CN109793758A - 间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞外泌体微针贴剂，贴剂中包括多个微针，形成所述微针的材料包括间充质干细胞外泌体、微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水，其中，以重量为基准，微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水的质量比为70～99:10～29:10～30:0.1～20:10～29；间充质干细胞外泌体为P2～P25代组织间充质干细胞经饥饿培养后，再用表皮细胞生长因子刺激后所得；微针成型基质和微针固定基质为具有生物相容性的可降解高分子。

Description

间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成功能细胞，是一种未充分分化的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能。间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于中胚层，属于多能干细胞。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、调节免疫、支持造血和促进造血干细胞植入等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。除了骨髓外，人们还能够从脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及胎盘、羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞。近年来随着对间充质干细胞研究与应用越来越深入，间充质干细胞外泌体的功能逐渐成为新的研究热点。

外泌体是一种由真核细胞的多泡内涵体与细胞膜融合后释放到细胞外的级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，内含不同种类的蛋白质、脂质、mRNA、microRNA、小分子等具有生物学活性的物质，与邻近细胞的细胞膜发生融合后将活性物质递送至受体细胞，实现细胞间的信息传递。现有研究证明间充质干细胞分泌的外泌体具有减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减少肺损伤、调节免疫和促进血管生成等作用。

在组织损伤修复方面，间充质干细胞移植后能够通过分泌富含活性物质的外泌体，刺激机体自身细胞的再生功能，促进皮肤黏膜及组织细胞分化、改善局部血供，减少创面组织细菌感染和炎症反应。因此，外泌体在促进组织损伤修复方面有独特疗效，有研究者利用间充质干细胞外泌体修复糖尿病足皮肤创面、褥疮等，收到了良好效果。例如，中国专利申请公开CN107158035A公开了人间充质干细胞外泌体外用凝胶治疗褥疮的应用,其采用不同饥饿培养时间，培养人间充质干细胞并提取外泌体治疗大鼠缺血性损伤，可以明显缩小伤口直径，缩短伤口愈合时间。

化疗药物所诱发的口腔黏膜炎或溃疡主要表现为口腔黏膜充血、红肿、糜烂；口腔溃疡伴随的口咽部疼痛影响病人进食及睡眠，不仅给病人增加痛苦，而且会导致营养不良、体力下降，影响患者的生活质量及肿瘤的后续化疗。其发病机理与病因较为复杂，虽有多种治疗手段，但效果不明显。基于间充质干细胞外泌体对组织细胞良好的修复功能和刺激机体自身细胞的再生功能，因此很适合应用于放化疗性口腔溃疡的治疗。如果开发一种间充质干细胞外泌体的体外应用制剂，可以以避免注射疼痛，方便病人使用。但外泌体包含的多肽和蛋白质为大分子，较难透过皮肤，吸收率低，是限制其临床应用的一个技术难点。

微针是最近十年发展起来的大分子物质经皮传递的理想手段，具有精确、高效、无痛、便利等优势。微针贴剂由级的微针基质和药物组成，以阵列形式排布，是特别适合皮肤黏膜使用的给药***。其***于皮肤黏膜内产生级的空洞，可在少量组织液中迅速溶解，从而释放药物。制备原理是应用微针基质包载生物大分子药物，在温和的制备条件和生物相容、无刺激的试剂和辅料制备成可供皮肤黏膜给药的药物传递***。应用微针技术解决生物大分子黏膜给药吸收问题和口腔溃疡药物难于固定于伤面的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用，其便于固定于创伤面，吸收好速度快，吸收率高，创口愈合速度快。

本发明的第一个目的是提供一种间充质干细胞外泌体微针贴剂，贴剂中包括多个微针，形成微针的材料包括间充质干细胞外泌体、微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水，其中，以重量为基准，微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水的质量比为70～99:10～29:10～30:0.1～20:10～29；

间充质干细胞外泌体为P2～P25代组织间充质干细胞经饥饿培养后，再用表皮细胞生长因子刺激后所得；所述间充质干细胞外泌体占微针成型基质质量分数的15-25％(优选为18％-22％)；

微针成型基质和微针固定基质为具有生物相容性的可降解高分子。

进一步地，微针成型基质为卡波姆、羧甲基纤维素(CMC)、麦芽糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)中的一种或几种。微针成型基质起到载药体的作用。

进一步地，微针固定基质为硫酸软骨素、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、PLGA、透明质酸、壳聚糖、PEG和多糖中的一种或几种。微针固定基质起到贴合创面的作用。

进一步地，无机盐为氯化钠、氯化钾和磷酸缓冲盐中的一种或几种。无机盐起到渗透剂的作用，利用渗透压差促进贴剂中的外泌体渗透入体内并被人体吸收。

进一步地，组织间充质干细胞为来源于胎盘、脐带、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺的间充质干细胞。优选地，组织间充质干细胞为来源于胎盘间充质干细胞。

进一步地，微针贴剂中的微针的针长为100-300微米，针宽为10-100微米。

进一步地，微针贴剂针尖的形状为斜尖或锥尖。

进一步地，微针贴剂中的微针为实心针。

进一步地，间充质干细胞外泌体微针贴剂用于治疗口腔溃疡。使用时，将本发明的微针贴剂固定在口腔溃疡创面，该微针贴剂通过具有生物相容性的可降解高分子组成的粘性固定膜(剂)和微针的嵌入粘贴于口腔溃疡处来固定，促进人体的吸收。利用胎盘间充质干细胞外泌体促进细胞增长，消除炎症，治疗口腔溃疡；通过微针贴剂提供大分子药物输送的级通道，大大促进了大分子在口腔溃疡部位的吸收；利用相对高渗条件进一步提高了吸收速度和吸收率，加速了口腔溃疡的愈合。

本发明的微针贴剂在治疗口腔溃疡时，一方面通过与溃疡面的良好贴合促进溃疡面吸收，另一方面，通过无机盐相对于溃疡处的较高渗透压促进间充质干细胞外泌体中的成分的吸收。

本发明的第二个目的是提供一种上述间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将间充质干细胞外泌体(浓度为10-1000μg/L)与无机盐混合均匀，得到外泌体混合液；

将微针成型基质在40℃～60℃下溶于水，将得到的胶状物倒入多孔微针模板中，在0℃～30℃下冷却，得到多孔微针板；

(2)将外泌体混合液灌注于多孔微针板中，然后将微针固定基质制成膜覆盖于多孔微针板远离微针针尖的一侧，在0℃～30℃下冷却成型，得到间充质干细胞外泌体微针贴剂；

或者

(S1)将间充质干细胞外泌体(浓度为10-1000μg/L)、微针成型基质与微针固定基质混合均匀，在0℃～8℃(优选为4℃～8℃)下经超声处理，形成微球；

(S2)将微球与无机盐混合均匀，将得到的胶状物倒入多孔微针模板中，在0℃～30℃下冷却，得到间充质干细胞外泌体微针贴剂。

进一步地，在步骤(2)或(S2)中，冷却后还包括用灭菌薄膜进行包装然后封口的步骤。

进一步地，在步骤(2)或(S2)中，微针固定基质中还混有固化剂。

进一步地，间充质干细胞外泌体的制备方法如下：

人胎盘间充质干细胞细胞以1×10⁶/cm²的密度接种于培养瓶中。将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂饱和湿度孵育箱中培养，每隔三四天换液。换液用间充质干细胞培养基。待细胞长至培养瓶底60％面积时，加入无血清培养液，48h后，收集培养上清液，离心，过滤后得到含外泌体的浓缩液。然后将浓缩液与浓度为300g/L蔗糖混匀后离心，收集沉淀，稀释后再次离心，取滤液得到间充质干细胞外泌体。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、利用间充质干细胞外泌体促进细胞增长，消除炎症；

2、应用间充质干细胞外泌体、生物可降解高分子微针成型基质制成微针贴剂，便于固定于创伤面；

3、通过微针贴剂提供大分子药物输送的级通道，大大促进了大分子在创伤部位的吸收；

4、利用相对高渗条件进一步提高了吸收速度和吸收率，加速了创口的愈合。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明的一种治疗口腔溃疡的间充质干细胞外泌体微针贴剂的显微照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明以下实施例中的间充质干细胞外泌体微针贴剂，以重量为基准，间充质干细胞外泌体、微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水的质量比为1-50:70～99:10～29:10～30:0.1～20:10～29。间充质干细胞外泌体占微针成型基质质量分数的15-25％(优选为18％-22％)。

微针贴剂中的微针的针长为100-300微米，针宽为10-100微米。微针贴剂针尖的形状为斜尖或锥尖。微针贴剂中的微针为实心针。无机盐可选择氯化钠、氯化钾和磷酸缓冲盐中的一种或几种。进一步地，间充质干细胞不限于胎盘间充质干细胞，还包括其它组织器官来源的间充质干细胞，如脐带、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织。

实施例1间充质干细胞外泌体的制备

人胎盘间充质干细胞细胞以1×10⁶/cm²的密度接种于培养瓶中。将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂饱和湿度孵育箱中培养，每隔三四天换液。换液用间充质干细胞培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，待细胞长至培养瓶底60％面积时，加入无血清培养液，48h后，收集培养上清液，合并。取30mL上清液，1000×g离心15min除去细胞碎片，再经0.45μm无菌滤膜过滤到20mL规格的超滤离心管中，4℃条件下1 000×g离心70min，得到含外泌体的浓缩液，将浓缩液移至加有200μL质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中，4℃条件下，100 000×g离心70min，收集底部沉淀用PBS稀释后，再次100 000×g离心70min，洗涤1次，最后将收集的外泌体浓缩液进行蛋白定量，0.22μL滤膜过滤除菌，分装，配制终浓度为10-1000μg/L的外泌体，于-80℃冷藏备用。

实施例2间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备

(1)将实施例1提取的间充质干细胞外泌体与无机盐按比例混合均匀配制，-20℃～8℃冷冻保存备用。

(2)制备卡波姆(carbomer)微针原液(10％，w/v)：称取1.0g卡波姆974溶于9mL蒸馏水中，搅匀、溶胀；以0.1mol/L的NaOH调pH至6。

(3)取微针原液，投入PLGA中(PLGA占混合物总重的15％)，置于40℃～60℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入脱模剂PEG(分子量4000g/mol)适量(PLGA质量的2-5％)，混合均匀，并迅速倒入具有10μm～100μm孔径的多孔微针模板中，减压至-70KPa，0℃～30℃环境下冷却，制备成多孔微针板模具。

(4)采用离心操作注模：将模具放入离心机中，3000g相对离心力下离心10min。

(5)将间充质干细胞外泌体混合液均匀灌注于多孔微针板中，然后真空干燥24h，使得微针干燥成型。然后置于无水乙醇中，超声清洗干净。

(6)取聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体和固化剂，以10:1(w/w)混匀，真空脱气30min，制成膜后倒入模具中，覆盖在多孔微针板模具中远离微针针尖的一面，于恒温烘箱中低温固化2h，冷却至室温后取出。微针板脱模后用灭菌薄膜进行内包装，封口，外包装，即为间充质干细胞外泌体微针贴剂，图1是其显微照片。微针贴剂中的微针以微针成型基质作为壳体，间充质干细胞外泌体填充于微针成型基质形成的壳体内，微针固定基质将间充质干细胞外泌体包封于微针成型基质中。

实施例3间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备

(1)将实施例1提取的间充质干细胞外泌体与无机盐按比例混合均匀配制，-20℃～8℃冷冻保存备用。

(2)制备麦芽糖微针原液(25％，w/v)：称取3.0g麦芽糖溶于9mL蒸馏水中，搅匀、溶胀；以0.1mol/L的NaOH调pH至6。

(3)取微针原液，投入PLGA中(PLGA占混合物总重的10％)，置于40℃～60℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入脱模剂PEG(分子量4000g/mol)适量(PLGA质量的2-5％)，混合均匀，并迅速倒入具有10μm～100μm孔径的多孔微针模板中，减压至-70KPa，0℃～30℃环境下冷却，制备成多孔微针板模具。

(4)采用离心操作注模：将模具放入离心机中，3000g相对离心力下离心10min。

(5)将间充质干细胞外泌体混合液均匀灌注于多孔微针板中，然后常温下真空干燥24h，使得微针干燥成型。然后置于无水乙醇中，超声清洗干净。

(6)取聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体和固化剂，以10:1(w/w)混匀，真空脱气30min，制成膜后倒入模具中，覆盖在多孔微针板模具中远离微针针尖的一面，于恒温烘箱中低温固化2h，冷却至室温后取出。微针板脱模后用灭菌薄膜进行内包装，封口，外包装，即为间充质干细胞外泌体微针贴剂。

实施例4间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备

(1)将实施例1提取的间充质干细胞外泌体与无机盐按比例混合均匀配制，-20℃～8℃冷冻保存备用。

(2)制备羧甲基纤维素CMC微针原液(25％，w/v)：称取1.0g CMC溶于9mL蒸馏水中，搅匀、溶胀；以0.1mol/L的NaOH调pH至6。

(3)取微针原液，投入PLGA中(PLGA占混合物总重的10％)，置于40℃～60℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入脱模剂PEG(分子量4000g/mol)适量(PLGA质量的2-5％)，混合均匀，并迅速倒入具有10μm～100μm孔径的多孔微针模板中，减压至-70KPa，0℃～30℃环境下冷却，制备成多孔微针板模具。

(4)采用离心操作注模：将模具放入离心机中，3000g相对离心力下离心10min。

(5)将间充质干细胞外泌体混合液均匀灌注于多孔微针板中，然后常温下真空干燥24h，使得微针干燥成型。然后置于无水乙醇中，超声清洗干净。

(6)取聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体和固化剂，以10:1(w/w)混匀，真空脱气30min，制成膜后倒入模具中，覆盖在多孔微针板模具中远离微针针尖的一面，于恒温烘箱中低温固化2h，冷却至室温后取出。微针板脱模后用灭菌薄膜进行内包装，封口，外包装，即为间充质干细胞外泌体微针贴剂。

实施例5

(1)将实施例1提取的间充质干细胞外泌体、微针成型基质(CMC、麦芽糖和PEG)与微针固定基质(硫酸软骨素、PLGA和壳聚糖)混合均匀，在4℃～8℃下经超声处理，形成级微球；

(2)将级微球与无机盐(氯化钠)混合均匀，将得到的胶状物倒入多孔微针模板中，在0℃～30℃下冷却，得到间充质干细胞外泌体微针贴剂。

实施例6口腔溃疡临床试验

一、病例选择、分组与治疗

接受化疗治疗后发生口腔溃疡的50例患者。所有患者均经病理组织学检查确诊为恶性实体瘤(TNM分期临床分期为III-IV期)。其中结直肠癌12例、胃癌10例、肺癌11例、食管癌11例、***3例、乳腺癌3例。

纳入病例标准：(1)30-75岁；(2)KPS评分70-90分；(3)化疗分别采用FOL-FOX4、FOLFIRI、DCF、TP、PC、S-1XELOX、AC-T、GEMOX等方案，其中包含烷化剂、抗代谢类和抗癌抗生素类。

实验分组：50例随机分为治疗组和对照组，其中治疗组为本发明实施例2制备的间充质干细胞外泌体微针贴剂组25例，对照组25例。两组患者在性别、年龄、疾病分期、溃疡部位、面积、化疗方案及合并症等方面均无显著性差异(P>0.05)。

治疗方案：对照组给予生理盐水500ml+2％利多卡因注射液20ml+***注射液5mg+庆大霉素24万单位含漱等对症处理，每日2次，治疗周期为7天。治疗组在此基础上加用使用本发明实施例2制备得到的间充质干细胞外泌体微针贴剂，每日1次；从发生口腔溃疡24h内开始用药，治疗7天后停药，停药后评价疗效。每天观察记录两组溃疡面个数、大小、肉芽生长情况等口腔溃疡愈合情况、进食情况以及患者口腔疼痛情况。

口腔溃疡的程度评定：参照WHO抗癌急性及亚急性毒性反应分度标准。

溃疡疼痛程度分级溃疡疼痛程度分级：按WHO数字疼痛分级标准级，采用视觉模拟评分法(VAS)进行评价。

疗效评价：治愈：7天内疼痛和其他症状完全消失，进食不受影响，黏膜颜色恢复，溃疡面完全愈。显效：疼痛缓解2度以上，可进流食，黏膜颜色改善，溃疡面缩小70％以上。起效：黏膜颜色改善，溃疡面缩小30％以。无效：疼痛程度基本未缓解，影响进食，溃疡面无变化，其他症状未改善，达不到起效指标。以治愈+显效来计算有效率。

二、试验结果

(1)两组治疗口腔溃疡有效率比较：治疗前两组口腔溃疡分级程度基本接近。治疗7天后比较两组的口腔溃疡愈合情况，结果显示本发明提供的间充质干细胞外泌体微针贴具有明显促进溃疡愈合作用，治疗组有效率为92.0％，对照组为60.0％，差异有统计学意义(<0.05)。结果分别见表1、表2、表3。

表1：两组治疗前口腔溃疡程度比较[例(％)]

表2：两组口腔溃疡愈合情况

表3两组口腔溃疡的疗效比较

注：*P<0.05

(2)两组治疗后腔溃疡疼痛程度比较：治疗组的疼痛缓解率(84.6％)高于对照组(50.0％)，差异有统计学意(P<0.05)。结果见表4。

表4两组治疗前口腔溃疡疼痛程度比较

*P<0.05

临床试验表明本发明提供的间充质干细胞外泌体微针贴治疗口腔溃疡，使用后口腔溃疡面明显减小，愈合时间明显缩短，缓解了患者的疼痛，无不良反应。患者依从性高，局部应药方便、安全，且疗效显著，特别适用于治疗放化疗引起的口腔溃疡性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：贴剂中包括多个微针，形成所述微针的材料包括间充质干细胞外泌体、微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水，其中，以重量为基准，微针成型基质、微针固定基质、无机盐和水的质量比为70～99:10～29:10～30:0.1～20:10～29；

所述间充质干细胞外泌体为P2～P25代组织间充质干细胞经饥饿培养后，再用表皮细胞生长因子刺激后所得；所述间充质干细胞外泌体占微针成型基质质量分数的15-25％；

所述微针成型基质和微针固定基质为具有生物相容性的可降解高分子。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：所述微针成型基质为卡波姆、羧甲基纤维素、麦芽糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、PEG和PVA中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：所述微针固定基质为硫酸软骨素、聚二甲基硅氧烷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、透明质酸、PEG和多糖中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：所述无机盐为氯化钠、氯化钾和磷酸缓冲盐中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：所述组织间充质干细胞为来源于胎盘、脐带、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺的间充质干细胞。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂，其特征在于：所述微针贴剂中的微针的针长为10-300微米，针宽为10-100微米。

7.权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂在制备治疗口腔溃疡贴剂中的应用。

8.一种权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将间充质干细胞外泌体与无机盐混合均匀，得到外泌体混合液；

将所述微针成型基质在40℃～60℃下溶于水，将得到的胶状物倒入多孔微针模板中，在0℃～30℃下冷却，得到多孔微针板；

(2)将所述外泌体混合液灌注于所述多孔微针板中，然后将微针固定基质制成膜覆盖于所述多孔微针板远离微针针尖的一侧，在0℃～30℃下冷却成型，得到所述间充质干细胞外泌体微针贴剂；

或者

(S1)将间充质干细胞外泌体、微针成型基质与微针固定基质混合均匀，在0℃～8℃下经超声处理，形成微球；

(S2)将所述微球与无机盐混合均匀，将得到的胶状物倒入多孔微针模板中，在0℃～30℃下冷却，得到所述间充质干细胞外泌体微针贴剂。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)或(S2)中，冷却后还包括用灭菌薄膜进行包装然后封口的步骤。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)或(S2)中，间充质干细胞外泌体的浓度为10-1000μg/L。