CN106434641A - 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记含有Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。本发明还公开该分子标记引物的筛选方法以及扩增方法。本发明的分子标记构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，有利于分子标记辅助紫色大白菜育种及BrPur基因的克隆；所述的分子标记引物B‑76和SSR14‑36与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁距离分别为1.1 cM和0.2 cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性好和准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记，还涉及到扩增该分子标记的引物及在大白菜辅助育种中的应用。
背景技术
白菜 (Brassica rapa L.) 属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，同时还是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益提高，而紫色大白菜花青素含量丰富，对于人类健康的营养价值极高，因此，紫色大白菜育种受到越来越多国内外学者和育种家的重视。
研究表明紫色大白菜类黄酮类次生代谢产物丰富，尤其是花青素含量较高，不仅有利于提高白菜类作物自身的抗逆能力，而且其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效，对于人类健康具有重要的营养价值，近年来受到国内外的广泛关注。但是，白菜叶球颜色需要在其结球期成熟后才能表现出，而且需要在田间切开叶球逐株观察，操作起来不仅对种质材料的破坏性极大，而且费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快紫色叶球大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一类由1 - 6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautzand Schlötterer，1994；Powell et al.，1996）。
因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜叶球紫色基因BrPur紧密连锁的分子标记，并构建了BrPur基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行紫色叶球大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的还一个目的在于，提供可用于PCR扩增与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记的引物对，以及应用该分子标记引物，通过PCR方法，获得分子标记。以此在苗期即可鉴定区分紫色叶球大白菜和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，所述分子标记Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。
本发明还公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记引物，已鉴定出的6对SSR引物，优选引物B-76（序列Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物SSR14-36（Sep IDNO.7、Sep ID NO.8）所示的序列，6对中的一对，即可将紫色叶球与非紫色叶球大白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择的准确性。
[f1] 对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
本发明公开的分子标记，是由优选的引物对B-76（Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物对SSR14-36(Sep ID NO.7、Sep ID NO.8)经过PCR扩增获得的。
[A2]
采用上述与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA扩增在苗期即可鉴定区分紫色叶球和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时大白菜紫色叶球基因BrPur分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
本发明首次获得了与大白菜紫色叶球基因BrPur最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
（1）获得了在第7连锁群（A07）上大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，且首次获得与BrPur基因紧密连锁的分子标记B-76和SSR14-36，可在紫色大白菜分子标记辅助育种及BrPur基因克隆中发挥重要的作用。
[A3] [A4]
（3）鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测BrPur基因，可以确定BrPur的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有BrPur基因的植株，并用于紫色大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
（4）提高紫色大白菜的选择效率。在传统的紫色大白菜鉴定过程中，必须等到白菜结球期成熟后才能对叶球颜色性状进行观察统计，因此紫色大白菜的选育不仅费时费力，而且难度大，成本高，育种周期长。用本发明的分子标记引物，通过检查与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分紫色和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与BrPur基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
（5）可用于克隆大白紫色叶球基因的研究。图位克隆大白菜紫色基因BrPur的前提在于获得与BrPur紧密连锁的分子标记。B-76和SSR14-36在所有已知的A07分子标记中是首次报道的位于BrPur两侧并且与之连锁最为紧密标记，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。
附图说明
图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
图2 是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。
图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株；。
图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和紫色球叶性状；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和非紫色球叶性状。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
本发明的与白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：
（1）群体材料准备
以紫色大白菜“14S839” （西北农林科技大学学报（自然科学版）2011（3）11：146-151）为父本，橙色大白菜“14S162”（秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999 (3)，5-6）为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。
（2）白菜单株基因组总DNA的提取
A、取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B、向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入10 µL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65 ℃烘箱中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，温浴45 min；
D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15 min后，常温下10000 r/min 离心10 min；
E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F、取上清（约500μL），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4℃条件下8000 r/min离心5 min；
G、弃上清，加入500 μL质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNase A（10 µg/µl），混匀后稍离心，37 ℃保温30 min；
I、加入3 mol/L的NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J、在4℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400～500 µL的灭菌ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20 ℃保存备用；
（3）SSR序列的获得
根据http://brassicadb.org/brad/index 中公布的已知引物，共选取大白菜10对染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出20对差异引物，然后选择紫色较深的F2单株和非紫色F2单株各10株，对这20对引物进行再次筛选，发现1对差异引物A710，随后继续选取A710引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A731。进一步沿A731到BrPur方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。
（4）SSR分子标记引物设计
根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0 软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp ~26bp；产物大小为100 bp ~300bp；引物（G+C）含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，设计合成了SSR引物297对。
（5）多态性引物筛选和SSR分子标记分析
选用所设计的297对引物，将在紫色亲本和非紫色亲本间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后选择在F2群体中30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型材料与田间对叶球颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传连锁图1，获得了与BrPur紧密连锁的6个SSR标记，图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
6对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
所述的PCR扩增包括：20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2μL， 2×TaqMaster Mix 10μLM的上、下游引物各1μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
PCR 反应程序为：
B-76引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
SSR14-36引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例：SSR14-36引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 µl的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，水浴45 min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400 -500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
PCR扩增条件：
20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，53 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出***到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子***适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由SSR14-36引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约140bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约128bp的产物，杂合紫色材料扩增出共显性的产物见图3，图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株。图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
实施例：B-76引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5－10 min分钟摇一次，水浴45 min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400－500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇﹣20 ℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
PCR扩增条件：
20 μL PCR 反应体系为： 50 ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出***到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子***适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由B-76引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5－6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2－3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2－3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约152bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约160bp的产物，杂合紫色材, 料扩增出共显性的产物见图2，图2是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6中的 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和叶球剖面；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和叶球剖面。
<110> 西北农林科技大学
<120> 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记扩增产物序列
<160> 16
<210> 1
<211> 152bp
<212> DNA
<213> B-76-14S839.sep
<400> 1
TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55
TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATA....... .ACTT 102
TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 152
<210> 2
<211> 160bp
<212> DNA
<213> B-76-14S162.sep
<400> 2
TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55
TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATATATATAT AACTT 110
TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 160
<210> 3
<211> 140bp
<212> DNA
<213> SSR14-36-14S839.sep
<400> 3
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATATATA TATATATATA ACAAT 55
GATATACTAC ATTTTATCAA AATAAATTAA TAATCTATAT TAGTATTTAA AAAGT 110
AATTTTTCGC ATTCAAGCTC TCACGTTAAA 140
<210> 4
<211> 128bp
<212> DNA
<213> SSR14-36-14S162.sep
<400> 4
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATGTA.. .......... ACAAT 43
GATATACT ACATTTTA TCAAAATA AATTAATA ATCTATAT TAGTATTT AAAAAGT 98
AATTTTTC GCATTCAA GCTCTCAC GTTAAA 128
<210> 5
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 引物对B-76上游人工序列
<400> 5
TGGAACGCAA ATGAACCCTC 20
<210> 6
<211> 25bp
<212> DNA
<213> 引物对B-76下游人工序列
<400> 6
GATGGCAAAA TTCACATAAG TTCAG 25
<210> 7
<211> 25bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14-36上游人工序列
<400> 7
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCC 25
<210> 8
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14-36上游人工序列
<400> 8
TTTAACGTGA GAGCTTGAAT GC 22
<210> 9
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-31上游人工序列
<400> 9
GGTCAAAACC TTTCAGAACT CCC 23
<210> 10
<211> 25p
<212> DNA
<213> 引物对B-31下游人工序列
<400> 10
AATCTTATCT TTTGGTTTGG TGCTG 25
<210> 11
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-51上游人工序列
<400> 11
TGGATTTGGT TAGGTGGTCA GC 22
<210> 12
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-51下游人工序列
<400> 12
CATGCACTTT GGGTGGAGAT AC 22
<210> 13
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14上游人工序列
<400> 13
CGAGTTGACC TGCGAACATT G 21
<210> 14
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14下游人工序列
<400> 14
CGATTCCTTC ATATTTGGTT TCAC 24
<210> 15
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR17上游人工序列
<400> 15
CTCTCAATCC CTCAATCAAA CC 22
<210> 16
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR17下游人工序列
<400> 16
AGGAGGCGTG CGGTTATG 18
Claims (7)
1.与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记SepID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。
2.根据权利要求1所述的与大白菜紫色叶球基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记Sep ID NO.1的上游引物为Sep ID NO.5所示的序列，下游引物为Sep ID NO.6所示的序列；
引物对B-76脱氧核糖核苷酸序列：
Sep ID NO.5（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇；
Sep ID NO.6（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇。
3.根据权利要求1所述的与大白菜紫色叶球基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记Sep ID NO.3的上游引物为Sep ID NO.7所示的序列，下游引物为Sep ID NO.8所示的序列；
引物对SSR14-36脱氧核糖核苷酸序列：
Sep ID NO.7（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇；
Sep ID NO.8（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇。
4.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：分子标记Sep ID NO.1由权利要求2所述的引物对以紫色大白菜的基因组DNA为模板经PCR扩增得到。
5.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：分子标记Sep ID NO.3由权利要求3所述的引物对以紫色大白菜的基因组DNA为模板经PCR扩增得到。
6.根据权利要求1所述的分子标记的检查方法，其特征在于,包括步骤：根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列筛选引物，以紫色和非紫色亲本大白菜DNA为模板进行扩增，判断和筛选扩增产物中是否存在该分子标记。
7.根据权利要求6所述的检查方法，其特征在于：所述的引物为权利要求2或3所述的引物对。
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