CN109821009B - 轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途 - Google Patents
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Abstract
轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途，具体来说是轴突导向因子重组蛋白在制备治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍药物中的应用。本发明提供血管内皮来源的Semaphorin3G参与调控认知功能的重要依据，提供脑内血管内皮细胞与神经元之间通过分泌蛋白进行跨细胞类型的配体受体信息交流的新疾病研究模型。采用本发明提供的Semaphorin3G蛋白和Semaphorin3G基因腺相关病毒载体能够治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍。我们的发明将为认知功能障碍改善药物的研发提供候选药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途，尤其是在制备改善认知功能疾病药物中的应用。
背景技术
记忆是认知功能的一个重要方面，是大脑对经历过事物的识记、保持、再现或再认，是思维、想象等高级心理活动的基础。很多脑相关疾病（如痴呆症）会出现记忆功能的障碍，其中阿尔兹海默氏症与血管性痴呆在痴呆症病例中占据了80%以上，这两种疾病存在共同的危险因素，即脑内小血管病变。因此，脑内小血管功能的异常和认知功能损害有着密切的关系。血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）特指由各类脑血管病危险因素（如高血压病、糖尿病和高脂血症等）和脑血管疾病引起的从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征，是一种获得性高级认知功能障碍综合征。如果对血管病危险因素进行积极的防治，可以延缓VCI的病理进程。目前对于VCI的治疗主要是通过治疗血管疾病和处理其他危险因素来改善认知功能，在解析血管源性脑功能障碍发病机制和靶标发现的基础上，通过设计靶向特定脑疾病的药物来治疗认知功能障碍是重要的研究策略。
Semaphorin3G（简称Sema3G），是在2005年首次被报道发现的Semaphorin家族中一员，属于Semaphorin3家族，为分泌型蛋白。Sema3G结构域包含了Sema结构域，PSI结构域和引导分泌的信号肽。Sema3G是由血管分泌 Sema3G具有抵抗胶质瘤细胞迁移的功能，体外细胞实验发现，Sema3G的表达有助于内皮细胞的迁移。Sema3G在肾小球足细胞中具有抵抗脂多糖引起的炎症的作用。但是到目前为止，关于Sema3G在中枢神经***中的作用尚未见报道。由于Sema3G来源于血管，鉴于其家族其他成员在神经***中所发挥的重要作用，我们推测来源于血管的分泌蛋白Sema3G可能在中枢神经中发挥着重要的作用。在文献调研中，我们从已公开发表的数据库中筛选发现Sema3G来源于血管内皮细胞，而非其他类型细胞。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途，构建了一种血管内皮细胞敲除Semaphorin3G转基因小鼠。从细胞和整体动物水平试验证明了Semaphorin3G能够有效逆转改善认知功能障碍，为Semaphorin3G在基因治疗痴呆等认知功能障碍疾病应用提供了实验证据。
技术方案：轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G在制备治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍药物中的应用。
上述轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G为氨基酸全长序列或包含该重组蛋白的氨基酸序列。
表达轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的腺相关病毒载体在制备治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍药物中的应用。
轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G在构建基因敲除小鼠模型中的应用。
基因敲除小鼠模型的具体构建方法为：首先构建Sema3G f/f 小鼠，在Sema3G 基因的第2,3,4号外显子两端***loxP位点，之后利用Cre/loxP***，将Cdh5-Cre小鼠与Sema3G f/f 杂交得到Cdh5-Cre;Sema3G f/n 小鼠，再将Sema3G f/f 和Cdh5-Cre;Sema3G f/n 杂交得到Cdh5- Cre;Sema3G f/f 小鼠，同窝的Sema3G f/f 做对照。
上述基因敲除小鼠模型在筛选和评价治疗认知功能障碍药物中的应用。
有益效果：本发明提供血管内皮来源的Semaphorin3G参与调控认知功能的重要依据，提供脑内血管内皮细胞与神经元之间通过分泌蛋白进行跨细胞类型的配体受体信息交流的新疾病研究模型。采用本发明提供的Semaphorin3G蛋白和Semaphorin3G基因腺相关病毒载体能够治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍。我们的研究将为认知功能障碍改善药物的研发提供药物靶标和候选药物。
附图说明
图1为一种血管内皮细胞敲除Semaphorin3G基因小鼠的构建流程图；其中A为构建Sema3G f/f 小鼠策略图，B为内皮细胞Sema3G条件性消除小鼠构建策略图。
图2为Semaphorin3G重组蛋白和基因过表达所需的质粒图谱；
图3为Semaphorin3G重组蛋白对脑片电生理指标的影响；其中A为膜片钳记录的Sema3G f/f 和Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片的自发性兴奋性突触后电流（mEPSC），上图为mEPSC的代表图，下图为mEPSC的频率的统计图；B为膜片钳记录的Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片孵育Sema3G重组蛋白的自发性兴奋性突触后电流（mEPSC），上图为mEPSC的代表图，下图为mEPSC的频率的统计图。Cdh5-Cre;Sema3G f/f +Sema3G表示Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片孵育Sema3G重组蛋白；Cdh5-Cre;Sema3G f/f+control 表示Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片孵育重组蛋白的溶解液（无Sema3G重组蛋白）；
图4为Semaphorin3G过表达对认知功能的改善作用图：A为过表达Sema3G的腺相关病毒及对照病毒构建图；B 左侧为小鼠海马区中Sema3G蛋白的表达量电泳图，右侧为Sema3G蛋白的表达定量图；C为Sema3G过表达病毒注射后小鼠情景记忆水平对比图；D为Sema3G过表达病毒注射后Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠记忆水平图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
实施例1 一种血管内皮细胞敲除Semaphorin3G基因小鼠
1）首先构建Sema3G f/f 小鼠，Sema3G 基因的第2,3,4号外显子两端***loxP位点（图1：A）；之后利用Cre/loxP***，将Cdh5-Cre小鼠与Sema3G f/f 杂交得到Cdh5-Cre;Sema3G f /n 小鼠，再将Sema3G f/f 和Cdh5-Cre;Sema3G f/n 杂交得到Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠（即内皮细胞Sema3G条件性消除小鼠），同窝的Sema3G f/f 做对照（图1：B）。
（2）动物基因型鉴定：在动物2周龄时剪少量的脚趾和尾巴，加入300 μL 裂解液和2mL 20 mg/mL的蛋白酶K于55℃孵育过夜。第二天13000转/分钟离心10分钟去除毛发等组织，吸取上清150μL至新的EP管，加入150μL异丙醇，EP管上下颠倒20~25次沉淀基因组DNA。用13000转/分钟离心10分钟，弃去液体，每管加入80μL H2O，取4μL作PCR鉴定基因组。反应体系为：10μL Taq mix，上下游引物各0.5μL（上游引物序列：AGAGATCTCCTGTCTACCAACCG；下游引物序列：GGCACACTCCGTCAAAGGGT），DNA样本4μL，双蒸水5μL。
PCR程序如下：
Cdh5-Cre基因鉴定：变性温度94℃，维持30秒，退火温度60℃，维持30秒，复性温度72℃，维持30秒，循环30次，72℃维持5分钟。
Sema3G基因鉴定：变性温度95℃，维持120秒，退火温度61.7℃，维持30秒，复性温度72℃，维持45秒，循环40次，72℃维持5分钟。
实施例2 Semaphorin3G重组蛋白和基因过表达
（1）质粒构建
1）将目的片段进行PCR扩增后，割胶、纯化。根据设计的引物末端酶切位点的信息，对目的片段及载体用相同的限制性内切酶做酶切，一般是在37℃水浴锅中反应2-4小时。然后经由琼脂糖凝胶电泳将条带分离后，割取目的片段，进行凝胶回收。
2）纯化后的载体及PCR片段通过NanoDrop仪器测定浓度。根据载体:目的片段=1:3比例进行连接。连接体系为10微升：10×T4 DNA连接酶缓冲液1微升，T4 DNA连接酶1微升，载体: 加入目的片段，使反应终体积为10微升。16℃水浴连接过夜。
3）转化。将感受态DH5置于冰上融化。完全融化之后将连接产物转移到感受态中，在冰上放置20到25分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，继续置于冰上3到5分钟。之后加入不含抗生素的LB培养液1毫升，在37℃摇床上培养60分钟，4000转/分钟离心4分钟，弃上清。将沉淀的菌体用100微升LB培养液重悬，然后转移到含有特定抗性的LB培养液里，用涂布棒涂匀菌液，倒扣于37℃孵箱中培养。
4）37℃培养12小时后，可以在LB培养板上观察到单克隆菌落。挑取单一菌落，加入含有特定抗性的LB培养液中，继续于37℃摇床中培养过夜。
5）收集菌液，进行质粒提取。测定提取的质粒浓度，通过特定的限制性内切酶对***片段的大小进行验证。
6）将片段大小正确的质粒送苏州金维智公司测序，比对测序结果，确保***片段正确。
（2）重组蛋白纯化
人源性Sema3G cDNA（包含第23-782位氨基酸片段）克隆到pcDNA3.1表达载体，Sema3G cDNA片段前端为CD5信号肽，N末端和C末端各修饰8个组氨酸（His）标签，构建得到pcDNA3.1-His-Sema3G-His质粒（图2）。利用PEI（polyethylenimine linear）转染试剂，对长满90%左右的HEK293T细胞，瞬时转染表达上述质粒，转染8小时后，细胞培养基更换为Opi-MEN培养基（Gibco™），转染24小时后，加入5毫摩尔/升的正丁酸钠。转染4-5天后收集细胞上清，离心除去细胞碎片，利用HisTrap HP column（GE Health）和蛋白纯化仪（AKATA）纯化得到人源性Sema3G重组蛋白，测定蛋白浓度后，分装，-80℃保存。
实施例3 Semaphorin3G重组蛋白对离体脑片电生理指标的影响
重组Sema3G蛋白孵育能够逆转Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠突触传递功能下降的表型。
图3：A利用膜片钳记录的Sema3Gf/f和Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片的自发性兴奋性突触后电流（mEPSC），上图为mEPSC的代表图，下图为mEPSC频率的统计图。 结果提示：相较于Sema3G f/f 小鼠，Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠海马CA1锥体神经元的兴奋性突触后电流（mEPSC）的频率明显降低。 图3：B利用Sema3G重组蛋白对Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠离体海马脑片预孵育 (2h) （用Cdh5-Cre;Sema3G f/f +Sema3G表示），而Cdh5-Cre;Sema3G f/f+control 表示Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠脑片孵育重组蛋白的溶解液（无Sema3G重组蛋白）；上图为mEPSC的代表图，下图为mEPSC的频率的统计图。 结果提示：Sema3G重组蛋白能够显著逆转Cdh5- Cre;Sema3G f/f 小鼠海马CA1锥体神经元mEPSC频率的下降， 表明Sema3G能增加兴奋性突触传递功能。
实施例4 Semaphorin3G过表达对认知功能的改善作用
构建了过表达Sema3G的腺相关病毒及对照病毒（图4：A）。其中，过表达Sema3G的腺相关病毒，利用CMV强启动子驱动Sema3G (第23-782个氨基酸)蛋白的表达，且Sema3G蛋白C端融合表达3x Myc 标签。对照病毒，利用CMV强启动子驱动绿色荧光蛋白ZsGreen的表达。将过表达Sema3G的腺相关病毒及对照病毒注射到2月龄大小的Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠及对照Sema3G f/f 小鼠的双侧海马CA1脑区中，1个月后进行认知相关的行为学测试。免疫蛋白印记结果表明，相较于对照病毒，Sema3G过表达病毒能够增加小鼠海马区中Sema3G蛋白的表达（图4：B）。行为学功能检测包括：（1）条件恐惧实验，实验分为三阶段：训练阶段，情景依赖的学***比Sema3G f/f 小鼠显著降低，Sema3G过表达病毒注射后能够缓解Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠情景记忆的下降（图4：C）；在Y迷宫测试中，对照病毒注射的小鼠中，Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠记忆水平比Sema3G f/f 小鼠显著降低，Sema3G过表达病毒注射后能够缓解Cdh5-Cre;Sema3G f/f 小鼠记忆水平的下降（图4：D）。以上结果提示，血管内皮细胞Sema3G缺失引起的小鼠认知功能障碍是可以逆转的，调控Sema3G信号能够改善血管源性认知功能障碍。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagatctcc tgtctaccaa ccg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcacactcc gtcaaagggt 20
Claims (2)
1.轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G在制备治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍药物中的应用。
2.表达轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的腺相关病毒载体在制备治疗基于血管源性病理改变导致的认知功能障碍药物中的应用。
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