CN109867644B

CN109867644B - 一种苯醌类化合物及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN109867644B
Application number: CN201810098900.2A
Authority: CN
Inventors: 曾小斌; 李华英; 万浩强; 李洁媚; 葛兰兰; 朱富强; 周伯平
Original assignee: Shenzhen Bainuo Kantai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Bainuo Kantai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN109867644A

Abstract

本发明提供了一种苯醌类化合物，其具有以下结构式：

JNU‑144。本发明还提供了该苯醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，以及该苯醌类化合物的制备方法。本发明所提供的技术方案成功地从新疆紫草根中提取出具有抗肿瘤活性的天然化合物，即化合物JNU‑144；本发明还提供了该化合物JNU‑144在制备抗肿瘤药物中的应用，并证明了其医学临床用途的可行性与有效性；特别是，化合物JNU‑144能够为肝癌及其它肿瘤转移患者提供新的治疗药物及治疗途径，该化合物JNU‑144具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有广阔的应用前景。

Description

一种苯醌类化合物及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及一种苯醌类化合物，并涉及该苯醌类化合物的制备方法，还涉及该苯醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。众所周知，癌症是危害人类生命健康的重大疾病之一，据最新WHO统计，仅2012年世界范围内约有820万人死于癌症，其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。近年来，肿瘤的术前或放疗前化学治疗的引入越来越受国内外学者的重视，随着肿瘤治疗学的日趋完善以及化疗新药不断产生，人们逐渐认识到化学治疗在癌症治疗中的重要地位，辅助性化疗及同步放化疗已成癌症治疗不可或缺的重要治疗手段。化学治疗虽能降低癌症死亡率，但现有的抗肿瘤药往往在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有较大的杀伤性，从而导致毒副反应较大，因此，肿瘤仍然是严重威胁人们生命和生活质量的疾病之一。于是，面对如此严峻的现实问题，长期以来，各国的政府部门、研究机构、制药企业一直对恶性肿瘤的治疗方法和抗肿瘤药物的研究开发高度重视，并不惜投入巨额资金。其中，天然药物在此领域具有重要价值并能够形成自主知识产权。

新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnst]为紫草科多年生草本植物，中医中药认为新疆紫草有清热凉血、活血解毒、透疹消斑之功效，临床上常用于治疗血热毒症、烧伤、斑疹紫黑、麻疹不透、热病斑疹、湿疹、血淋、血痢、疮疡、丹毒等。现代药理学研究表明新疆紫草具有杀菌抗炎、抗HIV、抗肿瘤、延缓衰老、免疫调节等作用。从新疆紫草中纯化得到的紫草素，在50mg/kg可完全抑制腹水型肉瘤180细胞的生长，10mg/kg可延长带瘤小鼠生命92.5％。萘醌和混源萜化合物能影响白血病、人黑色素瘤、子***、结肠癌、人绒毛膜癌、乳腺癌等恶性肿瘤的生长增殖和侵袭迁移。另外，紫草素能增强小鼠肝癌H22和Lewis肺癌的放疗敏感性和逆转胶质母细胞瘤的耐药性；机理研究表明，紫草素通过抑制自噬诱导非小细胞肺癌死亡。

发明内容

本发明旨在提供一种全新的天然化合物，该天然化合物为一种苯醌类化合物，表现出优异的抗肿瘤活性。

具体地，本发明第一方面提供了一种苯醌类化合物，其具有以下结构式：

并且，该化合物的结构经检测确定为2-methoxy-Arnebinone B，因此被命名为化合物JNU-144。

本发明第二方面提供了第一方面所述的苯醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，在所述应用中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、白血病、脑瘤、皮肤癌。

并且，所述苯醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用可以包括：用于制备***的产品(如药物、药物制剂、药物组合物)，用于制备诱导肿瘤细胞凋亡的产品(如药物、药物制剂、药物组合物)，用于制备抑制肿瘤细胞增殖的产品(如药物、药物制剂、药物组合物)，用于制备抑制肿瘤细胞侵袭迁移的产品(如药物、药物制剂、药物组合物)，用于制备抑制mTOR活性的产品(如药物、药物制剂、药物组合物)。

本发明第三方面提供了第一方面所述的苯醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：在室温下，用95％乙醇对新疆紫草根进行多次冷浸、渗漉提取，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏；

S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得氯仿浸膏AEC，乙酸乙酯浸膏AEE，正丁醇浸膏AEB；

S3：将所述氯仿浸膏AEC用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶进行拌样后，装柱，上样，再依次用环己烷、体积比为50：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为25：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为10：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为5：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为1：1的环己烷-乙酸乙酯实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得5个组分AEC1～AEC5；

S4：取组分AEC3，用氯仿溶解，并进行Sephadex LH-20(40×830mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为氯仿-甲醇；采用TLC分析，合并相同流分后获得4个组分AEC3-1～AEC3-4；

S5：取组分AEC3-2，过Waters XTerra RP-18制备液相色谱柱，其中，流动相为体积比82：18的甲醇-水，pH为2.5，紫外检测波长为205nm，流速为8mL/min，并且在保留时间为37.42min处得到所述苯醌类化合物。

优选地，在上述制备方法中，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。

优选地，在上述制备方法中，所述洗脱剂为体积比7：3的氯仿-甲醇。

总之，本发明所述的苯醌类化合物，即化合物JNU-144具有以下技术优势：

化合物JNU-144作为一种天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；化合物JNU-144的抗肿瘤活性较强，能够在较短作用时间内抑制肝癌细胞增殖、侵袭迁移并诱导癌细胞凋亡的发生。

在癌症的治疗过程中，例如肝癌的治疗过程中，药物耐受问题一直是个难题，但是，本发明所提供的苯醌类化合物——化合物JNU-144能够在SMMC-7721的5-FU耐药细胞株中表现出良好的细胞增殖的抑制效果，所以，由化合物JNU-144制备的药物可用于对化疗耐受的病人；并且化合物JNU-144还可与其它药物联合使用。实验证明，在相同的处理时间下，化合物JNU-144对肝癌细胞的抑制率随化合物JNU-144的浓度增加而升高；在相同浓度下，化合物JNU-144对肝癌细胞的抑制率随化合物JNU-144的处理时间增加而升高。特别是，实验证明，化合物JNU-144能够有效抑制肝癌细胞的增殖，并且该抑制作用随化合物JNU-144浓度的增加而升高。此外，发明人实施的一些列实验证明了化合物JNU-144能够抑制mTOR的激活，能够诱导肝癌细胞发生细胞凋亡，能够抑制肝癌细胞的侵袭迁移，且能够抑制肿瘤生长。

综上所述，本发明所提供的技术方案成功地从新疆紫草根中提取出具有抗肿瘤活性的天然化合物，即化合物JNU-144(苯醌类化合物)；并且，本发明还提供了该化合物JNU-144在制备抗肿瘤药物中的应用，并证明了其医学临床用途的可行性与有效性；特别是，化合物JNU-144能够为肝癌及其它肿瘤转移患者提供新的治疗药物及治疗途径，该化合物JNU-144具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为化合物JNU-144的核磁共振¹H NMR图；

图2为化合物JNU-144的核磁共振¹³C NMR图；

图3为不同浓度的化合物JNU-144对SMMC-7721和HepG2细胞的抑制作用效果图；其中，图3A示出了不同浓度的化合物JNU-144处理12小时对HepG2细胞的抑制效果；图3B示出了不同浓度的化合物JNU-144处理12小时对SMMC-7721细胞的抑制效果；图3C示出了同一浓度的化合物JNU-144处理不同时间对HepG2细胞的抑制效果；图3D示出了同一浓度的化合物JNU-144处理不同时间对SMMC-7721细胞的抑制效果；

图4为不同浓度的化合物JNU-144对SMMC-7721和HepG2细胞克隆形成的抑制作用效果图；其中，左图示出了台盼蓝染色结果，右图示出了不同浓度化合物JNU-144处理下SMMC-7721和HepG2细胞克隆形成个数占DMSO处理对照组克隆形成个数的百分比的统计图；

图5中的左图示出了不同浓度的化合物JNU-144处理的SMMC-7721细胞中mTOR和p-mTOR的表达水平；图5中的右图示出了化合物JNU-144以不同时间处理的SMMC-7721细胞中mTOR和p-mTOR的表达水平；其中，p-mTOR表示磷酸化的mTOR，Actin蛋白作为内参蛋白；

图6为化合物JNU-144处理下SMMC-7721细胞发生细胞凋亡的显微图；其中，图6A示出了化合物JNU-144处理下SMMC-7721细胞的形态学变化，图6B/6C示出了z-VAD-fmk对化合物JNU-144处理的SMMC-7721细胞克隆形成能力抑制的保护作用；

图7为化合物JNU-144处理对SMMC-7721细胞EMT及侵袭迁移能力的抑制效果图；其中，图7A示出了划痕实验结果与对照组相比的化合物JNU-144处理下SMMC-7721细胞迁移能力的变化；图7B示出了transwell实验结果与对照组相比的化合物JNU-144处理下SMMC-7721细胞侵袭能力的变化，其中，上半部分为结晶紫染色结果，下半部分为上半部分染色细胞数目经计数统计后的变化比例的统计图；

图8为化合物JNU-144抑制小鼠体内肝癌的实验结果图；其中，图8A示出了肝癌移植瘤裸鼠的肿瘤外观，图8B示出了肝癌移植瘤裸鼠的肿瘤重量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

根据本发明所述的苯醌类化合物具有以下结构式：

本发明提供了所述苯醌类化合物(即化合物JNU-144)在制备抗肿瘤药物中的应用。并且，所述肿瘤优选自：肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、白血病、脑瘤、皮肤癌。

在本发明的一个优选实施方式中，所述肿瘤为肝癌，所述肿瘤细胞为肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2。具体实施方式中进行的实验表明：在分子水平上，化合物JNU-144处理能够有效抑制mTOR的磷酸化，进而抑制肝癌细胞的增殖，也能够抑制EMT及肝癌细胞的侵袭迁移，并且可以诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡，从而达到治疗癌症的目的。

在本发明的一个优选实施方式中，所述苯醌类化合物(即化合物JNU-144)可以由以下方法制备：

在室温下，用95％乙醇对新疆紫草根7.5kg进行多次冷浸、渗漉提取，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏1150g；将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得178.21g氯仿浸膏AEC，35.3g乙酸乙酯浸膏AEE，230.3g正丁醇浸膏AEB。接着，将所述氯仿浸膏AEC用氯仿和甲醇溶解，用(100-200目)柱层析硅胶进行拌样，然后用环己烷溶解硅胶装柱，用环己烷平衡柱子至硅胶面不再下降后，干法上样，再依次用环己烷、体积比为50：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为25：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为10：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为5：1的环己烷-乙酸乙酯、体积比为1：1的环己烷-乙酸乙酯实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得5个组分AEC1～AEC5。之后，取组分AEC3(21.34g，且均由环己烷-乙酸乙酯25：1洗脱得到)，用氯仿溶解，并进行Sephadex LH-20(40×830mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为氯仿-甲醇(7：3)；采用TLC分析，合并相同流分后获得4个组分AEC3-1～AEC3-4；取组分AEC3-2，过Waters XTerra RP-18制备液相色谱柱(19×250mm)，其中，流动相为体积比82：18的甲醇-水，pH为2.5，紫外检测波长为205nm，流速为8mL/min，并且在保留时间为37.42min处得到所述苯醌类化合物(即化合物JNU-144)。

当然，本发明所述的化合物JNU-144还可由其它提取工艺或化学合成方法制得。

下述实施例中，非小细胞肺癌细胞系SMMC-7721和HepG2均为ATCC产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，DMEM培养基为Gibco公司产品，MTT为Solarbio公司产品。

实施例1 化合物JNU-144的表征

本发明所提供的新的苯醌类化合物为红色无定型粉末，ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 339[M+Na]⁺，提示其分子量为316；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₁₈H₂₀O₅,计算不饱和度为9。在¹H NMR(400MHz,CDCl₃)中有20个氢信号，¹³C NMR和DEPT谱显示有10个碳与20个氢直接相连，发现该化合物存在3个甲基[δ_H 1.50(3H,s,H-16),12.8(C-16)；δ_H 4.02(3H,s,2-OCH₃),61.4(2-OCH₃)；δ_H 3.98(3H,s,3-OCH₃),61.4(3-OCH₃)]，4个亚甲基[δ_H 1.95(1H,dd,J＝12.8,1.2Hz,H-9ax),2.11(1H,m,H-9eq),27.0(C-9)；δ_H 2.02(1H,d,J＝10.4Hz,H-10ax),2.30(1H,dd,J＝12.0,3.2Hz,H-10eq),24.2(C-10)；δ_H 2.74(1H,d,J＝13.2Hz,H-13ax),3.36(1H,d,J＝13.2Hz,H-13eq),26.4(C-13)；δ_H 4.75(2H,br s,H-15),77.6(C-15)]，3个次甲基[δ_H 6.35(1H,t,J＝4.8Hz,H-6),79.5(C-6)；δ_H 5.10(1H,s,H-7),124.1(C-7)；δ_H 5.07(1H,br s,H-11),122.3(C-11)]和8个季碳[δ_C 185.2(C-1),145.2(C-2),144.7(C-3),184.1(C-4),141.3(C-5),136.3(C-8),139.5(C-12),144.2(C-14)]。

以上信息显示该化合物为一种杂萜。该化合物的¹H和¹³C NMR和紫草醌乙素的¹H和¹³C NMR非常相似，通过分析可知，该化合物和紫草醌乙素在结构上的最大区别在于：2位上的碳被甲氧基[δ_H 4.02(3H,s,2-OCH₃),61.4(2-OCH₃)]取代，同时，通过¹H-¹H COSY，HMQC和HMBC谱证实该化合物的结构确定为2-methoxy-Arnebinone B，据此，发明人将其命名为化合物JNU-144。

具体地，所述化合物JNU-144的核磁数据如下(参见附图1和2)：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 6.35(1H,t,J＝4.8Hz,H-6),5.10(1H,s,H-7),1.95(1H,dd,J＝12.8,1.2Hz,H-9ax),2.11(1H,m,H-9eq),2.02(1H,d,J＝10.4Hz,H-10ax),2.30(1H,dd,J＝12.0,3.2Hz,H-10eq),5.07(1H,br s,H-11),2.74(1H,d,J＝13.2Hz,H-13ax),3.36(1H,d,J＝13.2Hz,H-13eq),4.75(2H,br s,H-15),1.50(3H,s,H-16),4.02(3H,s,2-OCH₃),3.98(3H,s,3-OCH₃)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ_C 185.2(C-1),145.2(C-2),144.7(C-3),184.1(C-4),141.3(C-5),79.5(C-6),124.1(C-7),136.3(C-8),27.0(C-9),24.2(C-10),122.3(C-11),139.5(C-12),26.4(C-13),144.2(C-14),77.6(C-15),23.4(C-16),61.4(2-OCH₃),61.4(3-OCH₃)。

实施例2 化合物JNU-144对肝癌细胞的活力及增殖的抑制作用

分别将SMMC-7721和HepG2细胞分为九组，每组有三个平行孔，每孔中接种1×10⁴个细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施；接种细胞后对这九组细胞分别按照如下方法处理：第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为10μg/mL的JNU-144；第3组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；第4组加入终浓度为40μg/mL的JNU-144。以上4组细胞按上述方法加药后均处理12个小时，然后加入10μL浓度为5mg/mL的MTT水溶液，继续培养4小时，接着将含有MTT的培养基吸除，加入150μL DMSO，避光室温条件下在脱色摇床上震荡10分钟，再用酶标仪测量每个孔中的溶液在590nm波长处的吸光值，结果如图3A、图3B所示。

以上实验结果表明：化合物JNU-144对肝癌细胞活力的抑制随化合物JNU-144的浓度增大而加强。

分别将SMMC-7721和HepG2细胞分为九组，每组有三个平行孔，每孔中接种1×10⁴个细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，接种细胞后对这九组细胞分别按照如下方法处理：第1组不做处理；第2-5组加入DMSO，处理时间依次为4/8/12/16个小时；第6-9组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144，处理时间依次为4/8/12/16个小时；第5组加入DMSO；第6组-第9组均加入终浓度为20μg/mL的JNU-144。以上九组细胞按上述方法处理后加入10μL浓度为5mg/mL的MTT水溶液，继续培养4小时，然后将含有MTT的培养基吸除，加入150μL DMSO，避光室温条件下在脱色摇床上震荡10分钟，再用酶标仪测量每个孔中的溶液在590nm波长处的吸光值，结果如图3C、图3D所示。

以上实验结果表明：化合物JNU-144对肝癌细胞活力的抑制随化合物JNU-144处理时间的延长而加强。

实施例3 化合物JNU-144对肝癌细胞克隆形成的抑制作用

分别将SMMC-7721和HepG2细胞分为4组，每组有三个平行孔，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，对这4组细胞分别按照如下方法处理：第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为10μg/mL的JNU-144；第3组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；第4组加入终浓度为40μg/mL的JNU-144。以上4组细胞按上述方法加药后均处理12个小时，将细胞消化下来，计数，按每孔1×10³个细胞的密度接种到12孔板中，每孔加入1mL新鲜的DMEM完全培养基，摇晃均匀后在5％CO₂的培养箱中37℃培养10天后取出，去除培养基，甲醇固定半小时后用0.4％台盼蓝染色后，统计每个孔中克隆形成个数，结果如图4中所示，其中，左图为每孔克隆形成后的成像图，右图为染色后根据计数结果作出的统计图。

可见，实验结果表明化合物JNU-144对肝癌细胞增殖的抑制随化合物JNU-144的浓度增大而加强。

实施例4 化合物JNU-144抑制肝癌细胞中mTOR的激活

将SMMC-7721细胞分为8组，每孔中接种5×10⁵个细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，接种细胞后对这8组细胞分别按照如下方法处理：第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为10μg/mL的JNU-144；第3组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；第4组加入终浓度为40μg/mL的JNU-144；以上4组细胞按上述方法加药后均处理12个小时；第5组加入DMSO；第6组-第8组均加入终浓度为20μg/mL的JNU-144，处理时间依次为4/8/12个小时。各组细胞按上述方法处理后，去除培养基，用1x PBS清洗细胞两次，然后用含有终浓度为1mM的PMSF的RIPA裂解液裂解细胞(每孔200μL RIPA裂解液)，然后以12000rpm转速并在4℃下离心5分钟，弃沉淀，得到各组细胞含有细胞质总蛋白的上清液。利用western blot的方法检测上述各组细胞总蛋白中mTOR与p-mTOR的表达水平。检测mTOR表达水平的一抗为Cell Signaling Technology产品，货号为2972，检测p-mTOR表达水平的一抗为Cell Signaling Technology产品，货号为2974，内参为GAPDH，GAPDH的一抗为Proteintech产品，货号为60004-1-lg。实验结果如图5所示，通过分析可知，随着化合物JNU-144的浓度的增大和处理时间的延长，化合物JNU-144能有效抑制mTOR的磷酸化，即有效抑制mTOR的激活。

实施例5 化合物JNU-144诱导肝癌细胞发生细胞凋亡

将SMMC-7721细胞分为2组，每孔中接种1×10⁵个细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，接种细胞后对这2组细胞分别按照如下方法处理：第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；加药处理12个小时以后显微镜下观察细胞形态差异，结果如图6A所示，JNU-144处理的细胞出现了典型的细胞凋亡的特征，例如：细胞皱缩、细胞膜出泡、凋亡小体形成等。另取SMMC-7721细胞分为4组，每组有三个平行孔，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，对这4组细胞分别按照如下方法处理：第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；第3组加入终浓度为20μM的z-VAD-fmk；第4组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144和终浓度为20μM的z-VAD-fmk。以上4组细胞按上述方法加药后均处理12个小时，将细胞消化下来，计数，按每孔1×10³个细胞的密度接种到12孔板中，每孔加入1mL新鲜的DMEM完全培养基摇晃均匀后在5％CO₂的培养箱中37℃培养10天后取出，去除培养基，甲醇固定半小时后用0.4％台盼蓝染色后统计每个孔中克隆形成个数，结果如图6B、图6C所示，其中，图6B为每孔克隆形成后的成像图，图6C为染色后根据计数结果作出的统计图。

本实施例的实验结果表明化合物JNU-144对肝癌细胞增殖的抑制能够被caspase抑制剂z-VAD-fmk阻断，因此，化合物JNU-144能够诱导肝癌细胞发生细胞凋亡。

实施例6 化合物JNU-144抑制肝癌细胞迁移能力

将SMMC-7721细胞分为2组，每孔中接种2×10⁵个细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，待细胞汇合度至80％-90％时，第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；处理8个小时以后用一个tip在细胞中间划一处划痕，此时定为0h，接下来24h及48h均在显微镜下拍下划痕处细胞迁移的情况。实验结果如图7A所示，可知化合物JNU-144处理的肝癌细胞迁移能力受到了抑制。

实施例7 化合物JNU-144抑制肝癌细胞侵袭能力

将SMMC-7721细胞分为2组，每组有3个平行孔，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在5％CO₂的37℃培养箱中实施，待细胞汇合度至80％-90％时，第1组加入DMSO；第2组加入终浓度为20μg/mL的JNU-144；处理8个小时以后消化细胞，计数，用无血清培养基稀释细胞按每100μL 1×10⁵个细胞的密度接种到有100ng matrigel包被的transwell小室中，小室置于24孔板中，24孔板孔内加入500μL含10％FBS的培养基。24小时以后，用棉签轻轻刮去小室上层的细胞，下层的细胞经甲醇固定半小时后用0.1％结晶紫染色，接着在显微镜下观察，每个小室随机选取6个视野拍照并计数细胞数目。实验结果如图7B所示，其中，上半部分为每组细胞侵袭至小室下层后的成像图，下半部分为染色后根据计数结果作出的统计图。通过分析可知，实验结果表明化合物JNU-144处理的肝癌细胞侵袭能力受到了抑制。

实施例8 化合物JNU-144对裸鼠体内肝肿瘤生长的抑制作用

将14只6周龄SPF级BALB/c-nu/nu雌鼠(广东省医学实验动物中心产品)的每只鼠左腹侧皮下注射5×10⁶个SMMC-7721细胞，得到肝癌裸鼠。待肿瘤大小长至100mm³大小左右时，将14只上述肝癌裸鼠随机分为两组，一组为对照组(Vehicle)，一组为JNU-144治疗组，每组7只裸鼠。将JNU-144溶于橄榄油中，给药剂量为每千克体重15mg JNU-144，给药体积为100μL，对照组(Vehicle)每只腹腔给药等体积的载体，每两天给药一次，共给药5次。以第一次给药时刻为第0天，于第0、2、4、6、10天测量肿瘤体积及裸鼠的体重，第10天测量肿瘤体积及裸鼠的体重后将裸鼠处死，将肿瘤组织取下来拍照，然后取肿瘤组织通过western blot和免疫组化检测肿瘤组织中Vimentin情况，结果如图8所示，其中，图8A为肿瘤组织拍照结果，图8B为根据肿瘤组织重量的结果作出的统计图。

本实施例的实验结果表明，化合物JNU-144能够有效抑制裸鼠体内肿瘤组织的生长。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种苯醌类化合物，其特征在于，具有以下结构式：

2.根据权利要求1所述的苯醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为肝癌。

3.一种根据权利要求1所述的苯醌类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4：取组分AEC3，用氯仿溶解，并进行规格为40×830mm的SephadexLH-20柱层析，其中使用的洗脱剂为氯仿-甲醇；采用TLC分析，合并相同流分后获得4个组分AEC3-1～AEC3-4；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱剂为体积比7：3的氯仿-甲醇。