CN109804913B - 一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白羊草‑内生真菌共生体的构建方法,选择饱满的白羊草种子,剥去内稃,得到纯种子,将内生真菌菌丝扎入到发芽种子的分生组织部位,将完成转接的植株放回新PDA培养基,在黑暗和光照交替条件下培养一周,移栽到无菌蛭石,连续检测6个月染菌率。该方法操作简单,成功率高,可有效提高人工转接效率。将成功染菌植株的种子播种于野外原生生境中,从而达到培育稳定传代的白羊草内生真菌共生体,服务于脆弱生态***植物‑微生物联合修复。
Description
技术领域
本发明涉及受损生态***植物-微生物联合修复技术,特别涉及禾草-内生真菌共生体的构建方法,具体属于一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法。
背景技术
白羊草[Bohtriochloa ischaemum(L.)Keng]是禾本科孔颖草属多年生牧草,属于喜温中旱生植物。白羊草是根茎疏丛型下繁禾草,根系发达,具有短根茎,分蘖能力强,能形成大量基生叶丛。白羊草群落是我国暖温带森林草原区有代表性的植被类型,也是落叶阔叶林区森林破坏后出现的次生植被类型,广泛分布于黄土高原东南部和南部的低山丘陵、梁峁顶部的温暖带地段。此外,白羊草具有抗旱、抗病等特征,在矿区植被修复中具有较大的优势,逐渐成为优势种群。
内生真菌(Endophyte)为生活在活体植物地上部分的组织中,而不引起宿主植物明显病害症状的真菌。内生真菌的宿主植物包括草本、灌木、针叶树和藻类等多个类群,其中研究最为广泛的是与冷季型禾草共生的属内生真菌,全世界至少有30个属的禾草感染该属内生真菌。近年来研究发现,矿区生态修复中,白羊草感染多种内生真菌,其中,白羊草感染的sibiria内生真菌,及其共生体对生物与非生物胁迫具有优良的抗逆性,因此,成功构建白羊草-内生真菌共生体对提高生态修复效率具有重要意义。
传统的人工转接构建方法主要对人工栽培禾草进行幼苗转接,愈伤组织以及成株分蘖转接法为主。幼苗转接和愈伤组织转接不但容易损伤宿主植物,而且成活率较低,很难在野外成功感染宿主并稳定的传代。成株转接的成活率虽然有提高,但对天然禾草宿主的成功染菌率相对较低,不利于大面积的天然禾草生态修复。目前,还未找到一种较为可行的白羊草-内生真菌共生体构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种染菌率较高的白羊草-内生真菌共生体的构建方法,并将该方法应用到受损生态***的生物修复中。
本发明提供的一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法,包括如下步骤:
(1)选择饱满的白羊草种子,将种子在无菌水中浸泡5分钟后,剥去内稃,得到纯种子置于灭菌后的干燥培养皿中;
(2)在超净台上,将种子胚轴朝下,且胚根对准菌落45°斜***已纯化的内生真菌菌落中;
(3)在25℃黑暗条件下培养7-10天,观察培养皿上种子发芽情况,若有杂菌污染应及时切除;
(4)显微镜确定发芽种子的分生组织部位,先用无菌注射器针头扎一个小孔,不戳穿植株,然后挑取少量内生真菌新鲜菌丝,滚成球形,将球形菌丝扎入小孔内完成转接;
(5)将完成转接的植株放回新PDA培养基,在黑暗和光照交替条件下培养7天后,移栽到无菌蛭石,每1-2个月检测一次染菌率,检测6个月。
本发明方法还适用于感染同类内生真菌的天然禾草,如亚利桑那羊茅、羽茅、高羊茅等。
与现有技术相比,本发明有益效果:
本发明在共生体构建过程中采用种子剥去内稃、菌丝扎入植株分生组织部位等措施,显著提高转接植株成活率以及宿主的成功染菌率,实验结果表明,采用本发明方法成活植株中内生真菌转接的成功率白羊草达到97%,亚利桑那羊茅达到95%。将成功染菌植株的种子播种于野外原生生境中,可较好实现野外原生生境中种植禾草-内生真菌共生体的目的,利用其耐重金属性及抗逆优势,可提高脆弱生态***植物-微生物联合修复效率。
附图说明
图1为白羊草内生真菌的转接位置示意图;
图2为白羊草分生组织接入内生真菌菌丝示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进一步描述,但本发明的应用范围并不仅限于此。
实施例1:白羊草内生真菌的转接方法
选择总共300白羊草种子,将种子浸泡在水中大约5分钟去内稃。在转接实验前,在显微镜下通过孟加拉红染色法检测确认没有感染内生真菌。种子表面灭菌后放置在PDA培养基上,每个培养皿中5个,置于25℃培养箱内暗培养10天。在超净台上,将种子胚轴朝下,且胚根对准菌落45°斜***菌落中。观察种子的发芽情况,发芽后,用无菌镊子抽出菌落上已发芽的种子,放在周边PDA培养基上。在显微镜下,先找到植物的分生组织,用无菌注射器针头扎一个小孔(图1)(切勿戳穿植株),然后挑取少量新鲜菌丝且滚成球形,直接扎入小孔内,放入内生真菌菌丝(图2)。将完成转接的植株放回新的PDA培养基,后用黑暗和光照交替培养7天(12h黑暗,12h光照),移栽到无菌蛭石中,放入温室中生长,每1个月检测一次染菌率,检测6个月。实验结果表明,采用该方法进行人工转接,成活植株中内生真菌转接的成功率达到97%。
实施例2:亚利桑那羊茅内生真菌的转接方法
选择总共100粒亚利桑那羊茅种子,将种子浸泡在水中大约5分钟去内稃。在转接实验前,在显微镜下通过孟加拉红染色法检测确认没有感染内生真菌。种子表面灭菌后放置在PDA培养基上,每个培养皿中5个,置于25℃培养箱内暗培养7天。在超净台上,将种子胚轴朝下,且胚根对准菌落45°斜***菌落中。观察10天内培养皿上种子的发芽情况,用无菌镊子抽出菌落上已发芽的种子,放在周边PDA培养基上。在显微镜下,先找到植物的分生组织,用无菌注射器针头扎一个小孔(切勿戳穿植株),然后挑取少量新鲜菌丝且滚成球形,直接扎入小孔内,放入内生真菌菌丝。将完成转接的植株放回新的PDA培养基,后用黑暗和光照交替培养7天(12h黑暗,12h光照),移栽到无菌蛭石中,放入温室中生长,每2个月检测一次染菌率,检测6个月。实验结果表明,采用该方法进行人工转接,成活植株中内生真菌转接的成功率达到95%。
Claims (2)
1.一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法,其特征在于,步骤为:
(1) 选择饱满的白羊草种子,将种子在无菌水中浸泡5分钟后,剥去内稃,得到纯种子置于灭菌后的干燥培养皿中;
(2)在超净台上,将种子胚轴朝下,且胚根对准菌落45°斜***已纯化的内生真菌菌落中;
(3)在25 ºC 黑暗条件下培养7-10天,观察培养皿上种子发芽情况,若有杂菌污染应及时切除;
(4)显微镜确定发芽种子的分生组织部位,先用无菌注射器针头扎一个小孔,不戳穿植株,然后挑取少量内生真菌新鲜菌丝,滚成球形,将球形菌丝扎入小孔内完成转接;
(5)将完成转接的植株放回新PDA培养基,在黑暗和光照交替条件下培养7天后,移栽到无菌蛭石,每1-2个月检测一次染菌率,检测6个月。
2.如权利要求1所述的一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法,其特征在于,所述的白羊草用亚利桑那羊茅替代。
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