CN109867627B

CN109867627B - 一种取代苯酚β-氨基醇类衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109867627B
Application number: CN201810122219.7A
Authority: CN
Inventors: 程魁; 许尧
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN109867627A

Abstract

本发明涉及一种取代苯酚β‑氨基醇类衍生物，其结构如下式所示：

其中R₁为取代的卤素原子、氨基、硝基、C_1‑6烷基、C_1‑6烷氧基，和C_1‑6烷基中任意一个或多个取代基所取代，R₂分别独立的选自苯基、苄基、取代的苄基、苯乙基、取代的苯乙基、苯丙基、以及取代的苯丙基，R₃为取代的H，卤素原子、氨基、硝基、C_1‑6烷基、C_1‑6烷氧基，和C_1‑6烷基中任意一个或多个取代基所取代。本发明还公开了其作为HCN通道抑制剂或TLR4抑制剂的用途，以及制备佐剂、抗炎、镇痛、心力衰竭的药物中的应用。

Description

一种取代苯酚β-氨基醇类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及TLR4，HCN抑制活性的一系列化合物，可用于科研，医疗等领域。

背景技术

天然免疫***通过机体自身的模式识别受体识别潜在的微生物和非致病性共生菌群。其中Toll样受体实验就比较清楚的模式识别受体，同时也是识别病原微生物中最具代表性的一类。Toll样受体(以下简称TLR)是一类进化上高度保守且古老的天然免疫受体家族，它识别病原微生物在漫长的进化过程中保留下来的、对生存必不可少的特异性保守成分和机体在应激和损伤时放出的结构成分之后，TLRs构象发生改变，从而招募细胞质中特异的接头蛋白分子以激活信号级联反应。另外，TLRs信号过度活化或活化不足也会导致机体功能的异常和疾病的发生，因此机体采取了一系列正向或负向调控策略来调节TLRs介导的信号转导通路，使之维持适度的活化水平。

超极化激活的环核苷酸门控(HCN)通道被膜超极化激活，并进行混合的Na+/K+电流，从而促进起搏器去极化，从而在窦房结细胞和自发活动的神经元中产生节律活性。HCN通道的一个显着特征是它们被电压超极化和细胞内cAMP双重激活。迄今为止，已经鉴定了四种哺乳动物HCN通道异构体(HCN1-4)，每种具有不同的生物物理和调节性质以及不同的组织分布。HCN2在中枢及神经胶质细胞中表达较高。HCN2通道被抑制能明显缓解炎性痛和神经病理性痛的不良反应,成为可以缓解疼痛发生的新靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供取代苯酚β-氨基醇类衍生物，如式I所示，所述多种化合物能抑制TLR4受体活性，有HCN通道抑制作用，降低一系列疾病的发生与发展，如感染性疾病、AS、哮喘、心脏病、肝病、肾病、肠炎、癌症、肥胖症(I型和II型)、RA、阿尔茨海默病、震颤性麻痹、多重性硬化和非菌性炎症反应。该系列化合物还可抑制HCN通道亚型，并对HCN2通道具有较高的亲和力，抑制效果强大。从而为这些的治疗疼痛提供一种新的手段和途径，该通道的特异性药物也将为广大患者带来新的福音，具有重要的研发价值和开发意义。

本发明提供了式I所示化合物在TLR4，HCN等方面应用。

本发明所述的化合物SMU-XYC系列，能进行结构修饰，获得活性更好的化合物，并用于治疗TLR4相关疾病。

具体的，本发明一个方面提供了式I所示的化合物或其可药用的盐。

其中，

R₁为卤素、氨基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、被1个或多个取代基取代的C_1-6烷基；

R₂为H，卤素、氨基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、被1个或多个取代基取代的C_1-6烷基、苯基、苄基、取代的苄基、苯乙基、取代的苯乙基、苯丙基、以及取代的苯丙基；

R₃为H，卤素、氨基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、被1个或多个取代基取代的C_1-6烷基中任意一个或多个取代基所取代。

其中，R₁、R₂和R₃中的卤素独立地选自F、Cl、Br、I；R₁、R₂和R₃中的C_1-6烷基独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基；R₁、R₂和R₃中C_1-6烷氧基独立地选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基或己氧基。

其中，R₁为2位、3位或4位。

具体化合物如下表所示

本发明另一个方面提供了式I所示化合物的制备方法，包括下述步骤：

1)将4-溴-1-丁烷与mCPBA反应获得环氧溴丁烷；

2)化合物

与环氧溴丁烷通过取代反应得到化合物

3)将化合物

和化合物

通过取代反应得到化合物

4)化合物e在多聚甲醛和甲胺盐酸盐条件下反应获得化合物

5)化合物b和化合物f回流反应得到式I所示化合物；

R₁、R₂、R₃分别如前所述。

本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其包括式I所述化合物或其药可用的盐，其还包括药学上可接受的载体或辅料。

本发明再一个方面提供了式I化合物在制备佐剂，抗炎，TLR4抑制剂，HCN通道抑制剂，抗肿瘤，心力衰竭的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了一种在体外、体内调节TLR4碱性磷酸酶活性或HCN通道抑制水平的方法，其方法为给予受试者本发明式I化合物。

本发明提供了化合物SMU-XYC系列的制备方法，其包括以下步骤：

1)将4-溴-1-丁烷逐滴加入到mCPBA的CH₂Cl₂溶液中。将反应混合物搅拌24小时，在此期间形成白色沉淀。然后加入NaOH并分离各相。用4M NaOH洗涤有机层一次，随后用水洗涤直至洗涤水溶液达到pH7。有机相用Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，得到环氧溴丁烷。

2)向丙酮中加入4-乙氧基苯酚(取代苯酚)，无水碳酸钾和环氧溴丁烷，混合溶液回流20小时。将混合物冷却至室温，减压浓缩滤液。将得到的油状物溶解在甲苯中，依次用水，5％NaOH水溶液洗涤，然后用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。得到2-(4-乙氧基苯基)环氧乙烷；

3)1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-吡唑的制备。

将3,5-二甲基-1H-吡唑和KOH溶于DMSO中，并将得到的非均相溶液在80℃下搅拌1.5h，然后冷却至室温。然后在15分钟内加入6M DMSO溶液的邻氯氯苄，并将反应混合物再搅拌2.5小时。TLC观察监测反应是否完全。将反应物溶于水，水相用CHCl₃萃取。合并有机层用100ml水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩。残留物经硅胶快速色谱纯化，用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱。得到1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-吡唑(1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazole)，为黄色油状物。

4)1-1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-4-吡唑-N-甲基甲胺的制备。将多聚甲醛和甲胺盐酸盐溶于乙醇中搅拌1h，然后加入1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-吡唑，并将反应混合物回流搅16小时。混合物液体冷却至室温，用NaHCO₃中和。有机层用Na₂SO₄干燥并减压浓缩。通过硅胶快速色谱法用10％甲醇的乙酸乙酯溶液纯化残余物。得到1-1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-4-吡唑-N-甲基甲胺(1-(1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)-N-methylmethanamine)，为黄色油状物。

5)2-(4-乙氧基苯基)环氧乙烷和1-1-(2-氯苄基)-3,5-二甲基-1H-4-吡唑-N-甲基甲胺加入到乙醇中，混合溶液回流24小时。将混合物冷却至室温，减压浓缩。同样方法得到式I中多种化合物。

上述所示的部分化合物能剂量依赖性的抑制TLR4受体，抑制HCN等通道亚型。

本发明所述的化合物SMU-XYC系列可用于制成TLR4相关佐剂、药物等。结合现代常用药物制剂手段，可将所述化合物制成注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊，从而采用比较方便的给药形式，其中本发明化合物在所述药物中的质量百分比含量为1～20％。

上述各种剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。

附图说明

图1为SMU-XYC1的¹H NMR谱图。

图2为SMU-XYC2的¹H NMR谱图。

图3为SMU-XYC3的¹H NMR谱图。

图4为SMU-XYC4的¹H NMR谱图。

图5为SMU-XYC5的¹H NMR谱图。

图6为SMU-XYC6的¹H NMR谱图。

图7为SMU-XYC7的¹H NMR谱图。

图8为SMU-XYC8的¹H NMR谱图。

图9为SMU-XYC9的¹H NMR谱图。

图10 SMU-XYC5呈浓度依赖的抑制TLR4活性。

图11为SMU-XYC5阻断HCN4电流的电生理特性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

实施例1：SMU-XYC1：

的制备。

1)

的制备。

将4-溴-1-丁烯(1000mg，7.41mmol)滴加到mCPBA(1948mg，11.11mmol)的50mlCH₂Cl₂溶液中。搅拌反应混合物24小时，在此期间形成白色沉淀。之后加入1M NaOH并将相用乙酸乙酯萃取。用NaOH(4M，50ml)洗涤有机层一次，随后用水洗涤直到洗涤水溶液到pH＝7。有机相用Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，得到澄清液状的

2)

的制备；

向丙酮中加入4-氟苯酚(200mg，1.78mmol)，无水碳酸钾(494mg，3.57mmol)和环氧溴丁烷(1078mg，7.14mmol)，并将得到的非均相溶液回流20小时。将混合物冷却至室温，通过硅藻土垫过滤，减压浓缩滤液。依次用水，5％NaOH水溶液和水洗涤得到的油，然后用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。得到的液体使用快速柱色谱法用含20％乙酸乙酯的石油醚进行纯化，得到

为澄清液体。

3)

的制备。

将3,5-二甲基-1H-吡唑(1000mg，10.40mmol)和KOH(1675mg，10.40mmol)溶于DMSO中，并将得到的非均相溶液在80℃下搅拌1.5h，然后冷却至室温。然后在15分钟内加入6MDMSO溶液的邻氯氯苄(876mg，15.61mmol)，并将反应混合物再搅拌2.5小时。TLC观察监测反应是否完全。将反应物溶于水，水相用CHCl₃萃取。合并有机层用100ml水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩。残留物经硅胶快速色谱纯化，用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱。得到

为黄色油状物。

4)

的制备。

将多聚甲醛(820mg，27.2mmol)和甲胺盐酸盐(920mg，13.6mmol)溶于乙醇中搅拌1h，然后加入

(1000mg，4.53mmol)加入并将反应混合物回流搅16小时。混合物液体冷却至室温，用NaHCO₃中和。有机层用Na₂SO₄干燥并减压浓缩。通过硅胶快速色谱法用10％甲醇的乙酸乙酯溶液纯化残余物。得到

为黄色油状物。

5)

的制备

(100mg，0.48mmol)和

(143mg，0.57mmol)溶于乙醇并升温至75℃搅拌至环氧乙烷完全消耗，通过TLC(20-24h)监测反应。将该溶液冷却至室温，溶于氯仿。有机相用饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。得到的油状物使用层析柱色谱法，2％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱溶剂纯化。上述化合物表征如下：

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.37(d,J＝7.6Hz,1H),7.22–7.12(m,2H),7.04–6.92(m,2H),6.90–6.82(m,2H),6.53–6.50(m,1H),5.32(s,2H),4.21–4.06(m,2H),4.01–3.91(m,1H),3.54–3.48(m,1H),3.37–3.26(m,1H),2.51–2.45(m,1H),2.39–2.31(m,1H),2.28–2.24(m,6H),2.13(s,3H),1.96–1.87(m,1H),1.85–1.75(m,1H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz)δ154.94,147.75,138.40,135.05,131.71,129.20,128.55,127.36,127.21,115.79,115.56,115.45,115.37,113.41,65.30,64.05,62.84,62.83,51.40,50.04,41.56,34.52,12.10,9.56.ESI-MS:m/z calc’d for C₂₄H₂₉ClFN₃O₂(M+H⁺)445.2,found 445.4.

实施例2：化合物2-9的制备

实施例2中分别制备了化合物2-9。化合物2-9制备步骤与实施例1中相同，除了所用原料有所区别。不同之处如下面的表2所示：

表1化合物2-9与实施例1的区别

化合物编号	与实施例1步骤不同之处
		2	将4-氟苯酚替换为4-甲基苯酚
3	将4-氟苯酚替换为4-乙基苯酚
		4	将4-氟苯酚替换为4-丙基苯酚
5	将4-氟苯酚替换为4-叔丁基苯酚
		6	将4-氟苯酚替换为4-甲氧基苯酚
7	将邻氯氯苄替换为邻氟氯苄
		8	将邻氯氯苄替换为4-甲基氯苄
9	将邻氯氯苄替换为4-氯氯苄

实施例3：化合物1-9的结构验证

[SMU-XYC1]

1-(((1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amin o)-4-(4-fluorophenoxy)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.37(d,J＝7.6Hz,1H),7.22–7.12(m,2H),7.04–6.92(m,2H),6.90–6.82(m,2H),6.53–6.50(m,1H),5.32(s,2H),4.21–4.06(m,2H),4.01–3.91(m,1H),3.54–3.48(m,1H),3.37–3.26(m,1H),2.51–2.45(m,1H),2.39–2.31(m,1H),2.28–2.24(m,6H),2.13(s,3H),1.96–1.87(m,1H),1.85–1.75(m,1H).ESI-MS:m/z calc’d forC₂₄H₂₉ClFN₃O₂(M+H⁺)445.2,found 445.3.

[SMU-XYC2]

1-(((1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amin o)-4-(p-tolyloxy)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.38(d,J＝8.0Hz,1H),7.25–7.13(m,2H),7.09(d,J＝7.6Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.52(d,J＝7.6Hz,1H),5.33(s,2H),4.15–4.11(m,2H),3.99(s,1H),3.56–3.50(m,1H),3.36–3.31(m,1H),2.53–2.48(m,1H),2.42–2.37(m,1H),2.32–2.24(m,9H),2.14(s,3H),1.98–1.79(m,2H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₅H₃₂ClN₃O₂(M+H⁺)441.2,found 441.4.

[SMU-XYC3]

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.38(d,J＝7.6Hz,1H),7.22–7.16(m,2H),7.10(d,J＝8.0Hz,2H),6.85(d,J＝8.4Hz,2H),6.53(d,J＝7.6Hz,1H),5.33(s,2H),4.14(t,J＝7.6Hz,2H),4.03(s,1H),3.58(s,1H),3.39(s,1H),2.72–2.54(m,3H),2.45–2.41(m,1H),2.28(s,6H),2.16(s,3H),1.97–1.83(m,2H),1.23(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS:m/z calcd forC₂₆H₃₄ClN₃O₂(M+H⁺)455.3,found 455.4.

[SMU-XYC4]

1-(((1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amin o)-4-(4-propylphenoxy)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.38(d,J＝7.6Hz,1H),7.23–7.13(m,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(d,J＝8.4Hz,2H),6.52(d,J＝7.6Hz,1H),5.33(s,2H),4.16–4.11(m,2H),4.02–3.94(m,1H),3.56–3.50(m,1H),3.36–3.30(m,1H),2.54(t,J＝7.6Hz,2H),2.49–2.45(m,1H),2.41–2.35(m,1H),2.28–2.25(m,5H),2.14(s,3H),1.97–1.77(m,2H),1.66–1.59(m,2H),1.29–1.24(m,1H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₇H₃₆ClN₃O₂(M+H⁺)469.3,found 469.4.

[SMU-XYC5]

4-(4-(tert-butyl)phenoxy)-1-(((1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amino)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.39(d,J＝6.8Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),7.22–7.15(m,2H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.52(d,J＝7.6Hz,1H),5.33(s,2H),4.15(t,J＝5.2Hz,2H),4.01(s,1H),3.58–3.52(m,1H),3.40–3.34(m,1H),2.54(s,1H),2.42(s,1H),2.28(s,6H),2.15(s,3H),1.95–1.83(m,2H),1.32(s,9H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₈H₃₈ClN₃O₂(M+H⁺)483.2,found483.3.

[SMU-XYC6]

1-(((1-(2-chlorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amin o)-4-(4-ethoxyphenoxy)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.23–7.11(m,2H),6.84(d,J＝1.6Hz,4H),6.52–6.48(m,1H),5.32(s,2H),4.13-3.91(m,5H),3.53–3.25(m,2H),2.48–2.31(m,2H),2.27(s,3H),2.23(s,3H),2.12(s,3H),1.93–1.78(m,2H),1.42–1.37(m,3H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₆H₃₄ClN₃O₃(M+H⁺)471.2,found 471.2.

[SMU-XYC7]

4-(4-ethoxyphenoxy)-1-(((1-(2-fluorobenzyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amino)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.27–7.22(m,1H),7.11–7.01(m,2H),6.85(s,5H),5.29(s,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),4.00(q,J＝7.2Hz,3H),3.56–3.50(m,1H),3.36–3.30(m,1H),2.52(s,1H),2.42–2.36(m,1H),2.26(s,6H),2.18(s,3H),1.91–1.80(m,2H),1.41(t,J＝7.0Hz,3H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₆H₃₄FN₃O₃(M+H⁺)455.3,found 455.6.

[SMU-XYC8]

1-(((3,5-dimethyl-1-(2-methylbenzyl)-1H-pyrazol-4-yl)methyl)(methyl)amin o)-4-(4-ethoxyphenoxy)butan-2-ol.

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.12–7.08(m,1H),6.85(s,4H),6.45(d,J＝7.2Hz,1H),5.21(s,2H),4.14–4.08(m,2H),4.00(q,J＝7.2Hz,3H),3.56–3.50(m,1H),3.36–3.30(m,1H),2.55–2.47(m,1H),2.40(s,1H),2.35(s,3H),2.27(s,6H),2.12(s,3H),1.97–1.80(m,2H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₇H₃₇N₃O₃(M+H⁺)451.3,found451.6.

[SMU-XYC9]

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.30(s,1H),7.28(s,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,2H),6.85(s,4H),5.20(s,2H),4.12–4.08(m,2H),4.00(q,J＝6.8Hz,3H),3.56–3.50(m,1H),3.36–3.30(m,1H),2.55–2.46(m,1H),2.41–2.35(m,1H),2.26(s,6H),2.14(s,3H),1.97–1.75(m,2H),1.41(t,J＝6.8Hz,3H).ESI-MS:m/z calc’d for C₂₆H₃₄ClN₃O₃(M+H⁺)471.2,found 471.3.

实施例4SMU-XYC5的TLR4抑制活性检测

TLR4抑制活性采用TLR4HEK BLUE细胞进行检测。TLR4HEK BLUE细胞培养于含10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素的DMEM培养基中，置于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养。

HEK BLUE TLR4细胞以40000个/孔铺于96孔板中，37℃，5％CO₂中培养24小时，每孔50μL。待细胞长势良好时，加入100μM浓度的化合物并倍比稀释9个浓度梯度。再于CO₂培养箱中放置24小时。新96孔板中加入50μL上清，避光加入50μL Quanti-blue溶液，在620nm吸光度下15分钟为单位读数3次，以检测细胞上清中SEAP的信号强度。

如图10所示，SMU-XYC5能显著抑制TLR4碱性磷酸酶(SEAP)信号强度，在低浓度的抑制剂SMU-XYC5(0.39μM)时，其不能显著抑制TLR4碱性磷酸酶信号强度，而在高浓度的抑制剂SMU-XYC5(30μM)时，其能显著抑制TLR4碱性磷酸酶信号强度。

该结果显示该系列化合物具有很好的TLR4抑制活性，具有良好的开发潜力。由于TLR4与心脏疾病相关，同时HCN4在心脏窦房结中表达较多，与心律失常，心力衰竭等多种疾病相关。HCN2在中枢神经中表达较为广泛，所以HCN2抑制剂可以作为抗炎，止痛的新靶点来应用。

实施例5SMU-XYC5化合物的HCN抑制活性检测

首先测试了SMU-XYC5对HCN2通道在-50到-140mV不同电压下的抑制作用。10μMSMU-XYC5显着降低了所有测试电压下的HCN2电流，并将电压依赖性激活急剧地移向更超极化的方向，V1/2从-89.93±0.90移动到-120.70±0.67mV。此外，SMU-XYC5在-120mV(对照：242.90±24.02vs 4e：1598.00±154.40ms)显着减慢激活速度，而对去激活过程没有影响。进一步的剂量-反应曲线显示SMU-XYC5在HCN2通道上的IC₅₀为3.42±1.02μM。

最近的研究报道HCN2通道调节伤害性感觉神经元的发放频率，并在炎症和神经性疼痛两者中起着核心作用。这一系列化合物可以抑制HCN通道的外周阻滞引起的炎症和神经性疼痛。这些抑制剂的发现可能是未来抑制剂开发的有希望的先导化合物。可以发挥缓解神经疼痛，抗心绞痛的作用。具体结果参见图11和表2。

表2：SMU-XYC系列对HCN2通道(神经疼痛方面)的抑制效果。

将化合物均匀地偶联到10μM，并在保持电位为-40mV时从2s超极化脉冲引起电流流动。紧接着，将测试脉冲以10mV的增量施加至-140至-50mV的电位，并且将750ms的去极化电流重新调整至+50mV以记录尾电流。I₀是在对照条件下-120mV时HCN2的内向整流电流的幅度，而I是在相应的化合物存在下10μM时HCN2的内向整流电流的幅度。