CN109852717A

CN109852717A - 一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法

Info

Publication number: CN109852717A
Application number: CN201811566959.6A
Authority: CN
Inventors: 刘同坤; 陈丽; 李林; 张蜀宁; 张昌伟; 李英; 侯喜林
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109852717B

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法，利用开发的SSR分子标记引物对及其检测方法可以将不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星三个品种同时区分开来。本方法不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有检测快速、准确等优点，当出现品种假冒或有争议情况时可进行有效地监督和仲裁，值得大范围推广。

Description

一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法

技术领域

本发明属于蔬菜品种鉴定与良种技术领域，具体涉及一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法。

背景技术

不结球白菜种质资源丰富、种类多、分布广，且历史悠久，经济价值高。随着不结球白菜育种进程的不断发展，新培育出的优良品种越来越多。但是，也给种子市场带来了巨大挑战。一个品种经国家（鉴、认）或省级（鉴、认）定前需经单株筛选、品系比较试验、品种区域试验，耗时漫长。而依据形态特征和生化成分去鉴别品种真实性，也易受发育阶段、栽培措施和环境条件的影响。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对现有种植鉴定方法中存在的工作量大、成本高、时间长、结果滞后等技术问题，提供一种利用SSR分子标记鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星品种的方法，该方法具有检测快速、准确、不受环境条件影响等优点。

技术方案：一种不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的SSR分子标记引物，其序列为：

SSR03118-F：5’- GACTCTCAGCCTCCTTTTGC -3’（SEQ ID NO.1），

SSR03118-R：5’- TGACTGGGTTCATGCGTAAT -3’（SEQ ID NO.2）。

上述引物用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法，包括以下步骤：

步骤1，提取待鉴定不结球白菜的DNA；

步骤2，以步骤1提取的DNA作为模板，用上述引物对其进行PCR扩增；

步骤3，对步骤2的PCR扩增产物进行电泳分离，获得各样品的分离带型；

对步骤3中各样品的带型进行统计，对比判定，结果判断标准如下：如果待测不结球白菜品种的PCR扩增样品电泳条带与油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种；如果不一致，则表明待测品种不是油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中任何一个。

进一步地，步骤2中的PCR扩增体系包括：2×Taq MasterMix、10μM正向SSR引物、10μM反向SSR引物、50ng/μL DNA模板、去离子水。

进一步地，步骤2中的PCR扩增体系为10μL扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix5μL、10μM正向SSR引物1μL、10μM反向SSR引物1μL、50ng/μL DNA模板1μL、去离子水2μL。

进一步地，步骤2中PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

进一步地，步骤3中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

上述引物在不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星鉴定中的应用。

有益效果：本发明利用开发的SSR分子标记引物对及其检测方法可以将不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星三个品种同时区分开来。本方法不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有检测快速、准确等优点，当出现品种假冒或有争议情况时可进行有效地监督和仲裁，值得大范围推广。

附图说明

图1为油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，

其中：Marker为DL1000 Marker、1为不结球白菜油亮矮脚黄泳道、2为不结球白菜黄玫瑰泳道、3为不结球白菜绿星泳道。

图2中a、b、c、1、2、3分别为四倍体苏州青、二倍体苏州青、香青菜、油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星六个不结球白菜品种的PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。

其中：Marker为DL1000 Marker、a为不结球白菜四倍体苏州青泳道、b为不结球白菜二倍体苏州青泳道、c为不结球白菜香青菜泳道、1为不结球白菜油亮矮脚黄泳道、2为不结球白菜黄玫瑰泳道、3为不结球白菜绿星泳道。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明利用不结球白菜数据库、SSR分子标记引物数据库及参考文献中报道的不结球白菜SSR引物中有目的性的筛选出59对SSR引物，将上述59对SSR引物合成后进行引物多态性筛选。

筛选的具体过程为：首先提取油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的DNA，然后以油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的基因组DNA为模板，分别对59对SSR引物进行PCR扩增，扩增完毕后进行聚丙稀酰胺凝胶电泳，电泳完毕后将凝胶显染色，最后对每一对引物扩增出来的条带进行判断，如果某一对引物的扩增条带在这三个不同品种中出现多态性，就确定这一对引物可以用于后续的精准鉴定试验，否则，表示这一对引物不适合用于鉴定油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星这三个不结球白菜品种。最终，经过这一选择过程，选择出了用于后续鉴定试验的SSR分子标记引物SSR03118。

本发明还提供了一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待鉴定不结球白菜的DNA；

（2）以待检测的不结球白菜基因组DNA为模板，以SSR03118为引物，进行PCR扩增；

（3）将PCR扩增产物进行电泳分离，获得各样品的分离带型，如果待测不结球白菜品种的PCR扩增样品电泳条带与油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种，如果不一致，则表明待测品种不是油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中任何一个。

实施例1

本实施例提供的鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法，包括以下步骤：

（1）不结球白菜基因组DNA的提取

根据植物基因组DNA快速提取试剂盒（购自于杭州宝赛生物科技有限公司）说明书提取DNA，简要如下：

1)取适量不结球白菜幼嫩叶片（100mg）于2mL离心管中，加入钢珠并置于液氮中冷却，使用植物组织研磨仪进行充分研磨；

2)加入500μL已在65℃预热的PL1（已经加入β-巯基乙醇至0.2%）以及5μL RNaseA，剧烈涡旋震荡，在65℃的水浴锅中温浴10min；

3)加入170μL的Buffer PL2溶液，充分混匀，室温放置5min，12000rpm离心5min，将上清转入一个新的离心管中；

4)向上述溶液中加入750μL的PL3溶液，立刻混匀，并将所得溶液转入吸附柱RB中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

5)向吸附柱中加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心1min，倒掉废液；

6)重复5步骤一次；

7)将吸附柱RB放回收集管中，12000rpm离心2min，除尽漂洗液；

8)取出吸附柱RB，放入新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入100μL双蒸水，室温静置3min，12000rpm离心1min，洗脱基因组DNA；

9)DNA经纯度及浓度检测，稀释到50ng/μL，存放于-20℃冰箱中备用。

油亮矮脚黄序列如SEQ ID NO.3所示。

黄玫瑰序列如SEQ ID NO.4所示。

绿星序列如SEQ ID NO.5所示。

（2）不结球白菜基因组SSR扩增

采用SSR-PCR总体积为10μL的扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix为5μL，浓度为10μM正反向SSR引物各为1μL，浓度为50ng/μL模板DNA为1μL，用去离子无菌水补足10μL体系。其中正反向引物为SSR03118，正向引物SSR03118-F序列为5’-GACTCTCAGCCTCCTTTTGC -3’；反向引物SSR03118-R序列为5’-TGACTGGGTTCATGCGTAAT -3’。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min,然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增结束后，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，1.5μL上样，180v电泳1.5h后，银染显色，拍照采集电泳图像并统计多样性。具体的凝胶溶液包括：聚丙烯酰胺溶液（具体溶液配制：称取142.5g丙烯酰胺以及7.5g甲叉-双丙烯酰胺，加水溶解并定容至500mL）7.5mL，10×TBE 3mL，去离子无菌水20mL，10％的过硫酸铵溶液200μL以及TEMED为40μL。

具体的染胶流程为：

（1）拆胶后放入0.2%AgNO₃溶液并置于摇床上缓慢摇晃8~10min。

（2）倒掉AgNO₃溶液并加入去离子水在摇床上缓慢摇晃1min。

（3）加入含有1.5%的氢氧化钠以及1.0％甲醛的显色液，摇床上缓慢摇晃，直至显色成功。

（4）倒掉显色液，去离子水清洗两遍，使用保鲜膜包裹，晾干观察。

如果检测的产物条带与油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星其中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种，如果不一致，则表明待测品种不是油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中任何一个。

图1为油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的电泳结果，Marker为DL1000 Marker、1为不结球白菜油亮矮脚黄泳道、2为不结球白菜黄玫瑰泳道、3为不结球白菜绿星泳道。

图2为四倍体苏州青、二倍体苏州青、香青菜、油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的电泳结果。看图片可得四倍体苏州青、二倍体苏州青、香青菜三组条带有一致性，与油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的三组条带有明显差异，且油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星这三组条带也差异显著。

由图1和图2可知，本发明的引物对油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星这三个不结球白菜具有特异性，可用来对三个品种进行鉴定。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种用于鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactctcagc ctccttttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgactgggtt catgcgtaat 20

<210> 3

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gactctcagc ctccttttgc attaaacaaa tgacgtttta gtgtggcatt tctttgctac 60

ttgatgtacg atttcacgta gacttaactc tctcccacca gttcttctat atattgaagt 120

agtttaactc tctcattttc tcactctcat accaaaatac tttgctctct ctctctctct 180

ctctctctct ctgatcgggt gtgtaagaat gtccgattca catagccttc aagatatatt 240

tcacgagaca aatgctggta aactaatccc cttaacctca ttttgtaagc aattgccaat 300

agattacgca tgaacccagt ca 322

<210> 4

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gactctcagc ctccttttgc attaaacaaa tgacgtttta gtgtggcatt tctttgctac 60

ttgatgtacg atttcacgta gacttaactc tctcccacca gttcttctat atattgaagt 120

agtttaactc tctcattttc tcactctcat accaaaatac tttgctctct ctctctgatc 180

ggttgtgtaa gaatgtccga ctcacatagc cttcaagata tatttcacga gacaaatgct 240

ggtaaactaa tccccttaac ctcattttgt aagcaattgc caatagatta cgcatgaacc 300

cagtca 306

<210> 5

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactctcagc ctccttttgc attaaacaaa tgacgtttta gtgtggcatt tctttgctac 60

ttgatgtacg atttcacgta gacttaactc tctcccacca gttcttctat atattgaagt 120

agtttaactc tctcattttc tcactctcat accaaaatac tttgctctct ctctctctct 180

ctctctctct gatcggttgt gtaagaatgt ccgattcaca tagccttcaa gatatatttc 240

acgagacaaa tgctggtaaa ctaatcccct taacctcatt ttgtaagcaa ttgccaatag 300

attacgcatg aacccagtca 320

Claims

1.一种不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的SSR分子标记引物，其特征在于：序列为：

SSR03118-F：5’- GACTCTCAGCCTCCTTTTGC -3’，

SSR03118-R：5’- TGACTGGGTTCATGCGTAAT -3’。

2.利用权利要求1所述的引物鉴定不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星的分子标记方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，提取待鉴定不结球白菜的DNA；

对步骤3中各样品的带型进行统计，对比判定，结果判断标准如下：如果待测不结球白菜品种的PCR扩增样品电泳条带与油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中的任意一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种；如果不一致，则表明待测品种不是油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星中任何一个。

3. 根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于：步骤2中的PCR扩增体系包括：2×Taq MasterMix、10μM正向SSR引物、10μM反向SSR引物、50ng/μL DNA模板、去离子水。

4. 根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于：步骤2中的PCR扩增体系为10μL扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix 5μL、10μM正向SSR引物1μL、10μM反向SSR引物1μL、50ng/μL DNA模板1μL、去离子水2μL。

5.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于：步骤2中PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

6.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于：步骤3中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

7.权利要求1所述的引物在不结球白菜油亮矮脚黄、黄玫瑰、绿星鉴定中的应用。