CN109805233B - 一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖15‑25份、螺旋藻提取物10‑14份、玉米低聚肽粉3‑8份、牛磺酸2‑5份、环拉酸钠0.5‑1.5份、蜂蜜1‑3份、山梨酸钾0.1‑0.3份和去离子水800‑1200份。本发明原料来源广，制备方法简单，制得的茯苓饮料能够促进免疫器官的生长，具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，减轻辐射反应，有助于提高免疫力，改善记忆力，具有良好的应用前景。

Description

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药保健技术领域，具体涉及一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料。

背景技术

近几年，世界性的环境质量的下降和人们生活压力的增加，使得处于亚健康状态的人群日渐增多，而同时随着生活水平的不断提高，人们也越来越注重个人健康问题。随着人们健康意识的增强，人们逐渐开始选择健康的食品、饮品，这种需求的产生使碳酸饮料的市场份额不断下降，茶饮料、粗粮饮料、果汁饮料和功能饮料开始受人们的青睐。增强免疫力就必须保证体力氨基酸含量，氨基酸在人体中的存在，不仅提供了合成蛋白质的重要原料，而且对于促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础，是相当重要的一个环节。

茯苓，又称玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟，是中药“四君八珍”之一，是拟层孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常寄生在松树根上，形如甘薯，球状，外皮淡棕色或黑褐色，内部粉色或白色，具有利水渗湿，健脾宁心之功效。医学研究更进一步证明茯苓具有抗肿瘤、利水消肿、增强免疫、镇定安神和抑菌等多种作用。茯苓中含有多种化学成分，其中最主要的是茯苓多糖，其含量可达茯苓干重的84％。茯苓多糖易溶于中、强碱溶液中，难溶于水，其主体结构为β-(1→3)结合的葡萄糖线性结构，同时还具有β-(1→6)结合的葡萄糖基支链的结构。科学研究表明，将羧甲基化半合成衍生化方法对茯苓多糖进行化学改性来增大其溶解度、提高生物活性，取代程度越高，在水中的溶解度就越大，生物利用度越高，生物活性则越强。

羧甲基茯苓多糖是茯苓多糖上带有羧甲基的多糖，这种多糖水溶性高，并且具有明显的抗肿瘤、提高免疫力、保肝降酶、抗病毒、减轻放射副反应、降血糖、提升白细胞功能、健胃安神、抗衰老等生理活性，将其开发成抗肿瘤、免疫增强的药物或者保健食品，效果明显，具有极好的市场前景。

申请号为CN200610163425.X的中国发明专利公开了一种高取代度羧甲基茯苓多糖及其制备方法和其应用，以水或水醇溶液为介质，茯苓多糖、氯乙酸与适当过量的氢氧化钠进行取代反应，以制得高羧甲基取代度的羧甲基茯苓多糖(CMP)，取代度＞1。该发明方法是先从茯苓中提取茯苓多糖，氯乙酸取代需保持较高的反应温度，获得羧甲基茯苓多糖后再进行脱色、纯化，为液相不振荡工艺，反应中碱液和氯乙酸溶液需要预先配制，生产总耗时长。申请号为CN101724091B的中国发明专利公开的活性羧甲基茯苓多糖及其生产工艺和应用中，先用乙醇对茯苓粉进行脱脂，在乙醇相体系中用二次碱化法(碱加入量为茯苓量的2％-10％)，氯乙酸加入量在15％-20％，获得中等取代度的羧甲基茯苓多糖。申请号为CN104387482B的发明创造采用乙醇相体系，二次碱化工艺，并利用催化剂来提升取代反应过程。上述两种工艺均需二次碱化、乙醇反应体系，操作步骤多并消耗大量的乙醇。

目前，日益增长的生活工作压力使人们体力脑力透支，随着生活水平的提高，人们对于健康的要求越来越高，因此人们功能性保健品来减轻疲劳，提高免疫力，提高睡眠质量。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料及其制备方法，其目的在于，提供一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，通过添加羧甲基茯苓多糖，有明显的抗肿瘤、提高免疫力、保肝降酶、抗病毒、减轻放射副反应、降血糖、提升白细胞功能、健胃安神、抗衰老等生理活性。

本发明提供一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，由以下原料制备而成：羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉、牛磺酸、环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾和去离子水。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖15-25份、螺旋藻提取物10-14份、玉米低聚肽粉3-8份、牛磺酸2-5份、环拉酸钠0.5-1.5份、蜂蜜1-3份、山梨酸钾0.1-0.3份和去离子水800-1200份。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖17-22份、螺旋藻提取物11-13份、玉米低聚肽粉4-7份、牛磺酸3-5份、环拉酸钠0.7-1.2份、蜂蜜1.5-2.8份、山梨酸钾0.1-0.3份和去离子水900-1100份。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖20份、螺旋藻提取物12份、玉米低聚肽粉5份、牛磺酸4份、环拉酸钠1份、蜂蜜2份、山梨酸钾0.2份和去离子水1000份。

作为本发明进一步的改进，所述羧甲基茯苓多糖由以下方法制备：

S1.茯苓的培养：将茯苓菌丝无菌接种在麦芽汁液体培养基中，28℃培养4-5天；

S2.茯苓多糖的制备：将培养好的茯苓培养基35℃发酵2天，加热至微沸，提取1-2h后，过滤，加入氯仿和正丁醇的混合溶剂，振荡，离心，加入3倍量的95％乙醇，过夜，过滤得沉淀，用***洗涤2-3次，得到茯苓多糖；

S3.茯苓次多糖的制备：将茯苓多糖加入高碘酸钠溶液中进行选择性氧化，用三氟乙酸调pH值至3-4，适度酸解后，过滤，固体用水洗涤，得到茯苓次多糖；

S4.羧甲基茯苓多糖的制备：将茯苓次多糖溶于碱溶液中，搅拌下缓慢加入35％双氧水脱色处理，至溶液变成白色，加入氯乙酸的异丙醇和叔丁醇的混合溶液中，控制反应体系中异丙醇和叔丁醇的混合溶剂的浓度为65％-70％，60-80℃醚化反应2-3h后，反应体系呈糊状，倒出上层液体，下层加入稀盐酸溶液调节pH＝6.0，剧烈搅拌，加入95％乙醇，过滤，固体物溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体物，即为羧甲基茯苓多糖。

作为本发明进一步的改进，所述酸解时间为30min-1h，所述异丙醇和叔丁醇的混合体积比为3:1，所述氯仿和正丁醇的混合体积比例为(4-6):1，所述碱溶液为KOH溶液，所述高碘酸钠溶液的物质的量的浓度为0.5mol/L-1.5mol/L。

本发明进一步保护一种上述具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，冷却后贴标，即得。

作为本发明进一步的改进，所述灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。

作为本发明进一步的改进，所述搅拌转速为300r/min-500r/min。

作为本发明进一步的改进，所述均质的转速为7000r/min-10000r/min。

本发明具有如下有益效果：

1.羧甲基茯苓多糖的制备中用异丙醇和叔丁醇的混合溶液代替传统的异丙醇或乙醇，异丙醇为仲醇，叔丁醇为叔醇，两者的位阻大，在该SN2取代反应中有助于降低副反应，减少氯乙酸的用量并降低生产成本，反应较温和，不仅制得的羧甲基茯苓多糖取代度较高且取代基分布均匀，而且克服了异丙醇或乙醇作为介质制备的羧甲基茯苓多糖容易结块的缺点；通过控制异丙醇和叔丁醇的浓度有利于提高羧甲基茯苓多糖的取代度；本发明采用的三氟乙酸因其酸性、氧化性弱，水解效果好并且具有对茯苓多糖结构影响小的优点，作为酸解用酸使茯苓多糖糖苷键断裂；本发明通过控制适合的醚化反应温度进一步提高取代度，研究发现，温度过低，取代度过低；醚化温度过高，取代度反而下降，通过实验发现，温度在60-80℃时取代度最高；

2.本发明的方法制备的羧甲基茯苓多糖具有良好的水溶性，20℃下溶解度为0.105-0.109mg/mL，取代度为1.55-1.59，均优于现有的羧甲基茯苓多糖，该羧甲基茯苓多糖有明显的抗肿瘤、提高免疫力、保肝降酶、抗病毒、减轻放射副反应、降血糖、提升白细胞功能、健胃安神、抗衰老等生理活性；玉米低聚肽粉是以玉米蛋白粉为原料，经调浆、蛋白酶酶解、分离、过滤、喷雾干燥等工艺生产而成的，具有降血压、醒酒护肝、增强免疫及增强运动能力的功效；螺旋藻提取物中的藻多糖和藻蓝蛋白均能增强骨髓细胞的增殖活力，促进胸腺、脾脏等免疫器官的生长和促进血清蛋白的生物合成，因此螺旋藻提取物具有免疫增强作用；牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成，但其具有良好的提高机体免疫力、改善记忆力、延缓衰老等功效；

3.本发明原料来源广，制备方法简单，制得的茯苓饮料能够促进免疫器官的生长，具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，减轻辐射反应，有助于提高免疫力，改善记忆力，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明茯苓饮料的制备工艺流程图；

图2为本发明粗多糖含量测定的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

实施例1

所述羧甲基茯苓多糖由以下方法制备：

S1.茯苓的培养：将茯苓菌丝无菌接种在麦芽汁液体培养基中，28℃培养4天；

S2.茯苓多糖的制备：将培养好的茯苓培养基35℃发酵2天，加热至微沸，提取1h后，过滤，加入3倍量的氯仿和正丁醇的混合溶剂，所述氯仿和正丁醇的混合体积比例为4:1，振荡，离心，加入3倍量的95％乙醇，过夜，过滤得沉淀，用***洗涤2次，得到茯苓多糖；

S3.茯苓次多糖的制备：将10g茯苓多糖加入100mL0.5mol/L高碘酸钠溶液中进行选择性氧化，用三氟乙酸调pH值至3，适度酸解，酸解时间为30min，过滤，固体用水洗涤，得到茯苓次多糖；

S4.羧甲基茯苓多糖的制备：将1g茯苓次多糖溶于20mL 0.1mol/L的KOH溶液中，搅拌下缓慢加入35％双氧水脱色处理，至溶液变成白色，加入50mL 2mol/L的氯乙酸的异丙醇和叔丁醇的混合溶液，体积比为3:1，控制反应体系中异丙醇和叔丁醇的混合溶剂的浓度为65％，60℃醚化反应2h后，反应体系呈糊状，倒出上层液体，下层加入稀盐酸溶液调节pH＝6.0，剧烈搅拌，加入95％乙醇，过滤，固体物溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体物，即为羧甲基茯苓多糖。

经检测，该羧甲基茯苓多糖的取代度为1.55，20℃时的溶解度为0.105mg/mL。

实施例2

所述羧甲基茯苓多糖由以下方法制备：

S1.茯苓的培养：将茯苓菌丝无菌接种在麦芽汁液体培养基中，28℃培养5天；

S2.茯苓多糖的制备：将培养好的茯苓培养基35℃发酵2天，加热至微沸，提取2h后，过滤，加入5倍体积的氯仿和正丁醇的混合溶剂，所述氯仿和正丁醇的混合体积比例为6:1，振荡，离心，加入3倍量的95％乙醇，过夜，过滤得沉淀，用***洗涤3次，得到茯苓多糖；

S3.茯苓次多糖的制备：将10g茯苓多糖加入30mL 1.5mol/L高碘酸钠溶液中进行选择性氧化，用三氟乙酸调pH值至4，适度酸解，酸解时间为1h，过滤，固体用水洗涤，得到茯苓次多糖；

S4.羧甲基茯苓多糖的制备：将1g茯苓次多糖溶于20mL 0.1mol/L的KOH溶液中，搅拌下缓慢加入35％双氧水脱色处理，至溶液变成白色，加入50mL 2mol/L氯乙酸的异丙醇和叔丁醇的混合溶液，体积比为3:1，控制反应体系中异丙醇和叔丁醇的混合溶剂的浓度为70％，80℃醚化反应3h后，反应体系呈糊状，倒出上层液体，下层加入稀盐酸溶液调节pH＝6.0，剧烈搅拌，加入95％乙醇，过滤，固体物溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体物，即为羧甲基茯苓多糖。

经检测，该羧甲基茯苓多糖的取代度为1.57，20℃时的溶解度为0.106mg/mL。

实施例3

所述羧甲基茯苓多糖由以下方法制备：

S1.茯苓的培养：将茯苓菌丝无菌接种在麦芽汁液体培养基中，28℃培养4天；

S2.茯苓多糖的制备：将培养好的茯苓培养基35℃发酵2天，加热至微沸，提取2h后，过滤，加入氯仿和正丁醇的混合溶剂，所述氯仿和正丁醇的混合体积比例为5:1，振荡，离心，加入3倍量的95％乙醇，过夜，过滤得沉淀，用***洗涤3次，得到茯苓多糖；

S3.茯苓次多糖的制备：将10g茯苓多糖加入50mL 1.0mol/L高碘酸钠溶液中进行选择性氧化，用三氟乙酸调pH值至3.6，适度酸解，酸解时间为45min，过滤，固体用水洗涤，得到茯苓次多糖；

S4.羧甲基茯苓多糖的制备：将1g茯苓次多糖溶于20mL 0.1mol/LKOH溶液中，搅拌下缓慢加入35％双氧水脱色处理，至溶液变成白色，加入50mL 2mol/L氯乙酸的异丙醇和叔丁醇的混合溶液中，体积比为3:1，控制反应体系中异丙醇和叔丁醇的混合溶剂的浓度为68％，70℃醚化反应2.5h后，反应体系呈糊状，倒出上层液体，下层加入稀盐酸溶液调节pH＝6.0，剧烈搅拌，加入95％乙醇，过滤，固体物溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体物，即为羧甲基茯苓多糖。

经检测，该羧甲基茯苓多糖的取代度为1.59，20℃时的溶解度为0.109mg/mL。

对比实施例1

按照中国发明专利CN104188900B方法制备的羧甲基茯苓多糖。

经检验，该羧甲基茯苓多糖的取代度为1.02，20℃时的溶解度为0.085mg/mL。

测试例1抗氧化性测试

取pH为8.2的Tris-HCl缓冲液于比色管中，各自加入实施例1-3和对比实施例1制备的羧甲基茯苓多糖的样品溶液，37℃水浴，然后加入预热过的邻苯三酚溶液，混匀，处理5min后用盐酸淬灭反应，测定320nm处吸光值。对照组分别为维生素C，和对比实施例1制备的羧甲基茯苓多糖。试验结果以清除率E(％)表示。结果见表1。

表1

样品\浓度mg/mL

0.1

0.5

1.0

2.0

5.0

10.0

实施例1

14.1±1.6

17.4±1.1

28.3±2.2

38.4±1.6

48.3±3.7

60.3±1.5

实施例2

14.5±1.3

16.7±1.7

27.3±0.8

36.9±1.8

47.7±2.4

59.1±1.2

实施例3

15.6±0.7

18.1±1.4

29.3±1.2

39.6±1.6

51.1±0.9

63.6±1.8

维生素C

42.3±0.8

91.7±1.3

92.1±1.5

91.8±1.7

91.8±1.3

92.1±1.6

对比实施例1

9.3±1.3

12.4±0.8

16.6±1.1

25.4±1.8

33.6±3.7

38.3±2.5

由上表可知，本发明实施例1-3制备的羧甲基茯苓多糖具有良好的抗氧化活性，活性明显优于对比实施例1。

测试例2羧甲基茯苓多糖的取代度(D·S)测试

将实施例1-3和对比实施例1制备的羧甲基茯苓多糖进行取代度测试，具体方法如下：

精密称取羧甲基茯苓多糖样品0.4g(精确到小数点后4位)，置于150ml的烧杯中，80℃水浴加热，搅拌使溶解，冷却后，用2molL的盐酸溶液调pH至4.0，加入无水乙醇100ml，搅拌均匀，静置过夜，离心分离醇析物，醇析物用95％的乙醇反复洗涤，至洗涤液中不含氯离子。洗净醇析物用0.1000mol/L的NaOH标准溶液40.00ml溶解，待溶液呈透明状后，立即用0.1000mol/L的标准盐酸溶液反滴定，至酚酞指示剂的红色刚退去，记录反滴定所消耗的0.1000mol/L的盐酸标准液的体积为V_HCl。

按照下式计算羧甲基茯苓多糖的取代度(D·S)：

式中：

A为中和1g酸式羧甲基茯苓多糖样品所消耗的NaOH的m mol数；

C_NaOH为NaOH标准溶液的浓度(0.1000mol/L)；

V_NaOH为加入0.1000mol/L的NaOH标准溶液的体积数(40.00ml)；

C_HCl为反滴定用的盐酸标准溶液的浓度(0.1000mol/L)；

V_HCl为反滴定所消耗0.1000mol/L的盐酸标准溶液的体积数。

结果见表2。

表2

组别	取代度
		实施例1	1.55
实施例2	1.57
		实施例3	1.59
对比实施例1	1.02

从结果可知，本发明实施例1-3制备的羧甲基茯苓多糖具有较高的取代度(1.55-1.59)，明显优于对比实施例1。

实施例4

原料组成(重量份)：羧甲基茯苓多糖15份、螺旋藻提取物10份、玉米低聚肽粉3份、牛磺酸2份、环拉酸钠0.5份、蜂蜜1份、山梨酸钾0.1份和去离子水800份。

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，参照附图1，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，转速为300r/min，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，转速为7000r/min，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，冷却后贴标，即得。

实施例5

原料组成(重量份)：羧甲基茯苓多糖25份、螺旋藻提取物14份、玉米低聚肽粉8份、牛磺酸5份、环拉酸钠1.5份、蜂蜜3份、山梨酸钾0.3份和去离子水1200份。

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，转速为500r/min，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，转速为10000r/min，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，冷却后贴标，即得。

实施例6

原料组成(重量份)：羧甲基茯苓多糖17份、螺旋藻提取物11份、玉米低聚肽粉4份、牛磺酸3份、环拉酸钠0.7份、蜂蜜1.5份、山梨酸钾0.1份和去离子水900份。

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，转速为350r/min，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，转速为8000r/min，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，冷却后贴标，即得。

实施例7

原料组成(重量份)：羧甲基茯苓多糖22份、螺旋藻提取物13份、玉米低聚肽粉7份、牛磺酸5份、环拉酸钠1.2份、蜂蜜2.8份、山梨酸钾0.3份和去离子水1100份。

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，转速为450r/min，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，转速为9000r/min，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，冷却后贴标，即得。

实施例8

原料组成(重量份)：羧甲基茯苓多糖20份、螺旋藻提取物12份、玉米低聚肽粉5份、牛磺酸4份、环拉酸钠1份、蜂蜜2份、山梨酸钾0.2份和去离子水1000份。

一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，转速为400r/min，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，转速为8500r/min，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，冷却后贴标，即得。

因人的个体差异和生活的环境不同，每个人的免疫力高低有很大区别，有的人因自身免疫力差，而患上某些疾病。而有些人因患上了某些疾病，使自己的体能不断消耗，而导致免疫力逐步下降，所患疾病久治不愈。总之，免疫力的强弱与疾病有很大关系。本发明茯苓饮料，发现可减少慢性心率，扩张血管，对抗肾上腺对微动脉的收缩作用，促进微循环恢复，改善血液流变性，具有保肝作用，从而使人体免疫力提高，达到使疾病康复的作用。现已试用了300余例久治不愈的患者，有效率在90％以上。

测试例1粗多糖含量测定

1.试剂和标准品配置：

80％乙醇溶液：称取无水乙醇80mL与20mL水，混匀；

苯酚溶液(50g/L)：称取精制苯酚2.5g，加水溶解并稀释至50mL，混匀。在冰箱中可保存一个月。

葡萄糖标准使用液(0.10mg/mL)

2.样品制备：

分别准确吸取2mL本发明实施例4-8制备的茯苓饮料和市售茯苓饮料，置于25mL离心管中，加入无水乙醇8ml,混匀，冰箱放置4h后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80％(体积分数)乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至100mL，混匀后，取10mL定容到50mL，混匀即得。

3.标准曲线的绘制：

准确吸取葡萄糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL分别置于25mL比色管中，准确补水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，在旋转混匀器上混匀，置沸水浴中煮沸2min。冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(附图2)。

4.样品测定：

准确吸取样品测定液2.0mL置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，在旋转混匀器上混匀，置沸水浴中煮沸2min。冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

5.计算：

6.结果，见表3：

表3

组别	吸光度	浓度	实际浓度(mg)
				实施例4	0.4175	0.090	0.088
实施例5	0.4141	0.089	0.087
				实施例6	0.4220	0.091	0.087
实施例7	0.4206	0.090	0.088
				实施例8	0.4237	0.092	0.089
市售	0.2718	0.058	0.056

由上表可知，本发明实施例制备的茯苓饮料含有更多的活性粗多糖。

例1：王某某，男，35岁，5年前患胰腺肿瘤，他通过化疗加手术切除肿瘤治疗后，身体越来越差，经常感冒，面部消瘦，不思饮食，因免疫下降，病情越治越重，两年前已不能正常工作。一年前通过服用本发明茯苓饮料，饮食增加。通过检查发现，各项身体机能也有所好转。坚持服用一年，现各项指标均已正常，能正常的工作和学习，身体外表正常，也很少感冒，能正常工作。

例2：张某，女，72岁，因免疫力差，经常感冒引起支气管炎和咽炎五年之久，经常咳嗽，在大小医院久治不愈，后来人体消瘦，身体越来越差，经常感冒。半年前开始服用本发明茯苓饮料，半个月此病就痊愈，而且日后很少感冒。三个月后观查再也没有复发。

与现有技术相比，羧甲基茯苓多糖的制备中用异丙醇和叔丁醇的混合溶液代替传统的异丙醇或乙醇，异丙醇为仲醇，叔丁醇为叔醇，两者的位阻大，在该SN2取代反应中有助于降低副反应，减少氯乙酸的用量并降低生产成本，反应较温和，不仅制得的羧甲基茯苓多糖取代度较高且取代基分布均匀，而且克服了异丙醇或乙醇作为介质制备的羧甲基茯苓多糖容易结块的缺点；通过控制异丙醇和叔丁醇的浓度有利于提高羧甲基茯苓多糖的取代度；本发明采用的三氟乙酸因其酸性、氧化性弱，水解效果好并且具有对茯苓多糖结构影响小的优点，作为酸解用酸使茯苓多糖糖苷键断裂；本发明通过控制适合的醚化反应温度进一步提高取代度，研究发现，温度过低，取代度过低；醚化温度过高，取代度反而下降，通过实验发现，温度在60-80℃时取代度最高；

本发明的方法制备的羧甲基茯苓多糖具有良好的水溶性，20℃下溶解度为0.105-0.109mg/mL，取代度为1.55-1.59，均优于现有的羧甲基茯苓多糖，该羧甲基茯苓多糖有明显的抗肿瘤、提高免疫力、保肝降酶、抗病毒、减轻放射副反应、降血糖、提升白细胞功能、健胃安神、抗衰老等生理活性；玉米低聚肽粉是以玉米蛋白粉为原料，经调浆、蛋白酶酶解、分离、过滤、喷雾干燥等工艺生产而成的，具有降血压、醒酒护肝、增强免疫及增强运动能力的功效；螺旋藻提取物中的藻多糖和藻蓝蛋白均能增强骨髓细胞的增殖活力，促进胸腺、脾脏等免疫器官的生长和促进血清蛋白的生物合成，因此螺旋藻提取物具有免疫增强作用；牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成，但其具有良好的提高机体免疫力、改善记忆力、延缓衰老等功效；

本发明原料来源广，制备方法简单，制得的茯苓饮料能够促进免疫器官的生长，具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，减轻辐射反应，有助于提高免疫力，改善记忆力，具有良好的应用前景。

本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

Claims (7)

1.一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖15-25份、螺旋藻提取物10-14份、玉米低聚肽粉3-8份、牛磺酸2-5份、环拉酸钠0.5-1.5份、蜂蜜1-3份、山梨酸钾0.1-0.3份和去离子水800-1200份；

所述羧甲基茯苓多糖由以下方法制备：

S1.茯苓的培养：将茯苓菌丝无菌接种在麦芽汁液体培养基中，28℃培养4-5天；

S2.茯苓多糖的制备：将培养好的茯苓培养基35℃发酵2天，加热至微沸，提取1-2h后，过滤，加入氯仿和正丁醇的混合溶剂，振荡，离心，加入3倍量的95％乙醇，过夜，过滤得沉淀，用***洗涤2-3次，得到茯苓多糖；所述氯仿和正丁醇的混合体积比例为(4-6):1；

S3.茯苓次多糖的制备：将茯苓多糖加入高碘酸钠溶液中进行选择性氧化，用三氟乙酸调pH值至3-4，适度酸解后，过滤，固体用水洗涤，得到茯苓次多糖；所述酸解时间为30min-1h；所述高碘酸钠溶液的物质的量的浓度为0.5mol/L-1.5mol/L；

S4.羧甲基茯苓多糖的制备：将茯苓次多糖溶于碱溶液中，搅拌下缓慢加入35％双氧水脱色处理，至溶液变成白色，加入氯乙酸的异丙醇和叔丁醇的混合溶液中，控制反应体系中异丙醇和叔丁醇浓度为65％-70％，所述异丙醇和叔丁醇的混合体积比为3:1；60-80℃醚化反应2-3h后，反应体系呈糊状，倒出上层液体，下层加入稀盐酸溶液调节pH＝6.0，剧烈搅拌，加入95％乙醇，过滤，固体物溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体物，即为羧甲基茯苓多糖；所述碱溶液为KOH溶液。

2.根据权利要求1所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖17-22份、螺旋藻提取物11-13份、玉米低聚肽粉4-7份、牛磺酸3-5份、环拉酸钠0.7-1.2份、蜂蜜1.5-2.8份、山梨酸钾0.1-0.3份和去离子水900-1100份。

3.根据权利要求2所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：羧甲基茯苓多糖20份、螺旋藻提取物12份、玉米低聚肽粉5份、牛磺酸4份、环拉酸钠1份、蜂蜜2份、山梨酸钾0.2份和去离子水1000份。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，其特征在于，按照以下方法制备：按比例称取羧甲基茯苓多糖、螺旋藻提取物、玉米低聚肽粉和牛磺酸，加入去离子水，搅拌溶解，将环拉酸钠、蜂蜜、山梨酸钾倒入溶液中，充分混匀，均质，抽滤，将滤液倒入瓶中，每瓶50mL，压盖机压盖，于灭菌锅中灭菌，冷却后贴标，即得。

5.根据权利要求4所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，其特征在于，所述灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。

6.根据权利要求4所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，其特征在于，所述搅拌转速为300r/min-500r/min。

7.根据权利要求4所述一种具有提升免疫力功效的茯苓饮料的制备方法，其特征在于，所述均质的转速为7000r/min-10000r/min。

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