CN109811003A - 一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，本发明以浮萍为材料，利用浮萍转化体系对浮萍进行转基因，筛选得到转化凡纳滨对虾抗菌肽基因pen3的浮萍。经分子生物学鉴定，浮萍基因组DNA具有pen3基因。培养浮萍后的液体培养基和浮萍提取液均具有抑菌能力。本项发明的成套浮萍表达抗菌肽***不仅完成了基因转化，而且液体培养基也具有抗菌能力，液体培养基添加到水塘后，是虾蟹培养过程中非常重要和实用的抑菌途径，还具备避免鱼虾等水生生物抗生素使用量过高的问题，是鱼虾免疫应用研究中不可缺少的关键操作。
Description
本发明得到国家重点研发计划资助(2018YFD0901301)，国家自然科学基金青年项目(31700443)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)的资助。
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法。
背景技术
浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，蛋白含量高，通过光照可控制其无性繁殖等显著优点使其成为理想的高通量外源蛋白表达和基因研究体系。抗菌肽具有广谱抗菌性，并对部分病毒、寄生虫和癌细胞等均具有抗性，同时可提高免疫力和伤口愈合，是取代常规抗生素、解决致病菌抗药性问题的极佳选择。因此，将抗菌肽替代抗生素应用于生产实践越来越受到科学工作者和水产养殖业的重视。
对虾素(Penaeidin，Pen)是特异性存在于对虾体内的一类抗菌肽,能抑制细菌生长繁殖或直接杀灭细菌,主要对革兰氏阳性菌与真菌有抑菌活性，还可以作为一种调理因子在先天免疫中间接发挥作用。对虾素由富含脯氨酸的N末端和一个富含半胱氨酸的C端组成，根据氨基酸序列和特定氨基酸被分为五个亚类，Pen-1，-2，-3，-4，-5，Penaeidins 编码基因已在多种虾中被克隆和鉴定。
同对虾种类体内，各种对虾素的表达水平不同，在凡纳滨对虾体内，Pen2、Pen3、Pen4的转录水平较高，其中以Pen3为最高，并且，Pen3是各种对虾体内普遍存在的高表达基因。pen-3与pen-5已被报道参与了对抗对虾白斑综合征病毒(white spot syndromevirus，WSSU)的过程，可利用价值非常高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，按照下列步骤进行：
(一)获得浮萍愈伤组织：无菌环境下，切除在液体培养基上培养的浮萍的假根，后横切浮萍的叶状体，利用愈伤诱导培养基对其进行愈伤组织的诱导，再利用再培培养基对浮萍愈伤进行愈伤继代，昼夜周期为16/8小时/天，光强66μmolm-2s-1， 21℃下培养愈伤组织21天；
(二)浮萍愈伤组织的转化：
(1)从甘油冻存管中用穿刺法沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；
(2)利用10ml农杆菌液体培养基小体积扩繁农杆菌；
(3)取步骤(2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50 μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD600为0.42～0.82之间时停止培养；
(4)对步骤(3)获得的菌液进行常温离心，5000g 6min，收集沉淀下来的菌体
(5)利用转化培养液溶解菌体(共培养液成分为B5液体培养基+1％蔗糖+0.2％Tween 20)；
(6)在超净台无菌条件下用消毒后的镊子夹取浮萍愈伤组织，将其转移至转化培养菌液内，室温下抽真空3次，每次1分钟；
(7)28℃缓慢振荡共培养30min；
(8)将共培养液体吸出，将外植体置于滤纸上待菌液彻底被吸干后，将愈伤组织移至固体共培养培养基上；
(9)固体共培养1～3d，长出菌圈后，用无菌水(含300mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织3～5次，滤纸吸干后，移至筛选培养基(继代培养基+30mg/L潮霉素+300mg/L 头孢霉素)上；
(10)筛选20d后，将愈伤组织移至再生培养基(含潮霉素0.5mg/L，头孢霉素300mg/L)上；
(11)20天浮萍再生成功后，将浮萍移至DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L) 中。
本发明的优点和有益效果为：
本发明以浮萍为材料，利用浮萍转化体系对浮萍进行转基因，筛选得到转化凡纳滨对虾抗菌肽基因pen3的浮萍。经分子生物学鉴定，浮萍基因组DNA具有pen3基因。培养浮萍后的液体培养基和浮萍提取液均具有抑菌能力。本项发明的成套浮萍表达抗菌肽***不仅完成了基因转化，而且液体培养基也具有抗菌能力，液体培养基添加到水塘后，是虾蟹培养过程中非常重要和实用的抑菌途径，还具备避免鱼虾等水生生物抗生素使用量过高的问题，是鱼虾免疫应用研究中不可缺少的关键操作。
附图说明
图1是再生培养基上已筛选好的浮萍愈伤组织；
图2是再生出根、叶，在DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L)中进行单株扩繁的浮萍；
图3是单株扩繁后的转基因浮萍。
图4是pen-3基因的pcr鉴定凝胶电泳图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
下文中所述的携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌保藏于本实验室，公众可通过与天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室联系取得，该凡那滨海对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌的构建方法记载于与本申请同日申请、发明名称为一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽Penaeidin3a.1载体的构建方法的专利中。
实施例1凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因的转化
(一)获得用于遗传转化的浮萍愈伤组织：切除浮萍的假根，对其叶状体进行横切，利用愈伤组织诱导培养基进行愈伤诱导，利用浮萍愈伤再培培养基进行愈伤继代，昼夜周期为16/8小时/天，光强66μmolm-2s-1，21℃下培养愈伤组织21天；
愈伤诱导培养基的组成为：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO4·7H2O、121mg/lCaCl2·2H2O、134mg/l(NH4)2SO4、169.6mg/l NaH2PO4·2H2O、0.025mg/l、 27.8mg/l FeSO4·7H2O、2.0mg/l ZnSO4·7H2O、0.025mg/l CoCl2·6H2O、0.25mg/l Na2MoO4·2H2O、0.025mg/lCuSO4·5H2O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H3BO4、10mg/l MnSO4·4H2O、27.8mg/l FeSO4·7H2O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l 维生素B6、10mg/l维生素B1、1.5％麦草畏、2.5％2,4-D、1.5％6-BA、0.6％琼脂。
上述试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用
浮萍愈伤再培培养基的组成为：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO4·7H2O、121mg/lCaCl2·2H2O、134mg/l(NH4)2SO4、169.6mg/l NaH2PO4·2H2O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H3BO4、10mg/l MnSO4·4H2O、27.8mg/l FeSO4·7H2O、2.0mg/l ZnSO4·7H2O、0.25mg/l Na2MoO4·2H2O、0.025mg/l CoCl2·6H2O、0.025mg/l CuSO4·5H2O、1.5％蔗糖、100mg/l 肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l维生素B6、10mg/l维生素B1、10mg/L PCA、2mg/L 2iP、 0.6％琼脂。
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调pH6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
(二)浮萍愈伤组织的转化：
(1)用穿刺法从甘油冻存管中沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；
(2)利用10ml农杆菌液体培养基对农杆菌进行小体积扩繁；
(3)取步骤(2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50 μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD600为0.42～0.82之间时停止培养；
(4)对步骤(3)获得的菌液进行常温离心，5000g 6min，收集沉淀下来的菌体
(5)利用转化培养液溶解菌体(共培养液成分为B5液体培养基+1％蔗糖+0.2％Tween 20)；
(6)用消毒后的镊子在超净台无菌条件下夹取浮萍愈伤组织，将其转移至转化培养菌液内，室温下抽真空3次，每次1分钟；
(7)28℃缓慢振荡共培养30min；
(8)将共培养液体吸出，将外植体置于滤纸上待菌液彻底被吸干后，将愈伤组织移至固体共培养培养基上；
(9)固体共培养1～3d，长出菌圈后，用无菌水(含300mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织3～5次，滤纸吸干后，移至筛选培养基(继代培养基+30mg/L潮霉素+300mg/L 头孢霉素)上；
(10)筛选20d后，将愈伤组织移至再生培养基(含潮霉素0.5mg/L，头孢霉素300mg/L)上；
(11)20天浮萍再生成功后，将浮萍移至DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L) 中。
实施例2Pen3基因的分子生物学鉴定
(一)浮萍总DNA的提取
采用Takarabiomed DNA试剂盒
(1)准备500μl Buffer HS I与10μl 50x DTT Buffer混合，65℃预热30～50μlElution Buffer；
(2)称取0.1g浮萍，放入1.5ml离心管加液氮迅速研磨，后立即加入(1)中液体，加入10μl RNase A混匀，56℃水浴10分钟；
(3)向(2)中加入62.5μl Buffer KAC，冰浴5min；
(4)对(3)进行离心，离心后取上层清液加入等体积Buffer GB混匀，其中，离心速度为1200rpm，时间为5min；
(5)安装Spin Column与Collection Tube，将溶液移至Spin Column中，盖好盖子，盖向轴心12000rpm离心1min，弃滤液；
(6)向Spin Column中加入500μl Buffer WA，12000rpm离心1min，弃滤液；
(7)沿管壁四周加入700μl Buffer WB，12000rpm离心1min，弃滤液；
(8)重复(7)一次；
(9)将Spin Column装至新离心管上，向膜中央加30～50μl预热好的ElutionBuffer，室温或65℃水浴2min，12000rpm离心2min；
(10)可多次重复(9)洗脱过程，将洗脱下的溶液移至新离心管中，4℃或-20℃保存，即为浮萍总DNA。
(二)pen-3基因的pcr鉴定
(1)超净台无菌条件下，用镊子夹取pcr小管，加入1μl pen-3上游引物、1μl pen-3下游引物、8μl Taq酶、9.5μl无菌水、0.5μl(一)中DNA，组成20μl pcr体系；
penaeidin 3a.1[Litopenaeus vannamei]上下游引物:
Bgl II、BamH I:GAAGATCTTC CGGGATCCCG ATGCGCCTCG TGGTCTGC 60度
Pst I:AACTGCAG TCAACCGGA ATATCCTTTC 58度
(2)PCR程序如下：
(3)取30ml电泳液与0.3g琼脂糖混合，加热至琼脂糖完全融化，倒入凝胶板中，***梳子，待胶凝后点样，点样顺序为Marker、负对照(采用WT浮萍DNA)、正对照 (采用pen-3农杆菌DNA)、样品(采用pen-3浮萍DNA)；
(4)点样完成后，160v 200A进行电泳，待黄色标识带刚好跑至凝胶边缘时，停止电泳，过程需要约35min；
(5)染色，取20ml电泳缓冲液，加入EB(终浓度为0.5μg/ml)，将凝胶放入染色液中染色10～15min后取出。
(6)放入凝胶成像仪中观察，得到结果如图4。
实施例3培养浮萍后的液体培养基和浮萍提取液的抑菌能力的验证
(1)从甘油冻存管中用穿刺法沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；
(2)利用10ml农杆菌液体培养基小体积扩繁农杆菌；
(3)取步骤(2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD600为0.42～0.82之间时停止培养；
(4)配制营养琼脂(4.4％LB肉汤+1％琼脂糖)，102.9kPa，121℃高压灭菌20min；
(5)超净台内取约20片浮萍于1.5ml离心管中，加入液氮研磨，后立即加入80μlPBS，配平后4℃，12000rpm离心5min，取上清，移至小管，冷冻为浮萍研磨液；
(6)超净台无菌用移液器吸取1ml浮萍培养基液体于1.5ml离心管中，冷冻，为浮萍培养液；
(7)计算：c＝(OD620nm*5*107)/0.20，计算使营养琼脂中农杆菌浓度为2*105～3*105个/ml，加入计算好体积的农杆菌于42℃保温的营养琼脂中，摇匀，倒入平板20ml，冷却；
(8)无菌条件下，在凝固的营养琼脂上采用直径为3mm的打孔器打孔，在圆孔内分别加入15μl浮萍培养液、15μl浮萍研磨液为实验组，另加入15μl Datko、 15μl PBS作为对照，待液体稍干后，37℃孵育过夜；
孵育过夜后实验组和DATKO组均出现抑菌圈，且大小为浮萍提取液>浮萍培养液 >DATKO，PBS组无抑菌圈出现。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，其特征在于该方法的步骤包括：
(1)获得浮萍愈伤组织：获得浮萍愈伤组织：无菌环境下，切除在液体培养基上培养的浮萍的假根，后横切浮萍的叶状体，利用愈伤诱导培养基对其进行愈伤组织的诱导，再利用再培培养基对浮萍愈伤进行愈伤继代，昼夜周期为16/8小时/天，光强66μmolm-2s-1，21℃下培养愈伤组织21天；
(2)浮萍愈伤组织的转化：
1)用穿刺法从甘油冻存管中沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；
2)利用10ml农杆菌液体培养基对农杆菌进行小体积扩繁；
3)取步骤2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD600为0.42～0.82之间时停止培养；
4)对步骤3)获得的菌液进行常温离心，5000g 6min，收集沉淀下来的菌体
5)利用转化培养液溶解菌体(共培养液成分为B5液体培养基+1％蔗糖+0.2％Tween20)；
6)用消毒后的镊子在超净台无菌条件下夹取浮萍愈伤组织，将其转移至转化培养菌液内，室温下抽真空3次，每次1分钟；
7)28℃缓慢振荡共培养30min；
8)将共培养液体吸出，将外植体置于滤纸上待菌液彻底被吸干后，将愈伤组织移至固体共培养培养基上；
9)固体共培养1～3d，长出菌圈后，用无菌水(含300mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织3～5次，滤纸吸干后，移至筛选培养基(继代培养基+30mg/L潮霉素+300mg/L头孢霉素)上；
10)筛选20d后，将愈伤组织移至再生培养基(含潮霉素0.5mg/L，头孢霉素300mg/L)上；
11)20天浮萍再生成功后，将浮萍移至DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L)中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第1)步所述的浮萍愈伤诱导培养基的组成包括：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO4·7H2O、121mg/l CaCl2·2H2O、134mg/l(NH4)2SO4、169.6mg/l NaH2PO4·2H2O、0.025mg/l、27.8mg/l FeSO4·7H2O、2.0mg/l ZnSO4·7H2O、0.025mg/l CoCl2·6H2O、0.25mg/l Na2MoO4·2H2O、0.025mg/l CuSO4·5H2O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H3BO4、10mg/l MnSO4·4H2O、27.8mg/l FeSO4·7H2O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l维生素B6、10mg/l维生素B1、1.5％麦草畏、2.5％2,4-D、1.5％6-BA、0.6％琼脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步所述的浮萍愈伤再培培养基的组成包括：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO4·7H2O、121mg/l CaCl2·2H2O、134mg/l(NH4)2SO4、169.6mg/l NaH2PO4·2H2O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H3BO4、10mg/l MnSO4·4H2O、27.8mg/lFeSO4·7H2O、2.0mg/l ZnSO4·7H2O、0.25mg/l Na2MoO4·2H2O、0.025mg/l CoCl2·6H2O、0.025mg/l CuSO4·5H2O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l维生素B6、10mg/l维生素B1、10mg/L PCA、2mg/L 2iP、0.6％琼脂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190528 |