CN109820132A - 细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶工程技术领域的细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用，尤其涉及同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮中的应用。本发明通过实验证实细菌漆酶CotA蛋白能够不依赖任何介体同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。

Description

细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用，特别是同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮中的应用。

背景技术

霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，具有致癌作用、遗传毒性、生殖毒性、神经毒性和免疫抑制作用，动物采食霉变日粮后会出现生长抑制、疾病易感性增加、代谢紊乱、繁殖障碍等霉菌毒素中毒症状，另外霉菌毒素代谢产物可以残留在动物源性食品中，通过食物链进入人体威胁人类健康。粮食谷物在田间就会感染产毒素霉菌，如果环境温度、湿度适宜，在加工、运输、储存过程中霉菌会继续生长繁殖，毒素含量会继续增加。据国际粮农组织(FAO)估计，全世界每年有25％的谷物受到霉菌毒素污染，平均有2％不能食用，加之因毒素污染导致的人和动物中毒、疾病和死亡，造成的社会经济损失难以估量。黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其中黄曲霉毒素B1的毒性和危害最大，黄曲霉毒素B1急性毒性是***的10倍，砒霜的68倍，其分子结构中双呋喃环及氧杂奈邻酮环与其毒性及致癌性密切相关。玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，是一种主要由禾谷镰刀菌产生的非类固醇类、具有***作用的霉菌毒素，化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内脂，其中内酯键和苯环C4号位上的羟基是玉米赤霉烯酮的主要毒性基团。

霉菌毒素生物降解是指在微生物及其产生的特效酶的作用下将霉菌毒素转化成无毒或低毒的代谢产物，具有安全、高效和环保等优点，是当下饲料和食品中霉菌毒素脱毒的发展趋势。目前国内外报道的能够降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的酶主要是过氧化物酶，如辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶等，此外来源于真菌的漆酶也被报道具有降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮活性。过氧化物酶在催化降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮过程中需要以过氧化氢为底物，真菌漆酶催化降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮需要介体的参与，因此过氧化物酶和真菌漆酶用于饲料和食品中霉菌毒素脱毒有效性和安全性亟需进一步评估。此外，具有黄曲霉毒素降解活性的蛋白还包括来源于假蜜环菌的黄曲霉毒素氧化酶ADTZ以及来源于分枝杆菌的F420H2依赖还原酶FDR；具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白还包括来源于红粉粘帚霉的内酯水解酶ZHD101以及来源于葡萄顶枯病菌的玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N2。

越来越多证据表明，其他性质未明的酶也可能参与降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮这两种具有苯环和内酯环结构的霉菌毒素。因此，寻找和开发新的酶类，用于霉菌毒素的生物降解势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供细菌漆酶CotA蛋白在霉菌毒素脱毒中的应用。用于谷物、粮食、饲料、食品、水果、牛奶等及其加工副产物、工业乙醇加工副产物DDGS等材料中霉菌毒素脱毒。

为此，本发明的技术方案如下：

细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素上的应用，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇。

上述应用中，所述细菌漆酶CotA蛋白来源于芽孢杆菌。

上述应用中，所述芽孢杆菌可以为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)或克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)，优选为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

上述应用中，其中所述细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列可以为：

SEQ ID NO.1所示序列；

或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或***；

或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。

上述应用中，编码所述细菌漆酶CotA蛋白的核苷酸序列为：

SED ID NO.2所示序列；

或者SED ID NO.2所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或***；

或者与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％以上的序列一致性。

一种食品或饲料添加剂，包含细菌漆酶CotA蛋白以及生理上可接受的载体，所述漆酶CotA蛋白的含量为1-10％。

所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、石灰石、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉和PVA中的一种或多种。

上述添加剂中，细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列可以为：

SEQ ID NO.1所示序列；

或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或***；

或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。

上述添加剂中，还包括微生态制剂，所述微生态制剂为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。

上述添加剂中，所述添加剂还包括另外的酶；所述另外的酶选自：黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb、PEPAc或PEPAd，弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、淀粉酶、***糖酶、***呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，包括β-葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。

上述添加剂中，所述微生态制剂的含量为0-20％；

上述添加剂中，所述另外的酶的含量为0-9％。

上述添加剂的制备方法，包括以下步骤：将细菌漆酶CotA蛋白与其生理上可接受的载体混合，配制成含有漆酶CotA蛋白的添加剂，进一步的，或者再与微生态制剂和另外的酶按一定比例混合，得到添加剂；该添加剂中CotA蛋白含量为1-10％。

上述添加剂中，细菌漆酶CotA蛋白：生理上可接受的载体：微生态制剂：另外的酶的质量比例可以为：1：70：20：9或2：70：20：8或3：70：20：7或4：70：20：6或5：70：20：5或6：70：20：4或7：70：20：3或8：70：20：2或9：70：20：1或10：70：20：0。

一种降解霉菌毒素的方法，包括将上述细菌漆酶CotA蛋白或上述添加剂处理含有霉菌毒素的材料。

上述方法中，所述处理为将上述细菌漆酶CotA蛋白或上述添加剂和含有霉菌毒素的材料混合。

上述方法中，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇。

上述方法中，所述含有霉菌毒素的材料为谷物、粮食、饲料、食品、水果、牛奶等及其加工副产物或工业乙醇加工副产物DDGS等。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素方面的应用，实验证实细菌漆酶CotA蛋白能够不依赖任何介体同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。

附图说明

图1所示为重组质粒PET31b-CotA的表达产物纯化后SDS-PAGE图；其中泳道1为纯化重组CotA蛋白，泳道M为蛋白分子量标准(116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)。

图2所示为重组CotA蛋白降解AFB1的HPLC分析结果(A为AFB1空白对照组，B加CotA蛋白处理组)。

图3所示为重组CotA蛋白降解ZEN的HPLC分析结果(A为ZEN空白对照组，B加CotA蛋白处理组)。

图4所示为不同pH条件下CotA蛋白对AFB1和ZEN的降解情况。

图5所示为不同温度条件下CotA蛋白对AFB1和ZEN的降解情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员用到的常规手段。

在本发明实施例中使用的主要实验材料和试剂为：

大肠杆菌表达载体PET-31b、克隆菌株大肠杆菌DH5α、表达菌株大肠杆菌Rosseta(DE3)均购自Invitrogen公司。限制性核酸内切酶和DAN连接酶购自NEB公司，黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮标准品购自sigma公司，其它试剂为国产分析纯。

实施例1 CotA蛋白的获得及表达

以地衣芽孢杆菌基因组DNA为扩增模板，扩增CotA蛋白的编码基因，然后构建含有CotA蛋白编码基因序列的重组表达载体及其工程菌，并表达CotA蛋白。具体步骤如下：

1、编码CotA蛋白基因的克隆

1.1按以下步骤提取地衣芽孢杆菌基因组DNA

(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板上，37℃静置培养12h。

(2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，180r/min，37℃条件下培养12h。

(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，枪头吹旋使菌体悬浮，37℃温浴60min；12000r/min离心1min收集菌体，弃上清。

(5)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。

(6)向管子里加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀。

(7)加入25μL裂解液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20min，其间颠倒混匀1-2次。

(8)加入250μL缓冲液B，振荡5s充分混匀。

(9)加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15s。

(10)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

(11)向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

(12)向吸附柱中加入700μL缓冲液W2，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

(13)向吸附柱中加入500μL缓冲液W2，12000r/min离心3min，倒掉废液。

(14)将吸附柱放入一个干净的离心管中，室温放置数分钟，向吸附膜的中间部位悬空滴加150μL洗脱液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。

1.2地衣芽孢杆菌CotA蛋白编码基因扩增，步骤如下：

依照载体PET-31b多克隆位点，选择NdeI和XhoI为酶切位点，设计上游引物P1和下游引物P2，由上海生工生物工程技术有限公司合成。设计上游引物P1和下游引物P2序列如下：

上游引物P1：5'ATGAAACTTGAAAAATTCGTTG3'

下游引物P2：5'TTATTGATGACGAACATCTG3'

以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板进行扩增，其反应条件为：

扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s，72℃延伸1min30s反应30个循环；72℃彻底延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2、含有CotA蛋白编码基因序列的重组表达载体构建

用NdeI和XhoI双酶切上一步回收的PCR产物以及PET-31b质粒，酶切体系如下：

PCR产物/PET-31b质粒	30μL
		NdeI	1μL
XhoI	1μL
		10×CutSmart Buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>	13μL
		总体积	50μL

酶切条件为：37℃水浴30min。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物和质粒酶切片段。

上述酶切回收的PCR产物和质粒经T4DNA连接酶16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经Amp抗性平板筛选，挑取阳性转化子，提取转化质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株DH5α/PET-31b-CotA。

3、CotA蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化

3.1 CotA蛋白诱导表达

将转化有PET-31b-CotA质粒的重组大肠杆菌Rosseta(DE3)接种于5mL液体LB培养基中活化过夜，按1：100比例转接到500mL装液量为300mL的三角瓶中，180r/min，37℃条件下培养至OD600为0.6，添加终浓度为0.1mM IPTG诱导目的蛋白表达。

3.2 CotA蛋白纯化

收集发酵液，4℃，12000rpm离心30min，弃上清；用pH7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，4℃，12000rpm离心30min，弃上清，重复洗涤菌体三次。然后将菌体细胞重悬在1mg/mL的binding buffer中，超声破碎，4℃，12000rpm离心10min，收集上清并过滤。由于表达的CotA蛋白C端带有组氨酸标签(6×His)，因此使用镍离子亲和层析柱(Ni2⁺-NTA)纯化重组蛋白，平衡、上样、洗脱等步骤参见Qiagen使用手册。纯化后的蛋白用截留管(10kDa)超滤去除其中含有的咪唑，采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果，结果如图1所示，泳道1为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株表达的蛋白质的分子量约为60kDa，与理论分子量大小一致。

实施例2 CotA蛋白对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮降解活性检测

将黄曲霉毒素B1溶解到二甲基亚砜中配成20μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：430μL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH8.0)，20μL CotA蛋白(10μg)，50μL黄曲霉毒素B1溶液。以未加入CotA蛋白的体系作为对照。反应在37℃下进行12h后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测，根据AFB1浓度的变化来分析CotA蛋白对AFB1是否具有降解活性。

高效液相色谱检测AFB1的色谱条件为：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相：甲醇-水(45：55)；流速：1mL/min；泵压：75bar；进样量：20μL；荧光检测器检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm；采集时间：20分钟。

在上述色谱条件下，如图2所示，对照组样品在保留时间RT＝12.4min处有强吸收峰，而加入CotA蛋白组基本无AFB1目标峰检出，经吸收峰面积计算，已有95％的AFB1分子被降解，表明重组CotA蛋白具有黄曲霉毒素B1降解活性。

将玉米赤霉烯酮溶解到乙腈中配成100μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：430μL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH8.0)，20μL CotA蛋白(10μg)，50μL玉米赤霉烯酮溶液。以未加入CotA蛋白的体系作为对照。反应在37℃下进行12h后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测，根据ZEN浓度的变化来分析CotA蛋白对ZEN是否具有降解活性。

高效液相色谱检测ZEN的色谱条件为：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相：乙腈-水-甲醇(46：46：8)；流速：1mL/min；泵压：45bar；进样量：20μL；荧光检测器检测波长：λex＝274nm，λem＝440nm；采集时间：18分钟。

在上述色谱条件下，如图3所示，对照组样品在保留时间RT＝12.2min处有强吸收峰，而加入CotA蛋白组基本无ZEN目标峰检出，经吸收峰面积计算，已有95％的ZEN分子被降解，表明重组CotA蛋白具有玉米赤霉烯酮降解活性。

实施例3 pH对CotA蛋白降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮活性的影响

为测试在不同pH条件CotA蛋白降解AFB1活性，采用案例实施2所用的反应体系：430μL缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5-6；0.1M磷酸钠缓冲液，pH7-8；0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9)，20μLCotA蛋白(10μg)，50μL黄曲霉毒素B1溶液。反应在37℃下进行不同时间(1、3、6、9、12h)后加入500μL甲醇终止反应，采用案例实施2所述方法检测体系中残留的AFB1含量。结果如图4所示，在中性及偏碱性条件下，CotA蛋白降解AFB1活性相对较高，最适pH为8.0。

为测试在不同pH条件下CotA蛋白降解ZEN活性，采用案例实施2所用的反应体系：430μL缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH6；0.1M磷酸钠缓冲液，pH7-8；0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9-10)，20μL CotA蛋白(10μg)，50μL玉米赤霉烯酮溶液。反应在37℃下进行不同时间(1、3、6、9、12h)后加入500μL甲醇终止反应，采用案例实施2所述方法检测体系中残留的ZEN含量。结果如图4所示，在中性及偏碱性条件下，CotA蛋白降解ZEN活性相对较高，最适pH为8.0。

实施例4温度对CotA蛋白降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮活性的影响

为测试在不同温度条件下CotA蛋白降解AFB1和ZEN活性，采用案例实施2所用的反应体系：430μL缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液，pH8)，20μL CotA蛋白(10μg)，50μL黄曲霉毒素B1溶液或玉米赤霉烯酮溶液。反应在不同温度(30、40、50、60、65、70、75、80℃)条件下进行30min后加入500μL甲醇终止反应，采用案例实施2所述方法检测体系中残留的毒素含量。结果如图5所示CotA蛋白降解AFB1最适温度为70℃，降解ZEN最适温度为75℃。

实施例5 CotA蛋白降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮酶促反应动力学参数测定

CotA蛋白降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮酶活定义为，每分钟降解1ng毒素所需要的酶量。

采用案例实施2所用的500μL反应体系：430μL缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液，pH8)，20μL CotA蛋白(10μg)，50μL黄曲霉毒素B1溶液，其中AFB1终浓度分别为1、2、5、10、25、40、50、75和100μg/mL，37℃反应30min；测定不同浓度AFB1体系中CotA催化降解AFB1的初始反应速率，根据米氏方程，用Graphpad5.0进行Michaelis-Menten回归分析，求解CotA催化降解AFB1的K_m和最大反应速率V_m，根据体系中加入的酶量，进一步求解K_cat值。同样地，在ZEN浓度为5、10、25、50、100、150、200、300、400μg/mL体系中，测定CotA催化降解ZEN初始反应速率，求解对应的酶促反应动力学参数。结果如表1所示。

表1为CotA催化降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮反应动力学参数

实施例6 CotA催化降解AFM1、AFG1、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇的效率

将AFM1、AFG1、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇分别溶解到二甲基亚砜中配成20μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：430μL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0-8.0)，20μLCotA蛋白(10μg)，50μL各储备的溶液。以未加入CotA蛋白的体系作为对照。反应在37℃下进行12h后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测，根据各毒素浓度的变化来分析CotA蛋白对几类毒素是否具有降解活性。具体实施方案如实施例2，CotA催化降解AFM1、AFG1、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇的效率见表2。

表2 CotA催化降解AFM1、AFG1、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇的效率

实施例7一种添加剂及其制备方法

称取添加剂总质量的90％的载体(麦芽糖糊精与滑石粉按质量比2:1比例混合)，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入细菌漆酶CotA蛋白，得到添加剂。

实施例8一种添加剂及其制备方法

称取添加剂总质量的9％的载体(麦芽糖糊精与滑石粉按质量比1:1比例混合)，然后再按添加剂总质量的1％的比例混入细菌漆酶CotA蛋白，最后按添加剂总量的90％混入地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合制剂粉(地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌质量比为1：1)，得到添加剂。

实施例9一种添加剂及其制备方法

先将占添加剂总质量的70％的淀粉与占添加剂总质量的10％的枯草芽孢杆菌混合，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入细菌漆酶CotA蛋白，最后按添加剂总量的10％混入玉米赤霉烯酮内酯酶，得到添加剂。

实施例10一种添加剂及其制备方法

先将占添加剂总质量的70％麦芽糖糊精与占添加剂总质量的20％的嗜酸乳杆菌混合，然后再按添加剂总质量的5％的比例混入固体细菌漆酶CotA蛋白，最后按添加剂总量的5％混入黄曲霉毒素去毒酶，得到添加剂。

实施例11

用实施例8所述的添加剂处理自然霉变玉米中的AFB1。

将添加剂与自然霉变的玉米(AFB1＝50ppb)按0.1％比例混合，在体外模拟动物胃肠液中消化24h，用于降解自然霉变谷物、粮食或饲料中的AFB1。

模拟胃液：准确称取2g含有自然霉变AFB1的玉米，再添加2mg添加剂，放入100mL锥形瓶中，加入25mL PBS(0.1M pH6.0),调pH到6.8，混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液，39℃，150r/min消化2h。加10mL 0.2M HCl，用1M HCl或1M NaOH溶液调pH至2.0，加1mL新鲜配制的酸性蛋白酶(50000U/g)，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

模拟小肠液：模拟胃液孵育6h以后，再加入5mL 0.6M NaOH溶液，用1MHCl或1MNaOH将pH调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶＝3:1:1)，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

反应结束后测定AFB1的降解率为91.24％。

实施例11

用实施例8所述的添加剂处理工业乙醇加工副产物DDGS中的ZEN。

将添加剂与工业乙醇加工副产物DDGS(ZEN＝3ppm)按0.1％比例混合，在体外模拟动物胃肠液中消化24h，用于降解DDGS中的ZEN。

模拟胃液：准确称取2g含有霉变的DDGS，再添加2mg添加剂，放入100mL锥形瓶中，加入25mL PBS(0.1M pH6.0),调pH到6.8，混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液，39℃，150r/min消化2h。加10mL 0.2M HCl，用1M HCl或1M NaOH溶液调pH至2.0，加1mL新鲜配制的酸性蛋白酶(50000U/g)，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

模拟小肠液：模拟胃液孵育6h以后，再加入5mL 0.6M NaOH溶液，用1M HCl或1MNaOH将pH调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶＝3:1:1)，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

反应结束后测定ZEN的降解率为93.23％。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用

<130> seqlist

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 1

Met Lys Leu Glu Lys Phe Val Asp Arg Leu Pro Ile Pro Gln Val Leu

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ser Lys Ser Lys Glu Met Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Phe Gln Gln Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Phe Gly Tyr Asn Gly Val Tyr Pro Gly Pro Thr Phe Glu Val Gln Lys

50 55 60

His Glu Lys Val Ala Val Lys Trp Leu Asn Lys Leu Pro Asp Arg His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Leu His Asp Asp Gly His His Glu His

85 90 95

Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Cys Thr Pro Ala Asp

100 105 110

Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Tyr Thr Lys Asp Phe His Ala Lys

115 120 125

Gly Pro Phe Phe Glu Arg Glu Val Tyr Glu Tyr Pro Asn Glu Gln Asp

130 135 140

Ala Thr Ala Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr Arg Leu

145 150 155 160

Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Leu Tyr Phe Ile Arg Asp Arg Glu

165 170 175

Glu Arg Ser Leu Asn Leu Pro Lys Gly Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Leu

180 185 190

Ile Gln Asp Lys Ser Phe His Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr Pro Arg

195 200 205

Gln Pro Asp Asn Pro Ser Pro Asp Leu Pro Asp Pro Ser Ile Val Pro

210 215 220

Ala Phe Cys Gly Asp Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp Pro Phe

225 230 235 240

Ala Glu Leu Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn Ala Ser

245 250 255

Asn Thr Arg Ile Phe Glu Leu Tyr Phe Asp His Asp Ile Thr Cys His

260 265 270

Gln Ile Gly Thr Asp Gly Gly Leu Leu Gln His Pro Val Lys Val Asn

275 280 285

Glu Leu Val Ile Ala Pro Ala Glu Arg Cys Asp Ile Ile Val Asp Phe

290 295 300

Ser Arg Ala Glu Gly Lys Thr Val Thr Leu Lys Asn Arg Ile Gly Cys

305 310 315 320

Gly Gly Gln Asp Ala Asp Pro Asp Thr Asp Ala Asp Ile Met Gln Phe

325 330 335

Arg Ile Ser Lys Pro Leu Lys Gln Lys Asp Thr Ser Ser Leu Pro Arg

340 345 350

Ile Leu Arg Lys Arg Pro Phe Tyr Arg Arg His Lys Ile Asn Ala Leu

355 360 365

Arg Asn Leu Ser Leu Gly Ala Ala Val Asp Gln Tyr Gly Arg Pro Val

370 375 380

Leu Leu Leu Asn Asn Thr Lys Trp His Glu Pro Val Thr Glu Thr Pro

385 390 395 400

Ala Leu Gly Ser Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Ala Gly Arg Ala

405 410 415

Ile His Pro Ile His Leu His Leu Val Gln Phe Met Ile Leu Asp His

420 425 430

Arg Pro Phe Asp Ile Glu Arg Tyr Gln Glu Asn Gly Glu Leu Val Phe

435 440 445

Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Ala Pro Asn Glu Lys Gly Leu Lys Asp

450 455 460

Thr Val Lys Val Pro Pro Gly Ser Val Thr Arg Ile Ile Ala Thr Phe

465 470 475 480

Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu His

485 490 495

Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Leu Glu Val Thr Asp Val Arg His

500 505 510

Gln

<210> 2

<211> 1542

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<400> 2

atgaaacttg aaaaattcgt tgaccggctc cccattccgc aagtgcttca accccaaagc 60

aaaagcaagg aaatgaccta ttatgaagtc accatgaaag aatttcagca gcagcttcac 120

cgcgatctgc cgccgactcg gctgtttgga tataacggag tttatcccgg ccctaccttc 180

gaagtgcaga aacacgaaaa agtcgcagtc aagtggttaa ataagcttcc ggatcgccat 240

tttctccccg tcgaccatac gcttcacgat gacggccatc acgaacatga agtgaagacg 300

gtcgttcatt tgcacggagg ctgtacgcct gctgacagcg acggatatcc tgaggcttgg 360

tacacaaaag acttccatgc aaaaggccct ttctttgaaa gggaggtgta tgaatatccg 420

aatgagcagg atgctacagc tctttggtat catgaccatg caatggccat cacaaggctg 480

aatgtatatg cggggcttgt cggtttatat tttattcgcg acagggaaga gcgttcattg 540

aacttgccga agggagaata tgaaatcccg cttttgattc aggataaatc atttcatgaa 600

gatggttcat tgttttatcc gcggcagcct gacaaccctt cgccggatct tccggacccg 660

tcgattgttc cggctttttg cggtgatacc attttagtca acggcaaggt atggcctttc 720

gctgaactgg aaccccgaaa ataccgtttt cggatactga acgcctccaa tacgagaatc 780

tttgagctgt atttcgatca tgacatcaca tgtcatcaaa tcggcacgga cggcggtctt 840

ctgcagcatc cggtcaaagt caatgaactg gtgatcgcgc cggctgaaag gtgcgatatc 900

atcgttgatt tttcacgagc agaaggaaaa accgtgacac tgaaaaaccg gatcggctgc 960

ggcggacaag acgcagatcc cgatactgat gccgacatca tgcaattccg catctcaaaa 1020

cctttgaagc aaaaagatac aagttcattg ccgagaatat tgagaaagcg cccattttac 1080

cggagacaca agatcaatgc cctcagaaat ctgtcattgg gcgcggccgt tgaccaatat 1140

ggaagacctg ttctgctttt aaacaacaca aagtggcatg aaccggtaac cgaaacaccc 1200

gcactcggca gcactgagat ctggtcgatc atcaatgccg gaagggcgat ccatccgatc 1260

catttacatc ttgttcaatt tatgattctc gaccaccggc cgtttgatat cgagcggtat 1320

caggaaaacg gagaacttgt ttttaccggt ccggcagttc ctccggcacc gaatgaaaag 1380

gggctgaaag acaccgtcaa agtacccccg ggctcagtga cgcgcattat cgccaccttt 1440

gcgccgtaca gcggcagata tgtttggcac tgccacatcc ttgagcacga agattacgat 1500

atgatgcgcc ctcttgaagt gacagatgtt cgtcatcaat aa 1542

Claims (10)

1.细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌漆酶CotA蛋白来源于芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)或克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)，优选为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列为：

SEQ ID NO.1所示序列；

或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或***；

或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述细菌漆酶CotA蛋白的核苷酸序列为：

SED ID NO.2所示序列；

或者SED ID NO.2所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或***；

或者与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％以上的序列一致性。

6.一种食品或饲料添加剂，其特征在于，包含细菌漆酶CotA蛋白以及其生理上可接受的载体，所述细菌漆酶CotA蛋白的含量为1-10％。

7.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、石灰石、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，还含有微生态制剂，所述微生态制剂为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。

9.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂还包括另外的酶；所述另外的酶选自：黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb、PEPAc或PEPAd，弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、淀粉酶、***糖酶、***呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，包括β-葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。

10.一种降解霉菌毒素的方法，其特征在于，包括步骤如下：

将细菌漆酶CotA蛋白或权利要求6-9任一项所述的添加剂处理含有霉菌毒素的材料。