CN109797106A - 一种新型的两阶段自养-光合兼养提高小球藻脂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新型的两阶段自养‑光合兼养提高小球藻脂质的方法，该方法可以同时有效净化酿酒废水并显著提高小球藻脂质的产量。该方法包含两个阶段，第一阶段为微藻光合自养阶段：小球藻UTEX‑265在酿酒废水BWW#2(经过厌氧消化器处理)中进行培养8‑10天，完成小球藻收集后，排出已经净化的废水。此阶段TN含量从75mg/L降到7mg/L，TP含量从20mg/L降到2mg/L，达到排放要求。第二阶段为光合兼养阶段：在5‑7天的培养期间第一阶段中收集的微藻生长在外加有机碳源的BWW#2中进行兼养培养，达到净化废水和提高微藻油脂生产力的目的，其中小球藻脂质最大产量为65.94mg/L day。本方法具有净化酿酒废水、抑制细菌污染、无需废水预处理、节约微藻收集的成本优点。

Description

一种新型的两阶段自养-光合兼养提高小球藻脂质的方法

技术领域

本发明属于废水处理和生物燃料生产领域，涉及一种新型的两阶段自养-光合兼养提高小球藻脂质的方法。

背景技术

微生物不仅仅能够生产生物燃料并且可以从大气中捕捉二氧化碳。在微生物培养***中营养素和水是主要的开销最大的地方。实际上，化学肥料作为营养源导致了很高的花费以及能量的消耗，因此，利用微生物从废水中获取营养元素并产生物燃料是一种很经济型的方法。

目前，全世界酿造啤酒的数量大约是1339×10⁶hetoliters(hL)，其中每hL产生5-6hL的废水BWW含有足够的总氮(TN)和总磷(TP)用于微藻培养^[1]。传统上，酿酒废水(BWW)在厌氧消化器中进行处理以减少废水中的高浓度有机碳，因此，酿酒废水(BWW)在微藻培养过程中不仅具有作为无机营养源的潜力，而且具有足够的有机碳作为替代碳源。

有各种微藻培养模式，其中涉及光合自养，异养和兼养等不同培养方式。以这些方式培育小球藻对生物量和油脂生产力都有积极影响。兼养在其较高的生物量和油脂生产力方面优于光自养和异养模式。废水单一阶段兼养和异养培养相关的两个主要问题是有机底物的高成本以及含有机碳源造成的有害细菌的生长。在一个真实的废水***中，有大量的内生细菌和大量废水需要处理，废水预处理步骤将成为影响微藻生物柴油生产的另一个成本因素。

营养元素充足是微藻生物质积累的必要因素，但是营养胁迫状态下微藻的脂质能够大量累积，所以在单一阶段培养方式下同时获得很高的生物质和脂质产量是不可能的。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景存在的问题，提出一种新型两阶段培养模式，可以进行对酿酒废水的处理，同时可以充分藻类的产脂率，是一种多功能的模式，在两阶段培养模式中，微藻菌株首先在厌氧消化后的BWW(表示为BWW#2)中以光合自养模式生长，以有效利用无机营养素，达到生物质积累和更好地控制细菌增长的目的；在微藻生长晚期指数阶段，微藻在BWW#2外加葡萄糖或丙三醇或酿酒废水(表示为BWW#1)的混合培养基中生长。这种微藻培养***可有效利用废水中的无机和有机营养物质，并抑制细菌污染，非常适合大规模的种植。在光合自养生长阶段，产生微藻生物量，而在第二阶段，在营养限制条件下，即超过营养物质消耗的条件下，投入有机碳如葡萄糖、甘油或是BWW#1，达到脂质积累的过程。

本发明是通过以下技术方案实现的：

两阶段光合自养-光合兼养模式，其过程为：

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5-10天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m².s^-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

3)光合自养阶段为模式的第一阶段：以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于经厌氧消化处理后的酿酒废水BWW#2中培养8-10天，8-10天后小球藻UTEX-265沉降10-24hrs后排出废水，收集底部小球藻UTEX-265；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；

酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

3)光合兼养阶段为模式的第二阶段：在封闭的环境中(例如2L的圆柱形容器、培养箱、大型光合反应器等相对封闭环境，目的是为了减少和控制细菌污染)投入培养第一阶段收集的小球藻UTEX-265，培养基为BWW#2和外加碳源的混合液；

4)5-7天后净化的废水排放，收集小球藻可加以利用。

5)监测油脂。

与现有技术相比，本发明对酿酒废水的处理，同时可以充分提高藻类的产脂率，是一种多功能的模式，在两阶段培养模式中，微藻首先在厌氧消化后的BWW(表示为BWW#2)中以光合自养模式生长，以有效利用无机营养素，达到生物质积累和更好地控制细菌增长的目的。在微藻生长晚期指数阶段，微藻暴露于外加碳源的BWW#2中。这种微藻培养***可有效利用废水中的无机和有机营养物质，并抑制细菌污染，非常适合大规模的种植。在光合自养生长阶段，产生微藻生物量，而在第二阶段，在营养限制条件下，即超过营养物质消耗的条件下，投入有机碳如葡萄糖或是BWW#1，达到脂质积累的过程。具体如下：

1)可以不用对废水进行预处理、充分利用废水中的有机和无机营养元素和利用小球藻UTEX-265的自我沉降对微藻进行收集等，大大降低了培养微藻和处理废水的成本。

2)该模式有效控制了细菌的生长，适合大规模种植。

3)相对于传统单阶段培养模式，本发明大大提高了小球藻UTEX-265的脂质生产力。

附图说明

图1(a)代表以不同混合比例BWW#2和BWW#1的混合物(单级兼养培养)培养小球藻UTEX-265时小球藻的脂质产率；

图1(b)代表在灭菌或未灭菌的BWW#2或加入3g/L的葡萄糖作为外加有机碳源(单级兼养)培养小球藻UTEX-265时小球藻的细胞干重和脂质含量：

其中：S＝灭菌；NS＝未灭菌；G＝葡萄糖；其中，每个填充的黑色和白色箭头分别表示左和右y轴。

图1(c)代表不同混合比例BWW#2和BWW#1的混合物(单级兼养培养)培养小球藻UTEX-265时小球藻对废水的TOC的去除效果。

图2(a)代表在单级光合自养培养模式中培养小球藻UTEX-265，小球藻的生长曲线、BWW#2水质的PH、TN和TP含量的变化；

图2(b)代表使用BWW#1作为碳源，在BWW#2的两阶段光合自养-兼养培养模式下C.vulagris(UTEX-265)期间的生长曲线和营养物消耗曲线；

图2(c)代表在利用不同有机碳源(BWW#1，葡萄糖或丙三醇)的两阶段光合自养-兼养模式培养下，小球藻(UTEX-265)和内源小球藻(从BWW中分离提取)的细胞干重和脂质含量；

其中实心圆圈和方形符号分别代表小球藻(UTEX-265)和内源小球藻的FAME含量。x轴中：

1＝单级光合自养培养；

2＝两阶段光合自养-兼养培养(25％BWW#1)；

3＝两阶段光合自养-兼养培养(3g/L葡萄糖)；

4＝两阶段光合自养-兼养培养(3g/L丙三醇)。

图3代表在两阶段光合自养-兼养模式下利用不同的有机碳源(BWW#1或葡萄糖或甘油)培养时小球藻(UTEX-265)的脂质组合物。

x轴中，1＝单级光合自养培养；

2＝两阶段光合自养-兼养培养(25％BWW#1)；

3＝两阶段光合自养-兼养培养(3g/L葡萄糖)；

4＝两阶段光合自养-兼养培养(3g/L丙三醇)。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。

具体实施例

实施例1

本实施例微藻细胞生长在500mL锥形瓶中；

本发明方法步骤如下(单级兼养养模式)：

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养8天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

2)在500mL锥形瓶中分别接入250mL不同混合比例(100％的BWW、75％BWW、50％BWW和25％BWW)的BWW和BWW#2的混合液，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养15天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；

酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

4)培养周期结束后收集小球藻进行油脂测定和TOC的去除效果。

实施例2

本实施例微藻细胞生长在含有250mL的BWW#2的500mL锥形瓶中；

本发明方法步骤如下(单级光合自养模式)：

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

2)在500mL锥形瓶中接入250mL的BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养14天，每天对BWW#2的水质进行监测；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

3)培养周期结束后收集小球藻进行油脂测定。

实施例3

本实施例微藻细胞生长在500mL锥形瓶中；

本发明方法步骤如下(两阶段光合自养-光合兼养模式)：

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

2)光合自养阶段为模式的第一阶段：在500mL锥形瓶中接入250mL的BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养8天，小球藻UTEX-265进行光合自养达到生物质积累。7天后小球藻UTEX-265发生群集而自动沉降，沉降10hrs后将净化后的废水排出，底部小球藻UTEX-265将被收集，留作第二阶段使用；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；

酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

2)光合兼养阶段为模式的第二阶段：在500mL锥形瓶中接入250mL的25％BWW与75％BWW#2的混合液、100％BWW#2和葡萄糖混合液和100％BWW#2丙三醇的混合液(葡萄糖和丙三醇浓度为3g/L)，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入置于光培养箱中培养5天，期间小球藻大量消耗有机碳，并遭到营养胁迫(TN、TP含量不足)而脂质大量积累。

3)5天后净化的废水排放，收集小球藻进行油脂测定,最大脂质产量从单阶段光合自养培养的31.1mg/L提升到65.94mg/L。

实施例4

本实施例微藻细胞生长在光合反应器中；

本发明方法步骤如下(两阶段光合自养-光合兼养模式)：

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养10天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

3)光合自养阶段为模式的第一阶段：在光合反应器中接入BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养10天，小球藻UTEX-265进行光合自养达到生物质积累。10天后小球藻UTEX-265发生群集而自动沉降，沉降24hrs后将净化后的废水排出，底部小球藻UTEX-265将被收集，留作第二阶段使用；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；

酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

4)光合兼养阶段为模式的第二阶段：在500mL锥形瓶中接入250mL的25％BWW与75％BWW#2的混合液、100％BWW#2和葡萄糖混合液和100％BWW#2丙三醇的混合液(葡萄糖和丙三醇浓度为3g/L)，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入培养7天，期间小球藻大量消耗有机碳，并遭到营养胁迫(TN、TP含量不足)而脂质大量积累。

5)7天后净化的废水排放，收集小球藻进行油脂测定。

由图1(a)可以看出混合比例为75％的BWW#2和25％的BWW#2时脂质产率最大，由图1(c)可知当小球藻在上述两种比例的BWW#2和BWW混合液中生长时对TOC的去除效率很高；由图1(b)知对BWW#2外加3g/L葡萄糖时未灭菌状态下小球藻的脂质生产率较也很可观，图1表明未灭菌环境下在BWW#2中外加3g/L葡萄糖和BWW#1等有机碳源，小球藻UTEX-265生物质和脂质产率不会受到很大影响，能够节约成本，因此这种方式可以在两阶段的第二阶段采用。

由图2(a)可以看出，在光合自养培养阶段，培养8天后BWW#2的TN含量从75mg/L降到7mg/L，TP含量从20mg/L降到2mg/L，达到排放要求。由图2(b)可以看出，在光合兼养阶段，外加碳源后小球藻UTEX-265生长速率变快，水质情况也得到了改善。

表1代表小球藻(UTEX-265)在TAP培养基和BWW下单一或两阶段光合自养-光合异养模式下的生物量和脂质含量

本方法对脂质积累具有双重协同作用，一种是由于第一阶段结束时的营养胁迫，另一种是第二阶段有机碳的供应。表1对两阶段培养模式的多种方法进行小球藻UTEX-265的脂质产量进行测定，发现两阶段培养模式对UTEX-265的生物质和脂质有促进作用，小球藻UTEX-265最高脂质产量可达65.94mg/L day，是在TAP培养基中脂质产量(31.5mg/L day)的2倍。

图3可以看出，在两阶段光合自养-光合兼养模式下，C16和C18等使用价值较高的脂肪酸(可以用作化妆品、生物燃料、保健品等多个方面)占80％以上，有很高的利用价值。脂质成分中油酸C18:1(具有良好的生物燃料性质，可产生物柴油)的比例非常高，约占36％-45％之间，且本模式小球藻UTEX-265的脂质产量较好，且具有很高的使用价值。

应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种新型的两阶段自养-光合兼养提高小球藻脂质的方法，其特征是,提高微藻产油和同时净化废水的经济混合***，且没有对废水预处理却能有效控制细菌污染；

具体步骤如下:

1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5-10天；

培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m².s^-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；

2)光合自养阶段为模式的第一阶段：以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于经厌氧消化处理后的酿酒废水BWW#2中培养8-10天，8-10天后小球藻UTEX-265沉降10-24hrs后排出废水，收集底部小球藻UTEX-265；

酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；

酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；

3)光合兼养阶段为模式的第二阶段：在封闭的环境中(例如2L的圆柱形容器、培养箱、大型光合反应器等相对封闭环境，目的是为了减少和控制细菌污染)投入培养第一阶段收集的小球藻UTEX-265，培养基为BWW#2和外加碳源的混合液；

4)5-7天后净化的废水排放，收集小球藻可加以利用。

5)监测油脂。