改和替换也视为本发明的保护范围。本发明中无特殊说明的试剂和设备都源于市售。
本发明提供的一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法,主要包括以下组分:
按菌泥质量8倍的体积数配制保护剂,其中林蛙油酶解液20%-30%,海藻糖15%-25%,抗坏血酸3%-5%。
本发明提供的一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法,其方法主要包括以下步骤:
按1:20的比例向精选林蛙油中加入蒸馏水,浸泡溶胀一定时间,匀浆后按0.5%加入碱性蛋白酶,酶解时间一定时间后,85℃20分钟灭酶,3000r/min20分钟离心分离,上清液活性炭吸附(40℃,2%的活性炭处理1h),过滤冷却,即得林蛙油酶解液。
将称好的林蛙油酶解液、海藻糖、抗坏血酸充分溶解于pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,然后使用微滤膜除菌,备用。
离心后的菌泥按照质量体积比1:8与冻干保护剂混合均匀,用于罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备。
具体实施方式
实施例1
1、罗伊氏乳杆菌的培养
(1)从-80℃的冰箱里取出冻存的罗伊氏乳杆菌(来自于实验室的太空诱变菌种罗伊氏乳杆菌F-9-35),以2%的比例里接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(2)将活化后的罗伊氏乳杆菌F-9-35平板划线,37℃恒温箱培养20h。
(3)挑取平板划线后的单菌落接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(4)以3%的比例将步骤(3)中的菌液接种于100ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
(5)以3%的比例将步骤(4)中的菌液接种于900ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
2、罗伊氏乳杆菌保护剂的配制
将15g海藻糖、3g抗坏血酸、20ml的林蛙油酶解液充分溶解于100ml 4℃pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,0.2μm的微滤膜除菌,备用。
3、菌体与保护剂的混合
(1)将步骤1中的900ml菌液均分在6个离心瓶中,调整参数:转速为6000g,时间为10min,温度为4℃。
(2)离心结束后将培养基倒出,按照菌体质量8倍的体积数加入含有15%海藻糖,3%抗坏血酸和20%林蛙油酶解液的保护剂,混合均匀得到菌悬液,吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N0。
3、真空冷冻干燥
吸取1ml菌悬液于冻干瓶中,厚度约为0.8cm,将冻干瓶置于-80℃条件下预冻2h,之后将其放入冻干机中真空冷冻干燥12h,冻干后的菌粉加入与冻干前等体积的生理盐水复溶,之后吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N1。
4、冻干结果
冻干存活率=N0/N1(N0和N1的单位均为cfu/ml)
冻干前的菌数N0=1.71*1010,冻干后的菌数N1=8.8*109,罗伊氏乳杆菌的存活率为51%。
实施例2
1、罗伊氏乳杆菌的培养
(1)从-80℃的冰箱里取出冻存的罗伊氏乳杆菌(来自于实验室的太空诱变菌种罗伊氏乳杆菌F-9-35),以2%的比例里接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(2)将活化后的罗伊氏乳杆菌F-9-35平板划线,37℃恒温箱培养20h。
(3)挑取平板划线后的单菌落接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(4)以3%的比例将步骤(3)中的菌液接种于100ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
(5)以3%的比例将步骤(4)中的菌液接种于900ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
2、罗伊氏乳杆菌复配保护剂的配制
将20g海藻糖、3g抗坏血酸、25ml的林蛙油酶解液充分溶解于100ml 4℃pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,0.2μm的微滤膜过滤除菌,备用。
3、菌体与保护剂的混合
(1)将步骤1中的900ml菌液均分在6个离心瓶中,调整参数:转速为6000g,时间为10min,温度为4℃。
(2)离心结束后将培养基倒出,按照菌体质量8倍的体积数加入含有20%海藻糖,3%抗坏血酸和25%林蛙油酶解液的保护剂,混合均匀得到菌悬液,吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N0。
3、真空冷冻干燥
吸取1ml菌悬液于冻干瓶中,厚度约为0.8cm,将冻干瓶置于-80℃条件下预冻2h,之后将其放入冻干机中真空冷冻干燥12h,冻干后的菌粉加入与冻干前等体积的生理盐水复溶,之后吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N1。
4、冻干结果
冻干存活率=N0/N1(N0和N1的单位均为cfu/ml)
冻干前的菌数N0=1.9*1010,冻干后的菌数N1=1.2*1010,罗伊氏乳杆菌的存活率为63.2%。
实施例3
1、罗伊氏乳杆菌的培养
(1)从-80℃的冰箱里取出冻存的罗伊氏乳杆菌(来自于实验室的太空诱变菌种罗伊氏乳杆菌F-9-35),以2%的比例里接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(2)将活化后的罗伊氏乳杆菌F-9-35平板划线,37℃恒温箱培养20h。
(3)挑取平板划线后的单菌落接种于5ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养12h。
(4)以3%的比例将步骤(3)中的菌液接种于100ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
(5)以3%的比例将步骤(4)中的菌液接种于900ml的MRS培养基中,37℃恒温箱培养10h。
2、罗伊氏乳杆菌复配保护剂的配制
将25g海藻糖、4g抗坏血酸、20ml的林蛙油酶解液充分溶解于100ml 4℃pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,0.2μm的微滤膜除菌,备用。
3、菌体与保护剂的混合
(1)将步骤1中的900ml菌液均分在6个离心瓶中,调整参数:转速为6000g,时间为10min,温度为4℃。
(2)离心结束后将培养基倒出,按照菌体质量8倍的体积数加入含有25%海藻糖,4%抗坏血酸和20%林蛙油酶解液的保护剂,混合均匀得到菌悬液,吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N0。
3、真空冷冻干燥
吸取1ml菌悬液于冻干瓶中,厚度约为0.8cm,将冻干瓶置于-80℃条件下预冻2h,之后将其放入冻干机中真空冷冻干燥12h,冻干后的菌粉加入与冻干前等体积的生理盐水复溶,之后吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释,选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数,每个梯度三个平板,记为初始菌数N1。
4、冻干结果
冻干存活率=N0/N1(N0和N1的单位均为cfu/ml)
冻干前的菌数N0=1.9*1010,冻干后的菌数N1=1.2*1010,罗伊氏乳杆菌的存活率为63.2%。
Claims (5)
1.一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法,其特征在于,包括以下组分:林蛙油酶解液,海藻糖,抗坏血酸,所述的林蛙油酶解液是以1:20的比例向林蛙油中加入蒸馏水,浸泡溶胀一定时间,匀浆后按0.5%加入碱性蛋白酶,酶解一定时间后,85℃20分钟灭酶,3000r/min20分钟离心分离,上清液在40℃,2%的活性炭吸附处理1h,过滤冷却即得。
2.如权利要求1 所述的一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法,其特征在于,包括以下比例:林蛙油酶解液20%-30%,海藻糖15%-25%,抗坏血酸3%-5%。
3.一种林蛙油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以1:20的比例向林蛙油中加入蒸馏水,浸泡溶胀一定时间,匀浆后按0.5%加入碱性蛋白酶,酶解一定时间后,85℃20分钟灭酶,3000r/min20分钟离心分离,上清液在40℃,2%的活性炭吸附处理1h,过滤冷却,即得林蛙油酶解液;
(2)按照比例配制冻干保护剂,将称好的林蛙油酶解液、海藻糖、抗坏血酸充分溶解于pH=6.5的磷酸盐缓冲液中,然后使用微滤膜除菌,备用,所述微滤膜的孔径为0.2μm。
4.如权利要求1 所述 的林蛙卵油酶解液对罗伊氏乳杆菌的保护方法或如权利要求3所述的林蛙卵油酶解液对罗伊氏乳杆菌冻干保护的制备方法在制备罗伊乳杆菌冻干菌粉中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:将罗伊氏乳杆菌活化、培养,离心得到菌泥,按照菌泥与冻干保护剂1:1-10的重量体积比加入冻干保护剂混合均匀,真空冷冻干燥,得到罗伊氏乳杆菌冻干菌粉。
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GR01 | Patent grant | ||
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