CN103243108B - 一种茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其基因与应用。本发明钙离子结合蛋白基因BjCBP1，其碱基序列如SEQ ID NO.1；本发明所构建的重组原核表达载体pET32a-BjCBP1是由SEQ ID NO.1序列和原核表达载体pET-32a(+)构成，重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1是由SEQ ID NO.1序列和植物表达载体pCAMBIA1302构成；所述植物表达载体用于植物遗传转化，BjCBP1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成BjCBP1蛋白，从而提高植物耐逆境特性。

Description

一种茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

钙离子信号在许多细胞活动，如细胞代谢、基因表达、细胞骨架动态变化、细胞周期、细胞死亡、信号传导等过程中有重要作用。

在植物细胞中，钙离子的作用之一是作为第二信使，很多外界环境信号，如光、生物胁迫、非生物胁迫、植物激素等都会刺激胞液中Ca²⁺浓度的增加，从而引发钙离子信号传导。钙离子信号传导途径中首先响应的即是钙离子结合蛋白，其结合Ca²⁺以后会发生构想变化，使疏水面外露，从而激活或抑制其它蛋白的活性，从而引发信号传导。

高盐、干旱和低温等非生物胁迫环境对作物的产量及生长发育有很大影响，因此，有关植物抗逆性基因的研究一直是植物学研究领域的热点之一。

茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee），又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。

对于茎瘤芥，目前还未见其钙离子结合蛋白的序列以及基因功能的报道，本发明克隆了第一个茎瘤芥钙离子结合蛋白，且经大量实验研究表明，该蛋白具有提高植物抗逆性的作用，为植物抗逆性基因的研究和应用提供了新内容和新基础。

发明内容

鉴于此，本发明的目的之一是提供茎瘤芥（英文：Brassica juncea var.tumidaTsen et Lee）来源的钙离子结合蛋白（英文：calcium-binding protein）基因，将其命名为BjCBP1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该基因长627bp。

本发明的目的之二是提供茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白BjCBP1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，有208个氨基酸，且序列通过NCBI的保守结构域（conserved domains）检测知具有4个EFh结构域。

本发明的目的之三是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组原核表达载体pET32a-BjCBP1，其由SEQ ID NO.1序列与原核表达载体pET-32a(+)构成。

本发明的目的之四是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1，其由SEQ ID NO.1序列与植物表达载体pCAMBIA1302构成。

本发明的目的之五是提供茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的应用，尤其是提高植物在高盐条件的耐受力。

本发明通过茎瘤芥转录组测序获得序列片段SEQ ID NO.4，然后根据片段SEQ ID NO.4设计巢式引物并通过RACE方法扩增获得茎瘤芥第一个钙离子结合蛋白基因BjCBP1，基因编码208个氨基酸，NCBI比对预测具有4个EF-hand结构域，属于钙离子结合蛋白家族成员；通过构建BjCBP1基因的原核表达载体进行原核表达和蛋白纯化，发现BjCBP1能够结合钙离子，证明是钙离子结合蛋白；通过构建BjCBP1基因植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐逆境新种质，提高植物的逆境耐受力特性，尤其是耐盐特性，可进行植物品种改良。

附图说明

图1为本发明BjCBP1基因编码区序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明原核表达纯化后的BjCBP1蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图3为本发明重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1的构建流程图；

图4为本发明转基因型拟南芥和野生型的BjCBP1基因表达水平检测图；

图5为本发明NaCl、Mannitol和ABA条件下野生型与转基因型拟南芥种子发芽率结果图；

图6为本发明NaCl、Mannitol和ABA条件下野生型与转基因型拟南芥的生长情况摄影图；

图7为本发明NaCl和ABA条件下野生型与转基因型拟南芥的抗逆基因的表达水平检测结果图

图8为本发明NaCl下野生型与转基因型拟南芥的存活率统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

实验例1：茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的克隆

1主要试剂：柱式小量植物总RNA抽提试剂盒（W7021）购自上海华舜生物技术有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；5’-FullRACE Kit试剂盒、M-MLV反转录酶、Premix Ex Taq、DL2000DNA Marker、pMD19-T载体均购自大连宝生物工程有限公司。

2实验方法与步骤：

BjCBP1基因序列片段SEQ ID NO.4的获取：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，总RNA取小部分通过紫外分光光度计检测OD260/OD280的比值为1.92，通过琼脂糖凝胶电泳28S的亮度约是18S的2倍，说明RNA的纯度高且无降解，达到实验要求。将总RNA样品送北京华大基因研究中心进行转录组测序（RNA-seq），方法为用带有Oligo（dT）的磁珠富集茎瘤芥总RNA中的mRNA，加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒（Qiagen公司）纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly（A）并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库（200bp）用Illumina HiSeq^TM2000进行测序。通过对测序结果进行注释，选取可能的钙离子结合蛋白片段序列SEQ IDNO.4，然后根据该片段序列进行基因全长的克隆以及功能分析。

2.1BjCBP1基因5’端未知序列扩增

2.1.1总RNA提取和反转录：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，然后取约1μg总RNA通过5’-Full RACE Kit试剂盒方法去磷酸化、去帽子、加接头，最后反转录获得cDNA第一链。

2.1.2引物设计：根据转录组测序得到的已知序列SEQ ID NO.4设计两个反向巢式引物：

BjCBP1-AOUT：5'-TCGTCTCCAATAGCCGAGAAAACT-3'

BjCBP1-AIN：5'-TACCGTCTCCGTCGCAGTCCAC-3'

2.1.3巢式PCR扩增：

首先为OUT扩增：以步骤2.1.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjCBP1-AOUT和5’RACE Outer Primer（此引物为5’-Full RACE Kit试剂盒中的引物）做PCR扩增，反应体系为：ddH2O7.4μL，Premix Ex Taq10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

再做IN扩增：以OUT扩增的PCR产物为模板，采用引物BjCBP1-AIN和5’RACE Inner Primer（此引物也为5’-Full RACE Kit试剂盒中的引物）做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、58℃30s、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

2.1.4电泳：将IN扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳在450bp左右有一特异条带。

2.1.5TA克隆：将IN扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.1.6测序结果：测序获得的序列的3’端序列与SEQ ID NO.4的5’端序列完全吻合，两者成功拼接，说明成功获得BjCBP1基因的5’端序列。

2.2BjCBP1基因3’端未知序列扩增

2.2.1总RNA提取和反转录：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，然后取约1μg总RNA为模板，采用接头引物5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30MN-3'（N=A,G,C或T;M=A,G或C）（此接头引物来自Clontech公司的SMART RACE cDNA SynthesisKit试剂盒）以及M-MLV反转录酶反转获得cDNA第一链。

2.2.2引物设计：根据转录组测序得到的已知序列SEQ ID NO.4设计两个正向巢式引物：

BjCBP1-SOUT：5'-ATGCTCAGGGAGGTGGACT-3'

BjCBP1-SIN：5'-GCTATTGGAGACGAGCGGTGC-3'

2.2.3巢式PCR扩增：

首先为OUT扩增：以步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjCBP1-SOUT和3’RACE Primer（此引物为步骤2.2.1中接头引物的前部分，即5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3'）做PCR扩增，20μL反应体系为：ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、54℃30s、72℃60s，30个循环；72℃延伸10min。

再做IN扩增：以OUT扩增的PCR产物为模板，采用引物BjCBP1-SIN和3’RACE Primer做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、59℃30s、72℃50s，32个循环；72℃延伸10min。

2.2.4电泳：将IN扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳在300bp左右有一特异条带。

2.2.5TA克隆：将IN扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.2.6测序结果：测序获得的序列的5’端序列与SEQ ID NO.4的3’端序列完全吻合，两者成功拼接，说明成功获得BjCBP1基因的3’端序列。

2.3BjCBP1基因编码区序列扩增

2.3.1序列拼接：将2.1.6获得的5’端序列、2.2.6获得的3’端序列和已知序列SEQ ID NO.4进行拼接，得到BjCBP1基因全长序列SEQ ID NO.2，其全长905bp，编码区即SEQ ID NO.1序列有627bp，5’端非编码区有92bp，3’端非编码区有186bp。为进一步验证拼接的全长是否为真实的全长序列，于是从5’端和3’端的非编码区设计引物进行PCR验证。

2.3.2引物设计：根据2.3.1的序列SEQ ID NO.2，从两端的非编码区设计一对上下游引物：

上游引物BjCBP1-F：5'-TTCCCCATCAAAAATAAATCTT-3'

下游引物BjCBP1-R：5'-CAAACGATACTCATAACCCTCA-3'

2.3.3全长序列的PCR扩增：以步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjCBP1-F和BjCBP1-R做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、60℃30s、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

2.3.4电泳：将2.3.3扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳发现特异条带如图1所示，M为MarkerIII，1为扩增条带，可见在750bp左右有一特异条带，与预期结果相符。

2.3.5TA克隆：将2.3.3中的扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.3.6测序结果：测序获得的序列与拼接序列的相应片段完全一致，说明成功获得BjCBP1基因。BjCBP1基因编码的蛋白含有208个氨基酸，如SEQ IDNO.3序列所示，在NCBI上进行保守结构域预测其含有4个EF-hand基序，EF-hand基序可能具有结合钙离子的能力，因此预测BjCBP1蛋白能结合钙离子，进一步的实验验证见实验例2。

实验例2：茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1在大肠杆菌BL21(DE3)中的原核表达及特性检测

1、主要试剂：His-Tag蛋白纯化试剂盒购自北京康为试剂生物科技有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamH I和HindШII购自大连宝生物工程有限公司；含原核表达质粒pET-32a(+)的DH5α菌种、大肠杆菌菌株由本实验室保存。

2、重组原核表达载体pET32a-BjCBP1的构建

2.1引物设计：根据BjCBP1基因的编码区序列SEQ ID NO.3设计上下游引物，并分别引入酶切位点BamH I（GGATCC）和HindШ（AAGCTT）序列，引物为：

上游引物pET-F：5’-CGGATCCATGAAATTCGCAAAACTG-3’

下游引物pET-R：5’-CAAGCTTTCATCGCTGGAGATCCA-3’

2.2PCR扩增：以实验例1中步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，引物pET-F和pET-R做PCR扩增：体系为ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、60℃30s、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

2.3电泳：将2.2扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳在630bp左右有一特异条带，与预期结果相符。

2.4TA克隆获得重组载体pMD-T-BjCBP1：将2.2中的扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体得重组载体pMD-T-BjCBP1，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将含重组载体pMD-T-BjCBP1的阳性DH5α菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.5测序结果：与预期结果完全一致。

2.6重组原核表达载体pET32a-BjCBP1的构建：将2.4含重组载体pMD-T-BjCBP1的阳性DH5α菌液扩大培养，并采用普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒pMD-T-BjCBP1；将实验室保存的含原核表达质粒pET-32a(+)的DH5α菌种扩大培养，并用同样的方法提取质粒pET-32a(+)。用BamH I和HindШ双酶切质粒pMD-T-BjCBP1和pET-32a(+)，参照酶的说明书两种质粒各做2个50μL酶切体系。酶切后电泳，并切下pMD-T-BjCBP1质粒的小片段和pET-32a(+)质粒的大片段，利用胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶连接小片段和大片段（连接体系为：小片段7μL，大片段1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA Ligase Buffer1μL）至少24小时，然后利用热击法转化大肠杆菌感受态DH5α；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组原核表达载体pET32a-BjCBP1及含该表达载体的大肠杆菌。

2.7pET32a-BjCBP1重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株及进行诱导表达、纯化蛋白和蛋白特性检测：从2.6中含pET32a-BjCBP1载体的菌株中提取重组质粒，用热激法转化BL21(DE3)菌株感受态，PCR筛选得到阳性克隆。将此阳性克隆在含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、180rpm转速振摇培养至菌液浓度OD600为0.4-0.8，然后加入IPTG（中文名：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；终浓度为1mM）诱导5小时使表达BjCBP1蛋白。然后根据His-Tag蛋白纯化试剂盒说明书纯化获得BjCBP1蛋白。将获得的BjCBP1蛋白分别于含10mM钙离子和10mM EGTA金属离子螯合剂条件下进行的12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，电泳结果如图2所示，BjCBP1蛋白在含Ca²⁺的条件下电泳的迁移速率更快，说明BjCBP1蛋白能够结合Ca²⁺，是钙离子结合蛋白。

实验例3：茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1的构建

1主要试剂：普通质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、Bgl II和BstE II购自大连宝生物工程有限公司；含质粒pCAMBIA1302的菌种由本实验室保存。

2重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1的构建

2.1引物设计：根据BjCBP1基因的编码区序列SEQ ID NO.3设计上下游引物，并分别引入酶切位点BamH I（GGATCC）和BstE II（GGTCACC）序列，引物为：

上游引物BjCBP1-Bam：5’-GGATCCATGAAATTCGCAAAACTG-3’

下游引物BjCBP1-Bst：5’-GGTCACCTCATCGCTGGAGATCCA-3’

2.2PCR扩增：以实验例1中步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，引物BjCBP1-Bam和BjCBP1-Bst做PCR扩增：体系为ddH₂O7.4μL，Premix Ex Taq10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、60℃30s、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

2.3电泳：将2.2扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳在630bp左右有一特异条带，与预期结果相符。

2.4TA克隆获得重组载体pMD19-T-BjCBP1：将2.2中的扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体得重组载体pMD19-T-BjCBP1，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将含重组载体pMD19-T-BjCBP1的阳性DH5α菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.5测序结果：与预期结果完全一致。

2.6重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1的构建：构建方法如图3所示，将2.4含重组载体pMD19-T-BjCBP1的阳性DH5α菌液扩大培养，并采用普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒pMD19-T-BjCBP1；将实验室保存的含有植物表达质粒pCAMBIA1302的DH5α菌种扩大培养，并用同样的方法提取质粒pCAMBIA1302。用BamH I和BstE II双酶切质粒pMD19-T-BjCBP1、用Bgl II（Bgl II与BamH I为同尾酶）和BstE II双酶切质粒pCAMBIA1302，参照酶的说明书两种质粒各做2个50μL酶切体系。酶切后电泳，并切下pMD19-T-BjCBP1质粒的小片段和pCAMBIA1302质粒的大片段，利用胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶连接小片段和大片段（连接体系为：小片段7μL，大片段1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA Ligase Buffer1μL）至少24小时，然后利用热击法转化大肠杆菌感受态DH5α；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1及含该重组表达载体的大肠杆菌。

2.7pCAMBIA1302-BjCBP1重组质粒转化农杆菌：从2.6中含pCAMBIA1302-BjCBP1载体的菌株中提取重组质粒，用液氮冷激法转化根瘤农杆菌GV3101，方法为：①200μＬ根瘤农杆菌GV3101感受态细胞中加入2μg（5-10μＬ）重组质粒DNA，冰浴5min，然后转至液氮中冷冻8min；②迅速与37℃水浴中温浴5min后，加入800μＬLB液体培养基③28℃﹑250rpm预培养4-5h，然后涂布于含有Kan(50mg/l)﹑Gent(50mg/l)的LB平板，28℃培育24-28小时后可出现菌落；④挑取菌体做菌体PCR鉴定，确定正确后保存于-70℃，即为植物遗传转化的工程菌株。

实施例3：拟南芥的遗传转化

1主要试剂：荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TMKit购自大连宝生物工程有限公司；柱式小量植物总RNA抽提试剂盒W7021，购自上海华舜生物技术有限公司；DNA酶购自Promega公司。

2拟南芥的培养及农杆菌侵染实验

①取野生型拟南芥种子，用75%乙醇消毒1min后无菌水清洗；再用5%NaClO灭菌10min，无菌水清洗5次，去尽NaClO残留液。加一定量无菌水，于4℃条件下春化3-4天；

②将春化3-4天的拟南芥种子在MS空白培养基上光照培养7天，待长出幼苗，移栽至蛭石培养基（蛭石：营养土：珍珠岩=3：1：1），1/2MS液体培养基浇灌；

③待植物培养至初生花序10-15cm，次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序；培养至可进行侵染实验；

④将实验例2步骤2.7中制备好的已转化pCAMBIA1302-BjCBP1质粒的农杆菌菌液扩大培养，即在转化前1天晚上转入大瓶过夜培养；至菌液浓度为OD600=2.0；离心，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于约3倍体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右；

⑤将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染5分钟；用保鲜膜将侵染过的植物（T0代植物）罩起来以保持湿度，置培养箱中黑暗培养12小时后正常条件培养；2-3天揭去保鲜膜，7天后可浇水；并定期侵染几次；

⑥继续培养至植物成熟，收种子（T1代种子）。

MS培养基由大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素等按一定比例组成。MS培养基作为目前使用最广的离体细胞培养基，由于其中无机盐浓度较高，为外植体的生长提供了足够的矿质营养并能使愈伤组织加速生长。为便于溶液配制及减小误差，先按大量元素、微量元素、铁盐、有机物质配制一定体积的母液。待用时再按一定比例稀释混合。

3拟南芥转基因纯合体的筛选

T1代种子经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素（25mg/L）抗生素的MS培养基上，至人工气候培养箱中培养，观察幼苗（T1代植物）的生长状况。10-12天后明显可以观察到非转基因拟南芥只能长出2片子叶、没有真叶、根非常短，而转基因拟南芥长出2-4片真叶、根长，于是将转基因苗移栽至蛭石培养基中，成熟后分别收取各个转基因苗种子（T2代种子）。T2代种子经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素（25mg/L）抗生素的MS培养基上，抗性苗与非抗性苗的数量比约为3:1的，再将抗性苗（T2代植物）移栽至蛭石培养基中，成熟后分别收取各个转基因苗种子（T3代种子）。取各个T2代植物的小部分T3代种子，经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素（25mg/L）抗生素的MS培养基上，若全为抗性苗的即为纯合体，则相应的T3代种子可以用于后续实验，相应的T2代植物为纯合体。

随机选取纯合体T2代植物6株，分别命名为TL1、TL2、TL3、TL4、TL5和TL6，采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取各株植物叶片的总RNA，经DNA酶去除DNA，根据定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TMKit说明书操作检测各个转基因拟南芥中的BjCBP1基因的表达量，BjCBP1基因的引物为：

上游引物：5’-CGTTAGAGGAGTGCGAGCGTATG-3’

下游引物：5’-CGAGAACTCAGTGAAGCACACGAAT-3’，

内参基因为拟南芥18S基因，其引物为：

上游引物：5’-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3’

下游引物：5’-CGAACACTTCACCGGATCATT-3’，

定量PCR结果如图4所示，横坐标WT表示野生型拟南芥，TL1至TL6表示随机选取的6株转基因拟南芥植株，纵坐标表示BjCBP1基因的相对表达量，知TL3和TL4表达量较高，于是选取TL3和TL4的T3代种子用于后续实验，TL3和TL4的T3代种子及其发芽后生长的植株均简称为转基因TL3和转基因TL4。

实验例4：转BjCBP1基因拟南芥的逆境反应实验

将转基因TL3和TL4种子和野生型种子经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在MS培养基上，至人工气候培养箱中培养，观察发芽率情况和植物生长情况，转基因型和野生型没有明显差异。将转基因TL3和TL4种子和野生型种子经消毒、灭菌和春化处理后分别均匀地涂布在含100mM NaCl、250mM甘露醇（英文mannitol）或0.5μM脱落酸（简称ABA）的MS培养基上，观察发芽率情况和植物生长情况。发芽率情况如图5所示，A为在0.5μM ABA条件下的从0-9天发芽率统计，B为在0.5μM ABA条件下的第5天的发芽率图片，C为在100mM NaCl条件下的从0-9天发芽率统计，C为在250mM mannitol条件下的从0-9天发芽率统计，A、C、D中黑方块、黑圆、白圆分别代表野生型、转基因TL3、转基因TL4。发芽率实验图5显示转基因型种子在2-6天比野生型发芽率明显低，即转基因型种子发芽率对逆境条件（NaCl、mannitol和ABA）具有超过敏现象，说明BjCBP1基因在植物逆境条件生长时起重要作用。

另外，当转基因TL3和TL4种子和野生型种子在MS培养基上发芽3天后取部分转移至含100mM NaCl、250mM甘露醇（英文mannitol）或0.5μM脱落酸（简称ABA）的MS培养基上继续生长，10天后观察植物生长情况，如图6所示，转基因型TL3、TL4和野生型在正常的MS培养基上生长无明显区别，但转基因型在逆境条件下生长比野生型明显受抑制，即转基因型种子发芽后生长对逆境条件（NaCl、mannitol和ABA）也具有超过敏现象，再次说明BjCBP1基因在植物逆境条件生长时起重要作用。

实施例4：转BjCBP1基因拟南芥的抗逆境实验

1转BjCBP1基因拟南芥中抗逆基因RD29B和RD22表达检测

拟南芥RD29B和RD22基因为胁迫诱导基因，具有提高植物逆境耐受力的作用。将野生型和转基因型种子于MS培养基发芽并长出4片真叶时移栽至蛭石中生长，当植物有3周大时，对植物全株喷洒水、NaCl(200mM)水溶液或ABA(10μM)水溶液，3小时后，提取各自的总RNA，荧光定量PCR检测抗逆基因RD29B和RD22的表达情况。

RD29B基因的引物为：

上游引物：5’-AAGATTTTCCGACAAGAGGTGAT-3’

下游引物：5’-TTGGGACGAGATAGTTCTGGTGA-3’，

RD22基因的引物为：

上游引物：5’-GTGGCTAAGAAGAACGCACCGAT-3’

下游引物：5’-TGGCATACCGCAACTGCTTTAG-3’，

内参基因仍为拟南芥18S基因，其引物为：

上游引物：5’-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3’

下游引物：5’-CGAACACTTCACCGGATCATT-3’，

定量PCR结果如图7所示，横坐标CK为对照，即喷洒水的条件，纵坐标为抗逆基因的相对表达水平，结果表明抗逆基因RD29B和RD22在对照条件下，野生型和转基因型的表达水平基本相同，但在逆境条件时，转基因型中RD29B和RD22基因的表达均比野生型显著升高。由此说明逆境条件下，BjCBP1基因具有提高植物耐逆境生长的能力。

2盐胁迫下BjCBP1基因对拟南芥的存活率的影响

将野生型WT种子和转基因型种子TL3、TL4经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含300mM的NaCl的MS培养基上生长2周后移栽至无盐胁迫的蛭石中继续培养使恢复生长，12天后观察仍然存活的植株数量（植株全部白化被认为死亡）。结果如图8所示，高盐胁迫生长2周后于正常状态下培养12天后，野生型植株死亡率高，存活率不到10%，而转基因型的存活率达到30%以上，具有显著性差异。说明BjCBP1基因有助于植物在高盐下的生长，即提高了植物的抗逆性。

综上所述，BjCBP1基因具有提高植物抗逆性的作用，促进植物在逆境下的适应能力和生长能力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1，其特征在于，其基因序列为SEQ IDNO.1。

2.茎瘤芥钙离子结合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

3.茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组原核表达载体pET32a-BjCBP1，其特征在于：由SEQ ID NO.1序列连入原核表达载体pET-32a(+)构成。

4.茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjCBP1，其特征在于：由SEQ ID NO.1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成。

5.茎瘤芥钙离子结合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的应用，其中所述植物为拟南芥，所述耐逆境特性为耐盐特性。