CN109836474A - 一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药品领域，尤其涉及一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽及其制备方法。该牦牛皮多肽分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^‑1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^‑1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^‑1处。其制备方法包括磨皮、加热、提沫、配制酶解液、离心浓缩及分离干燥。本发明以来自纯天然无污染的青藏高原牦牛皮为主要原料，原料来源广泛，营养丰富，在提高牦牛皮经济附加值的同时增加了一种具有补血止血功效的产品；其制备操作流程简单；制得的牦牛皮多肽具有三个分子量段的补血止血生物活性成分，可加快血小板凝聚到伤口的边缘，并互相缠结，使血液加快凝固，在伤口处，产生纤维蛋白。

Description

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及药品领域，尤其涉及一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽及其制备方法。

背景技术

牦牛是高原特有牛种，它生活在缺氧、高寒、高海拔、牧草低矮、稀疏，枯草期长的恶劣生活环境中。它的鲜皮经加工制成的胶含有丰富的营养成分，文献报道牦牛皮胶含有20.95 %人体必须氨基酸及钙、钠、镁、钾等矿物质元素。前期研究工作发现不同分子量段的牦牛皮胶在理化性质——变性温度、乳化性能、发泡能力和发泡稳定性、抗氧化性能等有较大差异。因此，开发牦牛皮产品不仅可以提高牦牛的经济价值，对社会健康保健事业同样具有积极意义。

贫血在亚洲人群的发病率最高，由于周期长，病情发展缓慢，没有特异性的临床症状，具有极大的隐藏性，对人们的身体健康和生活质量造成严重影响，它对儿童的认知和运动发育产生负面影响，导致普通人群的疲劳和低生产力。现代研究发现牦牛皮胶对人体的营养性贫血有改善的作用。

正常人具有凝血***和抗凝血***，保持动态平衡，维持自然血液循环；平衡失调导致出血或血栓形成。研究发现明胶——胶原蛋白水解产物，可介导血小板聚集，用作止血剂，明胶及各种明胶复合材料是有效的可吸收止血材料。《本草纲目》中记载牛皮胶主治吐血，衄血，下血，血淋，下痢，妊妇胎动血下。

申请人前期研究成果中，对牦牛皮胶的研究已有多项授权和受理发明专利。其中，牦牛皮胶的提取、分离已经获得授权发明专利。为此，在前期研究的基础上，为进一步扩大牦牛皮的适用范围，本申请人再次研究了牦牛皮胶的补血止血双向调节功效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽及其制备方法，具体通过牦牛皮真皮部位将前期的剖皮机改为磨皮机，避免因原料厚薄不一造成的浪费，提取后采用不同膜分离得到牦牛皮胶适宜的分子量范围，且具有补血止血双向调节功效的牦牛皮多肽。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽制备方法，包括如下步骤：

（1）磨皮：将脱毛脱脂后的牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成10～15cm的方块，磨去表皮，清洗干净；

（2）加热：将磨去表皮的牦牛皮按1:1～10的比例加入pH为1～9，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，加热2～30 min，冷却至室温；

（3）提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.1～0.5 h；

（4）配制酶解液：按照物料比为酶：牦牛皮=1:1～100（w/w），酶解温度为20～45°C，酶解时间为0.5～24 h，将酶解液加热2～30 min，冷却至室温；

优化的，所述的配制酶解液：按照物料比为酶：牦牛皮=1:1～50（w/w），酶解温度为20～45°C，酶解时间为0.5～12 h，将酶解液加热2～30 min，冷却至室温；

（5）离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心2～30 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

（6）分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为0.02～2.0 µm，干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

进一步的，步骤（1）中所述的牦牛皮为青藏高原牦牛的皮。

进一步的，步骤（1）中所述的磨皮是在磨皮机中进行。

进一步的，步骤（4）配制酶解液中所述的酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶的一种或多种。

进一步的，上述制备方法中所述的加热均为微波加热。

进一步的，步骤（6）中所述的干燥为冷冻干燥。

上述方法制得的牦牛皮多肽具有补血止血功效。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以来自纯天然无污染的青藏高原牦牛皮为主要原料，原料来源广泛，营养丰富，在提高牦牛皮经济附加值的同时增加了一种具有补血止血双向调节功效的产品；其制备操作流程简单，将前期的剖皮机改为磨皮机，避免因原料厚薄不一造成的浪费；制得的牦牛皮多肽具有三个分子量段的补血止血生物活性成分；可加快血小板凝聚到伤口的边缘，并互相缠结，使血液加快凝固，在伤口处，产生纤维蛋白。

附图说明

图1为本发明牦牛皮胶多肽对贫血小鼠给药14 d脾脏HE染色结果（HE 400×）。

图2为牦牛皮胶多肽对小鼠出血时间（BT）和凝血时间（CT）的影响。

图3为牦牛皮胶多肽对小鼠P-selection的影响。

图4为大鼠血小板膜蛋白Ⅱb/Ⅲa 和Ⅳ含量。

图5为流式细胞仪检测大鼠血小板聚集率。

图1中：A为空白对照组；B为模型组；C、D、E为牦牛皮胶多肽组；F为阿胶组；

图2、图3、图4中：A1为牦牛皮全胶 A2为牦牛皮胶多肽低剂量；A3为牦牛皮胶多肽中剂量；A4为牦牛皮胶多肽高剂量；

图5中：A为加入ADP前，B为加入ADP后。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）磨皮：将脱毛脱脂后的青藏高原牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成10cm的方块，置磨皮机中磨去表皮，清洗干净；

（2）加热：将磨去表皮的牦牛皮按1:1的比例加入pH为1，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，微波加热2 min，冷却至室温；

（3）提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.1h；

（4）配制酶解液：按照物料比胃蛋白酶：牦牛皮=1:1（w/w），酶解温度为20°C，酶解时间为0.5 h，将酶解液微波加热2 min，冷却至室温；

（5）离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心2 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

（6）分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为0.02 µm，冷冻干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

上述方法制得的牦牛皮多肽具有补血止血功效。

实施例2

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）磨皮：将脱毛脱脂后的青藏高原牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成15cm的方块，置磨皮机中磨去表皮，清洗干净；

（2）加热：将磨去表皮的牦牛皮按1～10的比例加入pH为9，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，微波加热30 min，冷却至室温；

（3）提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.5 h；

（4）配制酶解液：按照物料比胃蛋白酶+木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶+复合蛋白酶：牦牛皮=1:100（w/w），酶解温度为45°C，酶解时间为24 h，将酶解液微波加热30 min，冷却至室温；

（5）离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心30 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

（6）分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为2.0 µm，冷冻干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

上述方法制得的牦牛皮多肽具有补血止血功效。

实施例3

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）磨皮：将脱毛脱脂后的青藏高原牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成13cm的方块，置磨皮机中磨去表皮，清洗干净；

（2）加热：将磨去表皮的牦牛皮按1:5的比例加入pH为4，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，微波加热15 min，冷却至室温；

（3）提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.3 h；

（4）配制酶解液：按照物料比胃蛋白酶+木瓜蛋白酶：牦牛皮=1:50（w/w），酶解温度为35°C，酶解时间为12 h，将酶解液微波加热17 min，冷却至室温；

（5）离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心18 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

（6）分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为0.06 µm，冷冻干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

上述方法制得的牦牛皮多肽具有补血止血功效。

实施例4

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700 cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）磨皮：将脱毛脱脂后的青藏高原牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成11.5cm的方块，置磨皮机中磨去表皮，清洗干净；

（2）加热：将磨去表皮的牦牛皮按1:6.8的比例加入pH为7.5，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，微波加热8 min，冷却至室温；

（3）提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.4 h；

（4）配制酶解液：按照物料比胃蛋白酶+木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶：牦牛皮=1:70（w/w），酶解温度为42°C，酶解时间为18 h，将酶解液微波加热20 min，冷却至室温；

（5）离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心20 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

（6）分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为0.09 µm，冷冻干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

上述方法制得的牦牛皮多肽具有补血止血功效。

实施例5

牦牛皮多肽具有补血止血双向调节功效验证试验

（一）以健康昆明小白鼠（雌雄各半，4周龄，体重在18~22克，由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供【合格证号为SCXK(甘)】为实验动物，针对贫血模型动物，将本发明产品0.78g/kg/d对实验组小鼠连续灌胃给药21天，并设空白对照组、阳性对照组，给药组连续给药14天观察各组小鼠一般体征，检测外周血象，计算脾脏和胸腺系数，结果如下（详见附图1）：

（1）牦牛皮胶多肽对贫血小鼠脾脏的形态结构

结果显示，模型组红髓白髓界限不清，淋巴细胞数目和脾小体减少，牦牛皮多肽给药组脾脏淋巴细胞增多，白髓与红髓的界限变清晰。

（2）牦牛皮胶多肽对贫血小鼠脏器系数的影响

牦牛皮胶多肽组能使脾脏系数显著降低，使胸腺系数随给药时间延长显著升高（详见表1）。

表1 牦牛皮胶多肽对贫血小鼠脏器系数的影响（n=10）

注：与空白组相比^* P<0.05，^** P<0.01；与模型组相比^# P<0.05，^## P<0.01

（3）牦牛皮胶多肽对贫血小鼠血象红系参数的影响

牦牛皮胶多肽给药，RBC、HGB、HCT、MCH和MCHC显著升高（详见表2）。

表2 牦牛皮胶多肽对贫血小鼠血象红系参数的影响（n=10, x±s ）

注：与空白组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比#P<0.05，##P<0.01

红细胞数量：模型组与空白组具有显著性差异，牦牛皮胶多肽能显著增加红细胞数量，与阳性组阿胶组一致。

血红蛋白量：模型组与空白组具有显著性差异，牦牛皮胶多肽能显著增加血红蛋白数量，与阳性组阿胶组一致。

红细胞压积：模型组与空白组具有显著性差异，牦牛皮胶多肽能显著增加红细胞压积，与阳性组阿胶组一致。

平均血红蛋白量：模型组与空白组具有显著性差异，牦牛皮胶多肽能显著增加平均血红蛋白量，与阳性组阿胶组一致。

平均血红蛋白浓度：模型组与空白组具有显著性差异，牦牛皮胶多肽能显著增加平均血红蛋白浓度，与阳性组阿胶组一致。

（二）以健康昆明小白鼠（雌雄各半，4周龄，体重在18~22克，由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供【合格证号为SCXK(甘)】为实验动物，本发明产品0.78g/kg/d对实验组小鼠连续灌胃给药7天，并设空白对照组、阳性对照组，采用剪尾法测定出血时间，玻片法和毛细管法检测凝血时间，全血测定P-选择素的含量，结果如下：

（1）牦牛皮胶多肽对小鼠血小板聚集作用的影响—BT和CT测定

结果显示，牦牛皮胶多肽能显著缩短小鼠出血时间及凝血时间（详见附图2）。

（2）牦牛皮胶多肽对小鼠血小板聚集作用的影响—P-选择素含量测定

结果显示，牦牛皮胶多肽能提高小鼠P-selection的表达量（详见附图3）。

（3）牦牛皮胶多肽对大鼠血小板聚集作用的影响——大鼠血小板膜蛋白Ⅰa/Ⅱa;Ⅱb/Ⅲa 和Ⅳ含量测定

结果显示，牦牛皮胶多肽能提高大鼠血小板膜蛋白Ⅰa/Ⅱa含量；能显著大鼠血小板膜蛋白Ⅱb/Ⅲa 和Ⅳ含量（详见附图4）。

（4）牦牛皮胶多肽对大鼠血小板CD62P活化率的测定

结果显示，牦牛皮胶多肽提高了大鼠血小板CD62P的活化率（详见表3）。

表3牦牛皮胶多肽对大鼠血小板膜CD62P的影响

注：与空白组相比*P<0.05，**P<0.01

牦牛皮胶多肽中剂量组显著提高了大鼠血小板CD62P的活化率，与阳性组云南白药组一致。

（5）牦牛皮胶多肽对大鼠血小板聚集率的影响

结果显示，ADP活化后血小板的分布，加入ADP后R2细胞群明显增多，直观地表明血小板发生了聚集。小鼠（n=7）经ADP（终浓度为20 μg/mL）激活后其血小板聚集率明显上升（P<0.01）（详见附图5）。

综上所述，本发明产品能显著改善贫血小鼠脾脏的形态结构，使贫血小鼠脾脏淋巴细胞增多，白髓与红髓的界限变清晰，给药组能使脾脏系数显著降低，使胸腺系数随给药时间延长显著升高，增加红细胞数量，提高血红蛋白含量，由此表明本发明所得产品具有补血作用。本发明产品能显著促进血小板活化，能促进血小板活化早期颗粒的释放及相关膜蛋白的表达，流式细胞分析法测量结果，非常明显的（P<0.01）促进血小板聚集的作用，由此表明本发明所得产品具有早期影响血小板聚集功能，即本发明产品具有补血止血双向调节的功效。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽，其特征在于，该牦牛皮多肽分子量由17KDa、34 KDa、43 KDa组成，肽键紫外最大吸收波长在216 nm处，酰胺I带红外光谱在1600~1700cm^-1处，酰胺II带红外光谱在1560~1500 cm^-1处，酰胺III红外光谱在1234~1237 cm^-1处。

2.权利要求1一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

磨皮：将脱毛脱脂后的牦牛皮清洗干净，剪裁器切割成10～15cm的方块，磨去表皮，清洗干净；

加热：将磨去表皮的牦牛皮按1:1～10的比例加入pH为1～9，浓度为0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液中，加热2～30 min，冷却至室温；

提沫：取纯净水，加热至水沸，放入牦牛皮提沫，时间0.1～0.5 h；

配制酶解液：按照物料比为酶：牦牛皮=1:1～100（w/w），酶解温度为20～45°C，酶解时间为0.5～24 h，将酶解液加热2～30 min，冷却至室温；

离心浓缩：将步骤（4）的酶解液离心力13500*g，离心2～30 min，收集到上清液，浓缩至一定比例；

分离干燥：取牦牛皮浓缩液，超滤膜分离，膜孔径为0.02～2.0 µm，干燥，得到分子量由17Ka、34 KDa、43 KDa组成的牦牛皮多肽。

3.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的牦牛皮为青藏高原牦牛的皮。

4.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的磨皮是在磨皮机中进行。

5.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的配制酶解液，按照物料比为酶：牦牛皮=1:1～50（w/w），酶解温度为20～45°C，酶解时间为0.5～12 h，将酶解液加热2～30 min，冷却至室温。

6.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）配制酶解液中所述的酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶的一种或多种。

7.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，上述制备方法中所述的加热均为微波加热。

8.根据权利要求2所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述的干燥为冷冻干燥。

9.根据权利要求2-8任一项所述的一种具有补血止血功效的牦牛皮多肽的制备方法，其特征在于，所制得的牦牛皮多肽具有补血功效。