CN109790545A - 产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种DNA表达载体，其包含：toxP；阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；和编码蛋白质的DNA序列，其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的DNA区段的表达。优选的是本发明的DNA表达载体包含编码信号肽的DNA序列，以使所表达蛋白质在加工之前连接于所述信号肽。新型蛋白质由本发明的DNA表达载体产生出。

Description

产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途
相关申请的引用
本申请要求2016年3月10日提交的美国临时专利申请号62/306,281的权益，所述美国临时专利申请据此出于所有目的以引用的方式并入，所述引用的程度就好像在本文中完全阐述一样。
电子提交材料的引用并入
本申请含有已通过EFS网以ASCII格式提交并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。2017年3月2日创建的所述ASCII拷贝名为P13869-02_SL.txt，并且大小是134,966字节。
政府利益的声明
本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号A137856、A136973、A1097138、UC7A1095321-01在政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
发明背景
(地尼白介素-2(denileukin diftitox))是一种含521个氨基酸的重组DNA源性细胞毒性蛋白，由白喉毒素片段A和一部分片段B的氨基酸序列(Met1-His388)以及人白介素-2的序列(IL-2；Ala1-Thr133)组成。它当前在大肠埃希氏菌(E.coli)表达***中产生，并且具有58kD的分子量。新霉素用于发酵过程中，但在最终产品中不可检测。以意图用于静脉内(IV)施用的无菌冷冻溶液形式提供在单次使用小瓶中的在1999年由FDA核准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。由于关于在最终制剂中存在具有异质分子量的蛋白质聚集物、过量残余DNA和过量残余清洁剂的担忧，FDA在2011年6月将置于临床暂停状态。的产生通过在大肠埃希氏菌细胞质中表达重组蛋白来实现，而这个表达***产生形成包含多肽的大型不溶性聚集物或所谓包涵体的重组蛋白。在包括使包涵体形式变性和再折叠的当前生产过程中，具有异质分子量的蛋白质聚集物仍然存在于最终制剂中。在纯化形式中存在这些聚集物是使用大肠埃希氏菌源性细胞质包涵体作为多肽的来源的结果，并且是由于即使在吐温20(Tween 20)存在下毒素的跨膜结构域也具有内在疏水性质。使用这个方法产生的将在下文中被称为经典或
此外，如同所有细菌毒素和植物毒素一样，携带诱发血管渗漏综合征(VLS)的氨基酸基序。约30％的用治疗的患者显现在伴有快速重量增加的外周水肿至低白蛋白血症至肺水肿的范围内的VLS症状。需要的是1)使得能够以高产率和纯度产生Ontak样蛋白、从而消除最终商业产品中的聚集物的方法，和2)伴有最小VLS副作用以向患者提供更安全药物的经修饰的Ontak样蛋白。
发明内容
本发明的一个实施方案是一种DNA表达载体，其包含：toxP；阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；和编码蛋白质的DNA序列，其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的DNA区段的表达。优选的是本发明的DNA表达载体包含编码信号肽的DNA序列，以使从DNA表达载体表达出的蛋白质连接于通常被裂解去除以形成成熟蛋白质的所述信号肽。优选突变toxO是SEQ ID NO:1，并且优选信号肽是SEQ ID NO:5。本发明的DNA表达载体可用于产生许多种类的蛋白质诸如CRM 197和CRM 107或其组合。CRM蛋白序列以SEQ ID NO:18-21加以说明。优选的是本发明的DNA表达载体编码白喉毒素或其功能性部分，其连接于受体结合蛋白或其功能性部分以形成白喉毒素受体融合蛋白。所述融合蛋白的受体结合蛋白部分可选自包括以下的组：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1(heregulinβ1)、其功能性部分或其组合。白喉毒素融合蛋白的实例包括以SEQ ID NO:11-15中的任一者加以说明的蛋白。
本发明的另一实施方案是一种DNA表达载体，其包含：toxP；阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质包含信号序列；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域；和选自包括以下的组的靶标受体结合结构域：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、其功能性部分或其组合，其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的所述DNA序列的表达。通常，用本发明的DNA表达载体转化的细菌产生连接于信号肽的白喉毒素受体结合融合蛋白，其由所述信号肽引导至周质、培养基或这两个位置。如果细菌是大肠埃希氏菌，那么信号肽通常将白喉毒素受体结合融合蛋白引导至周质。如果细菌是白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)，那么信号肽将白喉毒素受体结合融合蛋白引导至培养基。优选的是本发明的DNA表达载体包含SEQ ID NO:3，并且可包含编码可裂解蛋白质标签的DNA，其中所述可裂解蛋白质标签连接于白喉毒素受体结合融合蛋白。由本发明的DNA表达载体产生的白喉毒素受体结合融合蛋白的实例包括SEQ ID No:11至15中的任一者。
本发明的另一实施方案包括一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明的DNA表达载体转化细菌；形成转化体；在培养基中孵育所述转化体以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；以及从所述培养基纯化所述蛋白质。用于这个方法中的优选细菌是白喉棒杆菌。
本发明的另一实施方案包括一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：1)用DNA载体转化白喉棒杆菌菌株，所述DNA载体包含：toxP；阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质包含：信号肽；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域；和选自包括以下的组的靶标受体结合结构域：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、TNFα、TGFβ、其功能性部分或其组合，其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的所述DNA序列的表达；2)形成转化体；3)在培养基中孵育所述转化体以使所述蛋白质表达，并且其分泌至所述培养基中；和4)从所述培养基纯化所述白喉毒素融合蛋白。通过本发明方法产生的白喉毒素受体融合蛋白的实例包括SEQ ID NO:11至15中的任一者。用于本发明方法中的优选白喉棒杆菌菌株是棒杆菌C7β(-),tox(-)。
本发明的另一实施方案包括一种治疗患有结核病的患者的方法，其包括以下步骤：制备如本申请中提供的白喉毒素融合蛋白；向患有结核病的患者施用所述白喉毒素融合蛋白。
本发明的另一实施方案包括一种包含突变toxO启动子的DNA表达载体。
本发明的另一实施方案包括一种含有本发明的DNA表达载体的白喉棒杆菌菌株。
本发明的另一实施方案是制备蛋白质的方法，其包括以下步骤：提供DNA表达载体，其包含toxP、阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO、信号序列和编码蛋白质的DNA序列；用所述DNA载体转化细菌菌株以形成转化体；在培养基中孵育所述转化体持续一段时期以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；以及从所述培养基纯化所述蛋白质。
本发明的另一实施方案是一种选自SEQ ID NO:11-15中的任一者的融合蛋白。
本发明的另一实施方案是一种包含上述融合蛋白的药物组合物。
本发明的另一实施方案是一种药物组合物，其包含上述融合蛋白和至少一种或多种其他化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括异烟肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、利福布丁(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素(streptomycin)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素(kanamycin)、乙硫异烟胺(ethionamide)、丙硫异烟胺(protionamide)、特立齐酮(terizidone)、氨硫脲(thiacetazone)、环丝氨酸(cycloserine)、缠霉素(capreomycin)、对氨基水杨酸(PAS)、紫霉素(viomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、贝达喹啉(bedaquiline)、或迪拉马尼(delamanid)、利奈唑胺(linezolid)、特地唑胺(tedezolid)、阿莫西林-克拉维酸(amoxicillin-clavulanic acid)、美罗培南(meropenem)、亚胺培南(imipenem)、克拉霉素(clarithromycin)或氯苯吩嗪(clofazimine)。
药物组合物包含上述融合蛋白和至少一种或多种其他抗微生物剂。抗微生物剂的实例包括异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、特立齐酮、氨硫脲、环丝氨酸、缠霉素、对氨基水杨酸(PAS)、紫霉素、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、贝达喹啉、或迪拉马尼、利奈唑胺、特地唑胺、阿莫西林-克拉维酸、美罗培南、亚胺培南、克拉霉素或氯苯吩嗪。
本发明的另一实施方案是一种治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自SEQ ID NO:11-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。
本发明的另一实施方案是一种治疗或预防受试者的结核病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自SEQ ID NO:11-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。
本发明的另一实施方案是一种包含本发明的DNA表达载体的原核细胞系。
本发明的另一实施方案是包含本发明的DNA表达载体的试剂盒。
本发明的另一实施方案是一种包含SEQ ID NO:2的toxP。
本发明的另一实施方案是一种具有SEQ ID NO:11至15中的任一者的蛋白质。
附图说明
图1a-图1b说明：a)本发明的突变toxO(SEQ ID NO:1)，b)野生型toxO(SEQ ID NO:25)。
图2a-图2b说明：a)说明用于制造的经典地尼白介素-2(c-地尼白介素-2)表达载体，和b)说明本发明的包括tox启动子(toxP)和突变toxO的分泌型地尼白介素-2(s-地尼白介素-2)表达载体。图2a公开SEQ ID NO:26，并且图2b公开SEQ ID NO:27。
图3说明称为c-地尼白介素-2-VLM的血管渗漏突变体(VLM)与c-地尼白介素-2在杀灭携带IL2受体的细胞方面具有相等效价。
图4说明c-地尼白介素-2-VLM不导致体外血管渗漏。
图5说明使用小鼠存活模型，c-地尼白介素-2-VLM相比于具有显著更小的体内急性毒性。
图6说明本发明的基于白喉毒素的融合蛋白毒素平台技术。
图7说明质粒pKN2.6Z-LC127，其具有tox启动子(具有SEQ ID NO:2的toxP)和突变tox操纵子(toxO)(DNA SEQ ID NO:1)、连接于c-地尼白介素-2DNA序列(DNA SEQ ID NO:6)的信号肽(DNA SEQ ID NO:4)。
图8a-图8b说明：a)在大肠埃希氏菌中以细胞质包涵体形式制造的常规方法的问题，和b)说明产生相比于蛋白，少一个氨基酸的分泌型地尼白介素-2的容易和清洁的制造方法。图8a将“fMGADD”公开为SEQ ID NO:28，并且图8b将“GADD”公开为SEQID NO:29。
图9说明通过本发明方法制备的s-地尼白介素-2的免疫印迹，其中s-地尼白介素-2在白喉棒杆菌菌株C7β(-),tox(-)内表达，并且分泌至培养基中。
图10说明本发明的地尼白介素-2如何被预期使结核性肉芽肿内的携带IL-2R(CD25+)的T细胞(Treg)耗竭。Treg通过它们对Teff细胞的抑制而具有免疫抑制性。
图11说明白喉融合蛋白用于体内治疗具有结核分枝杆菌的受试者(小鼠)。
图12说明用基于白喉毒素的融合蛋白治疗受结核分枝杆菌感染的受试者(小鼠)的结果。
图13说明用于治疗受结核分枝杆菌感染的受试者(小鼠)的基于白喉毒素的融合蛋白方案。
图14说明使用基于白喉毒素的融合蛋白来治疗患有恶性黑素瘤的受试者(人)。
图15说明用于使用His(组氨酸标签)来快速产生VLM s-Ontak和相关蛋白质的三种构建体(“His6/6x His”和“His9/9x His”分别被公开为SEQ ID NO 23和48)。
图16说明使用C末端His6VLM s-Ontak构建体产生的在大于97％纯度下的纯化VLMs-Ontak(“His6”被公开为SEQ ID NO:23)。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域中的技术人员通常理解的含义。以下参考书目提供技术人员本发明中使用的许多术语的一般性定义：Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编,1988)；TheGlossary of Genetics,第5版,R.Rieger等(编),Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另外指定，否则如本文所用，以下术语具有以下所归于它们的含义。
术语“活性”是指基因执行它的功能的能力，诸如吲哚胺2,3-双加氧酶(一种氧化还原酶)催化必需氨基酸色氨酸(trp)降解成N-甲酰基-犬尿氨酸。
就“药剂”来说，其意指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
就“改善”来说，其意指使疾病的发展或进展降低、抑制、减弱、减低、遏止或稳定。
就“改变”来说，其意指如通过本领域已知的标准方法诸如本文所述的那些所检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或降低)。如本文所用，改变包括表达水平变化10％，优选是表达水平变化25％，更优选是变化40％，并且最优选是变化50％或更大。
就“类似物”来说，其意指不相同，但具有类似功能或结构特征的分子。举例来说，多肽类似物保留相应天然存在的多肽的生物活性，同时相对于天然存在的多肽，具有使类似物的功能增强的某些生物化学修饰。所述生物化学修饰可使类似物的蛋白酶抗性、膜可渗透性或半衰期增加，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。
c-在与某一术语相连时意指“经典”，诸如c-地尼白介素-2意指或那种可商购获得的蛋白质。
就“疾病”来说，其意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病状或病症。疾病的实例包括癌症和结核病。
就“有效量”来说，其意指为相对于未治疗患者来改善疾病的症状所需的量。用于实施本发明以治疗性治疗疾病的活性化合物的有效量视施用方式、受试者的年龄、体重和总体健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当量和剂量方案。所述量被称为“有效”量。
术语“表达”是指基因的表达基因产物的能力，所述基因产物包括例如所述基因的相应mRNA或蛋白质序列。
就“片段”来说，其意指多肽或核酸分子的一部分。这个部分优选含有参照核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
is-在与某一术语相连时意指“不成熟分泌”，诸如is-地尼白介素-2意指含有信号肽的不成熟分泌型地尼白介素-2。
ms-在与某一术语相连时意指“成熟分泌”，诸如ms-地尼白介素-2意指已被加工，并且不再含有信号肽的成熟分泌型地尼白介素-2。
n-在与某一术语相连时意指“新”，诸如n-地尼白介素-2意指新地尼白介素-2。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“防治性治疗”等是指使不患有病症或病状，但处于显现所述病症或病状的风险下或容易显现所述病症或病状的受试者中显现病症或病状的概率降低。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白来修饰。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。
就“降低”来说，其意指负性改变至少10％、25％、50％、75％或100％。
“参照”是指标准或对照条件，诸如不含或大致上不含药剂的样品(人细胞)或受试者，所述药剂诸如一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物。
“参照序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参照序列可为指定序列的子组或整体；例如全长cDNA或基因序列的区段，或完整cDNA或基因序列。对于多肽，参照多肽序列的长度将通常是至少约16个氨基酸，优选是至少约20个氨基酸，更优选是至少约25个氨基酸，并且甚至更优选是约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参照核酸序列的长度将通常是至少约50个核苷酸，优选是至少约60个核苷酸，更优选是至少约75个核苷酸，并且甚至更优选是约100个核苷酸或约300个核苷酸或在其左右或在其之间的任何整数。
s-在与某一术语相连时意指“分泌”，诸如s-地尼白介素-2意指分泌型地尼白介素-2。分泌型地尼白介素-2包括is-形式和m-形式。
如本文所用，术语“受试者”是指对其执行本文所述的方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但如将由本领域中的人士所了解，受试者可为动物。因此，受试者的定义内包括其他动物，包括哺乳动物，诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括母牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
就“大致上同一”来说，其意指多肽或核酸分子展现与参照氨基酸序列(例如任一本文所述的氨基酸序列)或核酸序列(例如任一本文所述的核酸序列)的至少50％同一性。优选地，这种序列在氨基酸水平上或在核酸的情况下与用于比较的序列至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％同一。
通常使用序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包(University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。所述软件通过对各种取代、缺失和/或其他修饰指定同源性程度来匹配同一或类似序列。保守性取代通常包括以下各组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在一用以确定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程序，其中在e-3与e-100之间的概率评分指示密切相关序列。
本文提供的范围应理解为是范围内所有值的简写形式。举例来说，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”等是指减轻或改善病症和/或与其相关的症状。应了解，尽管不排除，但治疗病症或病状不要求所述病症、病状或与其相关的症状被完全消除。
除非明确陈述或根据上下文显而易知，否则如本文所用，术语“或”应理解为是包括性的。除非明确陈述或根据上下文显而易知，否则如本文所用，术语“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”应理解为是单数性的或复数性的。
除非明确陈述或根据上下文显而易知，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域中的正常容许偏差的范围内，例如在2个平均值标准偏差内。约可理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外根据上下文是明晰的，否则本文提供的所有数值都用术语约修饰。
在对本文变量的任何定义中叙述一列化学基团包括将那个变量定义为任何单一基团或所列基团的组合。对本文变量或方面的实施方案的叙述包括那个实施方案呈任何单一实施方案形式或与任何其他实施方案或其部分组合。
本文提供的任何组合物或方法都可与一种或多种本文提供的任何其他组合物和方法组合。
VLM-在与某一术语相连时意指“血管渗漏突变体”，诸如地尼白介素-2-VLM意指地尼白介素-2血管渗漏突变体。
w-在与某一术语相连时意指“野生型”，诸如w-白喉毒素意指野生型白喉毒素。
具体实施方式
本发明的一个实施方案是发现一种产生具有增强的纯度和品质的不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法。这个方法包括用本发明的DNA表达载体转化细菌，优选包括白喉棒杆菌菌株。本发明的DNA表达载体被设计来包括特定遗传元件，所述遗传元件包括tox启动子(toxP)和重叠新型突变tox操纵子(toxO)；优选包括信号序列，并且包括编码蛋白质的DNA序列。蛋白质优选是包括白喉毒素或其功能性部分和靶标受体结合结构域或其功能性部分的融合蛋白。术语“其功能性部分”意指白喉毒素蛋白的充当毒素的部分或靶标受体结合结构域的结合它的受体的部分。设计本发明的DNA表达载体，以便蛋白质在tox启动子(toxP)和突变tox操纵子(toxO)的情况下表达。
突变toxO
toxO是19bp操纵子区域，由间插有中心胞嘧啶(C)碱基的两个9bp不完全回文臂组成。由本发明者发现的野生型toxO(图1b)和突变toxO(图1a)操纵子显示于图1中。SEQ IDNO:1说明本发明的突变toxO的DNA序列的一个实施方案。toxP是具有DNA序列SEQ ID NO:2的启动子。SEQ ID NO:2说明toxP DNA序列包括toxO DNA序列。SEQ ID NO:3是包括toxP、tox0、信号肽和编码蛋白质的DNA序列的DNA序列。SEQ ID NO:3中的星号指示被引入来产生突变toxO的变化。
SEQ ID NO:1(突变toxO DNA序列)
SEQ ID NO:2(包括突变toxO DNA序列的toxP，其中对突变toxO序列加下划线)
toxO DNA操纵子序列由称为白喉毒素阻遏物DtxR的蛋白质结合。DtxR是一种能够控制基因表达的全面性铁活化调控蛋白。在铁充足条件下，Fe2+和Fe3+离子结合apo-DtxR，从而导致使得DtxR阻遏物的同二聚体形成的构象变化，所述同二聚体结合tox操纵子(toxO)DNA序列并且阻遏tox基因表达。在低铁环境中，Fe2+和Fe3+离子从DtxR解离，从而导致它丧失它的DNA结合能力并且从操纵子解离；这个事件由此使得tox基因产物表达。图1b说明野生型toxO DNA序列。
为克服Fe2+和Fe3+离子对tox表达的抑制作用，产生用突变toxO DNA序列替换野生型(WT)toxO的DNA表达载体。这个变化阻断Fe离子介导的tox基因表达调控。图1a、SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3说明本发明的突变toxO DNA序列。在本发明下，可使具有在toxP和突变toxO控制下编码白喉毒素融合蛋白的重组质粒的细菌诸如大肠埃希氏菌和白喉棒杆菌在Fe充足培养基中生长，使其生长至高密度，并且将不需要转变成无Fe培养基来诱导表达。在铁充足培养基中组成性表达tox基因产物代表本领域中的重大进步。白喉棒杆菌，具体来说是C7β(-),tox(-)菌株，是用于使用本发明的DNA表达载体来产生所有白喉毒素相关重组蛋白的优选宿主细菌。本发明的DNA表达载体可用于其他细菌诸如大肠埃希氏菌中。
DNA表达载体
本发明的DNA表达载体包含toxP、突变toxO、编码蛋白质的DNA序列，并且优选包括信号序列。SEQ ID NO:3是含有可为本发明的DNA表达载体的一部分的这些遗传元件的DNA序列的一个实例。如所提及，在SEQ ID NO:3中观察到的星号被置于突变toxO与野生型toxO之间的碱基对变化的上方。对SEQ ID NO:3进行编号以使toxP从碱基1延伸至碱基30，并且toxO在碱基24处开始并在碱基42处结束(在加下划线DNA序列之前)。加下划线DNA序列代表碱基74至碱基148，并且是编码含25个氨基酸的信号序列的DNA的区域(也在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和图2中观察到)。优选构建本发明的DNA表达载体，以便一种或多种蛋白质在toxP、突变toxO的情况下表达，并且被翻译来具有N末端信号序列。N末端信号序列使一种或多种蛋白质(从载体表达)以分泌为目标，并且N末端信号肽稍后被裂解以产生成熟活性蛋白质。SEQ ID NO:3包括编码蛋白质诸如新型地尼白介素-2(称为分泌型地尼白介素-2或s-地尼白介素-2)的DNA序列。s-地尼白介素-2具有两种形式，称为不成熟分泌型地尼白介素-2(is-地尼白介素-2)和成熟分泌型地尼白介素-2(ms-地尼白介素-2)。SEQ ID NO:12是本发明的is-地尼白介素-2，并且SEQ ID NO:13是本发明的ms-地尼白介素-2。is-地尼白介素-2含有在加工期间被裂解去除以形成ms-地尼白介素-2的信号序列。此外，SEQ ID NO:3包括在碱基149处开始直至碱基1711的DNA序列，其编码蛋白质，具体来说是含有白喉毒素的功能性部分和IL 2的功能性部分的融合蛋白。形成新地尼白介素-2融合蛋白序列，称为ms-地尼白介素-2，其是含520个氨基酸的多肽，并且由白喉毒素片段A和一部分片段B的氨基酸序列(Gly1-His387)以及人白介素-2的序列(IL-2；Ala1-Thr133)组成。由于信号序列的裂解，本发明的ms-地尼白介素-2缺乏存在于经典地尼白介素-2(c-地尼白介素-2)中的第一甲硫氨酸，并且由此比称为的经典地尼白介素-2蛋白的氨基酸序列短一个氨基酸。SEQ ID NO:13是新白喉毒素蛋白序列ms-地尼白介素-2的蛋白质序列，其可与含有称为的经典地尼白介素-2(c-地尼白介素-2)的蛋白质序列的SEQ ID NO:10进行比较。
本发明的DNA表达载体包含编码一种或多种蛋白质的DNA序列。本发明的优选蛋白质是包含白喉毒素(或其功能性部分)和靶标受体结合蛋白(或其功能性部分)的融合蛋白。可由DNA表达产生的白喉毒素的一实例是白喉毒素的任何功能性部分，或白喉毒素血管渗漏突变体的任何功能性部分。由本发明的DNA表达载体产生的靶标受体结合结构域的蛋白质的实例包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、TNFα、TGFβ或其组合。视治疗应用而定，可使用其他靶标受体结合结构域；然而，SEQ.ID NO.9是编码IL2受体结合结构域的功能性部分的优选DNA序列。出于本发明的目的，一些DNA质粒及其遗传元件说明于图1、图2、图6和图7中。由本发明的DNA表达载体编码的融合蛋白的实例包括SEQ ID NO:11、12、13、14、15、19和21。
SEQ ID NO:3(编码分泌型地尼白介素-2或s-地尼白介素-2的DNA序列。序列包括toxP、突变toxO、信号序列、白喉毒素的功能性部分和IL2的功能性部分。粗体和星号指示引入来产生突变toxO的变化)
SEQ ID NO:4(信号DNA序列)
SEQ ID NO:5(信号蛋白质序列)
SEQ ID NO:6(经典地尼白介素-2DNA序列)
形成具有最小血管渗漏或不具有血管渗漏的白喉毒素融合蛋白(地尼白介素-2- VLM)
如同所有细菌毒素和植物毒素一样，地尼白介素-2携带可诱发血管渗漏综合征(VLS)的氨基酸基序。约30％的用治疗的患者显现在伴有外周水肿的快速重量增加至低白蛋白血症至肺水肿的范围内的VLS。如美国专利号8,865,866中所述对的DNA序列进行突变。发现对DNA序列进行的使得在SEQ ID NO:10的第7残基处的缬氨酸(GTT)被如SEQ ID NO:16中所示的丙氨酸替换的DNA突变导致融合毒素具有少许或不具有血管渗漏综合征副作用。这些突变体被称为“血管渗漏突变体”(VLM)。在图3中，显示血管渗漏突变体或地尼白介素-2-VLMS与c-地尼白介素-2具有相同效价，在图4中，显示其不导致血管渗漏，并且在图5中，显示其相比于c-地尼白介素-2具有显著更小的体内急性毒性。s-地尼白介素-2-VLM具有SEQ ID NO:14和15中所示的替换在第6残基处的缬氨酸的丙氨酸。s-地尼白介素-2-VLM蛋白应具有与在c-地尼白介素-2-VLM蛋白的情况下所见的毒性降低类似的毒性降低。
此外，SEQ ID NO:10(c-地尼白介素-2的氨基酸序列)中所示的序列V29D30S31和I290D291S292在突变时也将使VLS减轻。这个发现中的主张是在V29D30S31和/或I290D291S292中引入取代诸如V29A或I290A可被引入白喉毒素融合蛋白的相应位置中，并且这些取代也将在进一步减轻血管渗漏综合征方面具有价值。
SEQ ID NO:7(地尼白介素-2-VLM，此处显示为GCT的加下划线的密码子编码丙氨酸，描述于美国专利号8,865,866中。)
将SEQ ID NO:7(美国专利号8,865,866中所述的地尼白介素-2-VLM)与SEQ IDNO:8(本发明的is-地尼白介素-2-VLM)进行比较的DNA序列比对证明SEQ ID NO:8缺失1381-1437这行中的密码子(三个碱基)。
类似性：1563/1638(95.42％)
SEQ ID NO:9(DNA序列，地尼白介素-2的IL-2部分)
使用本发明的DNA表达载体产生的蛋白质
本发明的成熟活性白喉毒素相关融合蛋白的第一氨基酸是SEQ ID NO:13和15中如以粗体显示的甘氨酸(氨基酸1)。SEQ ID NO:4内的信号序列用负数标记，从成熟融合蛋白的第一甘氨酸向回计数，并且具有以下氨基酸序列MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHA(SEQ IDNO:22)。信号序列显示于SEQ ID NO:11和12中，并且加下划线。成熟分泌型白喉毒素融合蛋白包括白喉毒素部分诸如Gly1-His387，和靶标受体结合结构域诸如SEQ ID NO:3中的IL-2蛋白Ala388-Thr520。用于本发明中的可融合于白喉毒素蛋白(或其功能性部分)的其他靶标受体结合结构域包括IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、TNFα、TGFβ以及其他靶标受体结合结构域或其组合。SEQ ID NO:10描述不是分泌型，并且需要从大肠埃希氏菌中的包涵体纯化的c-地尼白介素-2。SEQ ID NO:12描述具有信号序列的不成熟分泌型is-地尼白介素-2。SEQ ID NO:13描述MS-地尼白介素-2，其中信号序列已在向细胞外间隙分泌的过程期间被裂解去除。
SEQ ID NO:10(称为的c-地尼白介素-2的蛋白质序列)
SEQ ID NO:11(w-白喉毒素)
SEQ ID NO:12(is-地尼白介素-2)
SEQ ID NO:13(ms-地尼白介素-2)
SEQ ID NO:14(is-地尼白介素-2-VLM的蛋白质序列)
SEQ ID NO:15(ms-地尼白介素-2-VLM的蛋白质序列)
SEQ ID NO:16(美国专利号8,865,866中所述的地尼白介素-2-VLM的蛋白质序列)
作为美国专利号8,865,866中所述的在位置445处具有额外氨基酸(L)的地尼白介素-2-VLM的SEQ ID NO:16在相较于本发明的SEQ ID NO:14is-地尼白介素-2-VLM时的蛋白质比对。
类似性：521/522(99.81％)
使用DNA表达载体来制造蛋白质。
除使用方法来表达s-地尼白介素-2之外，使用非Fe依赖性分泌表达上述与白喉毒素相关的蛋白质所进行的方法也具有若干商业应用。方法可用于改进(增强)以下各物的表达(产率)：
野生型白喉毒素：
用于制备作为存在于DTP、TDaP和其他组合疫苗中的白喉疫苗的白喉类毒素的野生型白喉毒素(SEQ ID NO:11)可使用本发明的DNA表达载体来制备。可将编码SEQ ID NO:11的DNA区段放置在本发明的DNA表达载体中，并且定位在ToxP/突变ToxO的下游。
交叉反应物质-197(CRM197)和交叉反应物质-107(CRM107)：
CRM197和CR107是全长白喉毒素的具有高度免疫原性，但完全缺乏毒素活性的突变蛋白质。它们用作若干多糖缀合疫苗的载体。举例来说，Wyeth和Pfizer在1990年代利用这个免疫原性，当时，它使来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的7个多糖缀合于CRM197以产生在2000年2月经FDA核准的原始沛儿(Prevnar)疫苗。13-多糖沛儿在2010年经FDA核准。来自Novartis的脑膜炎球菌疫苗脑宁安(Menveo)是4个脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)多糖加CRM197。这个疫苗在2010年获得FDA核准。癌症免疫治疗公司Imugene(ASX：IMU)报道当它使用CRM197作为载体蛋白时，来自它的靶向HER2的B细胞肽癌症免疫疗法的抗体滴度得以显著改进。CRM197也正作为潜在药物递送蛋白质加以评估。总部位于瑞士的Turing Pharmaceuticals正着手于具有长度多达1,000个氨基酸的治疗性蛋白质的CRM197融合构建体。本发明的DNA表达载体可用于产生CRM 197和CRM 107。可将编码SEQ ID NO:18-21的DNA区段中的一者或多者放置在本发明的DNA表达载体中，并且定位在ToxP/突变ToxO的下游。
具有用于增强纯化的可裂解肽或蛋白质标签的基于白喉毒素的融合蛋白。
可使可裂解肽标签(诸如His6(SEQ ID NO:23)或FLAG[DYKDDDDK](SEQ ID NO:24))或蛋白质标签(诸如GST[谷胱甘肽S-转移酶]或SUMO[小泛素样修饰蛋白])与基于白喉毒素的融合蛋白所特有的蛋白酶裂解位点融合。使用结合标签的抗体或配体进行的亲和色谱方法可用于快速纯化标签化蛋白质。在纯化之后，特定裂解位点使得标签能够与所需白喉毒素相关蛋白质分离。所述融合可使对本发明的基于白喉毒素的融合蛋白的纯化增强。
SEQ ID NO:17(ms-CRM197的蛋白质序列)
SEQ ID NO:18(is-CRM197的蛋白质序列)
SEQ ID NO:19(ms-CRM107的蛋白质序列)
SEQ ID NO:20(is-CRM107的蛋白质序列)
表1
使用多肽的His标签化形式纯化VLM s-Ontak
在白喉棒杆菌C7中产生的VLM s-Ontak的一些制剂的情况下，存在对含520个氨基酸的成熟多肽的缓慢蛋白水解裂解。这可能归因于由白喉棒杆菌C7产生的分泌型蛋白酶。这个蛋白水解裂解发生在含520个氨基酸的成熟VLM s-Ontak的近似氨基酸390处。
已出于使所需蛋白质纯化而离开培养上清液中存在的分泌型蛋白酶得以加速的目的构建VLM s-Ontak的组氨酸标签化(His标签化)形式。烟草蚀刻病毒(TEV)核包涵体a内肽酶(EC 3.4.22.44)识别位点也已被工程改造至VLM s-Ontak的这些His标签化形式中。TEV裂解位点的目的在于使得能够在最终制备VLM s-Ontak时移除多聚His序列。TEV是一种高度特异性内肽酶，其识别氨基酸序列ENLYFQ\X，其中‘\’表示经裂解肽键，并且X代表任何小型疏水性或极性氨基酸诸如甘氨酸(G)。
具有TEV裂解位点的N末端His标签化VLM s-Ontak。如SEQ ID:38(N末端具有His标签的VLM s-Ontak的蛋白质序列)中所示，有可能向VLM s-Ontak的不成熟蛋白质序列中在它的N末端附近添加氨基序列HHHHHHENLYFQ。在这个形式中，序列HHHHHHENLYFQ紧接在含26个氨基酸的信号序列之后，并且紧靠在VLM s-Ontak的成熟序列(GADDVA...)之前出现。VLMs-Ontak的第一甘氨酸构成识别ENLYFQ\X(其中X是任何小型氨基酸)的TEV蛋白酶的末个识别残基。这个N末端His标签化VLM s-Ontak的成熟分泌型蛋白质序列以SEQ ID:39(N末端具有His标签的VLM s-Ontak在信号序列被裂解之后的蛋白质序列)显示，其是用它的His6标签进行的镍柱亲和纯化的良好候选物。可接着使亲和纯化的VLM s-Ontak暴露于少量纯TEV蛋白酶，从而导致使13个N末端残基MHHHHHHENLYFQ移除，并且释放如以SEQ ID:40(N末端具有His标签的VLM s-Ontak在信号序列被裂解以及TEV位点被裂解之后的蛋白质序列)显示的成熟未标签化VLM s-Ontak的酶促蛋白水解。
因为白喉棒杆菌C7的分泌型蛋白酶在近似氨基酸390处裂解，所以N末端His标签化可导致两种物质：全长所需VLM s-Ontak(520个氨基酸)和含390个氨基酸的N末端分解片段。在大小(以及分子组成)方面相对接近的这两种多肽难以通过尺寸排阻色谱法来分离。因此，我们也已开发VLM s-Ontak的C末端His标签化形式。
不具有TEV裂解位点的C末端His标签化VLM s-Ontak。如SEQ ID:42(C末端具有His标签的VLM s-Ontak的蛋白质序列)中所示，有可能向VLM s-Ontak的不成熟蛋白质序列中在它的C末端处添加氨基序列HHHHHH。在这个形式中，序列HHHHHH紧接在VLM s-Ontak的C末端苏氨酸(….IISTLT)之后出现。这个C末端His标签化VLM s-Ontak的成熟分泌型蛋白质序列以SEQ ID:43(C末端具有His标签的VLM s-Ontak在信号序列被裂解之后的蛋白质序列)显示，其是用它的His6标签进行的镍柱亲和纯化的良好候选物。
具有TEV裂解位点的C末端His标签化VLM s-Ontak。为避免在通过C末端His标签化制备的VLM s-Ontak的以上形式(SEQ ID:43)的最终多肽序列中具有His6序列，有可能在C末端处***TEV识别序列以使得能够移除His标签序列。在这个形式中，序列ENLYFQGHHHHHHHHH紧接在VLM s-Ontak的C末端苏氨酸(….IISTLT)之后出现。因为镍亲和结合由甚至长于6个氨基酸的多聚His序列增强，所以有可能包括9个His残基。具有TEV裂解位点的这个C末端His标签化VLM s-Ontak的氨基酸序列以SEQ ID:45(C末端具有TEV His9标签的VLM s-Ontak的蛋白质序列)显示。具有TEV裂解位点的这个C末端His标签化VLM s-Ontak的成熟分泌型蛋白质序列以SEQ ID:46(C末端具有TEV His9标签的VLM s-Ontak在信号序列被裂解之后的蛋白质序列)显示，并且是用它的His9标签进行的镍柱亲和纯化的良好候选物。可接着使亲和纯化的VLM s-Ontak暴露于少量纯TEV蛋白酶，从而导致使10个C末端残基GHHHHHHHHH移除，并且释放如以SEQ ID:30显示的成熟未标签化VLM s-Ontak的酶促蛋白水解。值得注意的是，纯化VLM s-Ontak的这个形式(SEQ ID:30)的长度是526个氨基酸而非520个氨基酸(SEQ ID 15)，因为它含有TEV蛋白酶识别序列的6个额外氨基酸(融合于VLM s-Ontak的常见C末端苏氨酸(….IISTLT)的ENLYFQ)。具有TEV裂解位点的C末端His标签化VLM s-Ontak的这个形式(SEQ ID:30)的最终结果是C末端序列….IISTLTENLYFQ。
用于包括His标签和TEV蛋白酶位点的VLM s-Ontak的制造方法。VLM s-Ontak的以上三种His标签形式(具有TEV蛋白酶位点的N末端His6标签、不具有TEV蛋白酶位点的C末端His6标签、和具有TEV蛋白酶位点的C末端His9标签)是在VLM s-Ontak的制造方法中使用His标签/镍柱亲和色谱法的方法的实例。由于存在于培养上清液中的来自白喉棒杆菌C7的分泌型蛋白酶，所以重要的是使VLM s-Ontak快速纯化而离开培养上清液中的其他蛋白质以避免所需产物的显著损失。包括His标签和TEV蛋白酶位点代表重大改进，并且可使得能够达成VLM s-Ontak的快速、精简而高效的制造方法。
产生缺乏关键分泌型蛋白酶的白喉棒杆菌C7以达成对VLM s-Ontak的改进制造。白喉棒杆菌C7的基因组序列揭示两种分泌型蛋白酶：蛋白酶1是NCBI参照序列WP_014318592.1(SEQ ID:32、33)，并且蛋白酶2是NCBI参照序列WP_014318898.1(SEQ ID:35、36)。这些蛋白酶可使用Ton-That和Scheewind(Ton-That H,Schneewind O.Assembly ofpili on the surface of Corynebacterium diphtheriae.Mol Microbiol.2003年11月；50(4):1429-38.PubMed PMID:14622427)以及Allen和Schmitt(Allen CE,SchmittMP.HtaA is an iron-regulated hemin binding protein involved in theutilization of heme iron in Corynebacterium diphtheriae.J Bacteriol.2009年4月；191(8):2638-48.PubMed PMID:19201805)的方法来遗传缺失。用以敲除蛋白酶1和蛋白酶2的等位交换底物分别以SEQ ID:34和SEQ ID:37显示。这些序列在***采用sacB反向选择的接合***配质粒pk18mobsacB(A,Tauch A,W,Kalinowski J,ThierbachG,Pühler A(1994)Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived fromthe Escherichia coli plasmids pK18and pK19:selection of defined deletions inthe chromosome of Corynebacterium glutumicum.Gene 145:69–73.PMID:8045426)中时导致将敲除各蛋白酶的构建体。缺乏蛋白酶1与蛋白酶2两者的重组白喉棒杆菌菌株将是对于用以产生VLM s-Ontak的未来制造方法有价值的生产菌株。
基于白喉毒素的融合蛋白的蛋白质制造方法
使用本发明的DNA质粒和表达载体，发现了一种消除与制造的常规方法相关联的问题的新型方法。当前使用DNA载体在大肠埃希氏菌表达***中来表达。c-地尼白介素-2或的长度是521个氨基酸，并且具有58kD的分子量。常规制造方法导致在最终制剂中形成具有异质分子量的聚集物、残余DNA和过量残余清洁剂，从而导致FDA在2011年6月将经典置于临床暂停状态。如在图8a中所观察，在大肠埃希氏菌中从质粒表达，并且导致称为包涵体形式的不溶性胞质(蛋白质)积累。使用本发明方法，图8b说明s-地尼白介素-2以无细胞上清液中的细胞外成熟分泌型蛋白质形式表达，其可易于被纯化，并且导致如图9中说明的较高蛋白质产率。图9显示对总蛋白质的考马斯蓝(Coomassie Blue)染色与用IL-2抗体探测的使用本发明方法产生的s-地尼白介素-2的抗IL2免疫印迹两者。
本发明的新型方法包括：1)用本发明的DNA表达载体转化细菌，优选是白喉棒杆菌菌株，2)形成转化体；3)在培养基中孵育所述转化体持续一段时期以允许生长和蛋白质(诸如通常含有信号肽的基于白喉毒素的融合蛋白和CRM)表达，4)使所述蛋白质分泌至所述培养基中(归因于连接于所述蛋白质的信号肽)；和(8)从所述培养基纯化所述基于白喉毒素的融合蛋白。DNA表达载体包含调控至少一种可连接于本发明的信号肽的蛋白质诸如白喉毒素融合蛋白、CRM蛋白或其他蛋白质的表达的ToxP和突变ToxO。
本发明的基于白喉毒素的融合蛋白的治疗应用
的临床功效已在皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、类固醇难治性移植物抗宿主疾病、甲氨蝶呤难治性牛皮癣和甲氨蝶呤难治性类风湿性关节炎的情况下得以证明。如图14中所示，临床功效也已在恶性黑素瘤和卵巢癌的情况下得以证明。相比于可商购获得的关于治疗或预防疾病的临床功效，通过本发明方法产生的本发明的基于白喉毒素的融合蛋白(包括s-地尼白介素-2、ms-地尼白介素-2、is-地尼白介素-2-VLM、ms-地尼白介素-2-VLM)将以类似或更好方式表现。
治疗结核病
如图10中所说明，本发明的发明者相信本发明的白喉毒素融合蛋白针对结核病将具有活性。已知地尼白介素-2会使携带IL-2受体(CD25+)的细胞耗竭，所述细胞包括T调控(Treg)细胞。Treg细胞表达CD25以及FoxP3，并且通过它们对T效应(Teff)细胞的抑制而具有免疫抑制性。在用以含有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细菌性感染的结核性肉芽肿内，需要Teff细胞诸如CD4+T辅助(Th)细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在结核性感染期间，称为肉芽肿的细胞病变形成以含有感染，但不能完全根除杆菌。调控性T细胞(Treg)被募集至肉芽肿，从而导致对效应T细胞功能的抑制，潜在促成结核分枝杆菌持续和生长的容许环境。本发明的白喉毒素融合蛋白用于使表达IL-2受体的Treg耗竭，以改善在TB感染期间由这些细胞达成的免疫抑制。图11说明白喉融合蛋白用于体内治疗具有结核分枝杆菌的受试者(小鼠)。通过在第0天在肺中给予初始植入约2.8log10CFU计数的气雾剂感染，用结核分枝杆菌菌株H37Rv感染小鼠。各组小鼠用750ng 以一个治疗循环(1x，在感染后第2周给药)或两个治疗循环(2x，在感染前约第3天和在感染后第2周给药)形式在腹膜内(IP)或在静脉内(IV)治疗。地尼白介素-2的治疗循环定义为35mg/kg(对于典型小鼠是750ng)被相隔2天给予两次。通过口服管饲进行的RHZ每日治疗在第2周开始。R是利福平，并且在10mg/kg下对小鼠给予。H是异烟肼，并且在10mg/kg下对小鼠给予。Z是吡嗪酰胺，并且在150mg/kg下对小鼠给予。这个研究的结果说明于图12和图13中。
治疗癌症
也已显示Treg会抑制抗肿瘤免疫性，并且Treg在肿瘤中的细胞扩增通常与患者的不良预后相关联。在黑素瘤患者中用地尼白介素-2治疗导致Treg的短暂耗竭，并且使1年中值总体存活率增加。本发明的s-地尼白介素-2和s-地尼白介素-2-VLM将作为癌症免疫疗法用于使肿瘤受Treg严重浸润的患者中的Treg耗竭。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请案和专利，都据此以引用的方式并入本文，该引用的程度就好像个别地和明确地指示将各参考文献以引用的方式并入本文并且整体阐述于本文中一样。
除非本文另外指示或由上下文明确反驳，否则在描述本发明的情形下(尤其在以下权利要求的情形下)使用术语“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”以及类似指示物应解释为涵盖单数与复数两者。除非另外指示，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为是开端术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则在本文中叙述数值范围仅意图充当个别地提及各单独值属于范围内的简写方法，并且各单独值就好像它个别地在本文中叙述一样并入说明书中。除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则本文所述的所有方法都可以任何适合顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性措辞(例如“诸如”)的使用都仅意图更好阐明本发明，并且不对本发明的范围造成限制。说明书中的措辞不应解释为指示任何非要求的要素为实施本发明所必需。
本文描述本发明的优选实施方案，包括用于执行本发明的最佳模式。那些优选实施方案的变化形式可在阅读先前描述后变得为本领域普通技术人员显而易知。本发明者预期熟练技术人员在适当时采用所述变化形式，并且本发明者意图本发明以不同于如本文特定所述的方式加以实施。因此，本发明包括随附于其的权利要求中叙述的主题的如由适用法律容许的所有修改形式和等效物。此外，除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则本发明的所述要素以其所有可能的变化形式的任何组合都由本发明涵盖。
本公开的实施方案涉及用于治疗和/或预防病症诸如癌症和结核病的方法和/或组合物，其中向受试者施用包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物。
可向已知患有疾病诸如癌症和/或结核病，被怀疑患有这种疾病，或处于患有这种疾病的风险下的个体提供有效量的包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物。处于癌症或结核病的风险下的那些个体可为具有一种或多种遗传因素的那些个体，可具有较大年龄，和/或可具有例如家族史。
在本公开的特定实施方案中，除包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物之外，也向个体给予用于癌症和/或结核病疗法的药剂。所述额外疗法可包括例如化学疗法或抗微生物剂。当采用与包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物的组合疗法时，额外疗法可在包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物之前、同时和/或之后给予。
药物制剂
本发明的药物组合物包含溶解或分散于药学上可接受的载体中的有效量的一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物。短语“药物或药理学上可接受”是指分子实体和组合物在向动物，诸如像在适当时向人施用时不产生不利、过敏性或其他不适当反应。包含至少一种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白或额外活性成分的的本发明组合物的药物组合物的制备将为本领域技术人员鉴于本公开而得知，如由以引用的方式并入本文的Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版Lippincott Williams andWilkins,2005例示。此外，对于动物(例如人)施用，应了解制剂应满足如由FDA生物标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、这样类似物质及其组合，如将为本领域普通技术人员所知(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，其以引用的方式并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则预期它用于药物组合物中。
视它将以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及它对于诸如注射的施用途径来说是否需要无菌而定，一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物可包含不同类型的载体。本发明组合物可按以下方式施用：静脉内、真皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、***内、直肠内、经表面、肌肉内、皮下、经粘膜、经口、经表面、局部、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浴浸靶标细胞的局部化灌注、通过导管、通过灌洗、以乳霜形式、以脂质组合物(例如脂质体)形式、或通过如将为本领域普通技术人员所知的其他方法或前述各种方式的任何组合(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990，其以引用的方式并入本文)。
可将一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物配制成呈游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如用蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或其用无机酸诸如像盐酸或磷酸、或诸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸的有机酸形成。用游离羧基形成的盐也可源于无机碱，诸如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。在配制后，溶液将以可与剂量配制相容的方式，并且以诸如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如被配制以进行胃肠外施用的剂型，诸如可注射溶液，或用于向肺递送的气雾剂，或被配制以进行消化性施用的剂型，诸如药物释放胶囊等。
此外，根据本公开，适于施用的本发明组合物在有或无惰性稀释剂下提供于药学上可接受的载体中。载体应是可吸收的，并且包括液体、半固体即糊状物、或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或对其中含有的组合物的治疗有效性有害，否则它在可施用组合物中使用以用于实施本发明方法是适当的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等或其组合。组合物也可包含各种抗氧化剂以延缓对一种或多种组分的氧化。另外，防止微生物作用可通过防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂来达到，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
根据本发明，使组合物与载体以任何适宜和切实可行的方式组合，即通过溶解、混悬、乳化、掺混、囊封、吸附等。所述程序对于本领域技术人员来说是常规的。
在本发明的一特定实施方案中，使组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以任何适宜方式诸如研磨来进行。也可在混合过程中添加稳定剂以保护组合物免遭治疗活性损失，即在胃中变性。用于组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等。
在其他实施方案中，本发明可涉及使用药物脂质媒介物组合物，其包括一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白、一种或多种脂质和水性溶剂的本发明组合物。如本文所用，术语“脂质”将被定义为包括特征是不溶于水，并且可用有机溶剂萃取的广泛范围的物质中的任一者。这个广泛化合物类别为本领域技术人员所熟知，并且当术语“脂质”在本文中使用时，它不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂族烃的化合物和它们的衍生物。脂质可为天然存在的或合成的(即由人设计或产生)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质及其组合。当然，除本文明确所述的那些以外的由本领域技术人员理解为脂质的化合物也由本发明的组合物和方法涵盖。
本领域普通技术人员将熟悉可用于使组合物分散在脂质媒介物中的技术的范围。举例来说，可使一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物分散于含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，共价键合于脂质，以混悬液形式含于脂质中，含于胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合，或另外通过为本领域普通技术人员所知的任何手段与脂质或脂质结构缔合。分散可或可不导致形成脂质体。
向动物患者施用的本发明组合物的实际剂量可由身体和生理因素决定，所述因素诸如体重、病状的严重性、所治疗的疾病的类型、先前或并行治疗干预、患者的特发病和施用途径。视施用剂量和途径而定，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据受试者的响应而变化。在任何情况下，负责施用的从业者都将确定组合物中活性成分的浓度和适于个别受试者的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可占单位的重量的约2％至约75％之间，或例如约25％至约60％之间，以及其中可导出的任何范围。当然，可以使得将以任何给定单位剂量的化合物获得适合剂量的方式制备各治疗适用组合物中的活性化合物的量。诸如溶解性、生物可用度、生物半衰期、施用途径、产品储存期限以及其他药理学考虑事项的因素将由制备所述药物制剂的领域中的技术人员思量，因此，多种剂量和治疗方案可为合乎需要的。
在其他非限制性实例中，剂量也可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，直至约1000mg/kg/体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在可从本文所列的数值导出的范围的非限制性实例中，基于上述数值，可施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
消化性组合物和制剂
在本公开的一个实施方案中，配制一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ IDNO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物以通过消化性途径来施用。消化性途径包括其中组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。具体来说，本文公开的药物组合物可经口、经颊、经直肠或舌下施用。因此，可将这些组合物与惰性稀释剂一起或与可吸收食用载体一起配制，或可将它们封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，或可将它们压制成片剂，或可将它们直接与膳食的食物合并。
在某些实施方案中，可将活性化合物与赋形剂合并，并且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用(Mathiowitz等,1997；Hwang等,1998；美国专利号5,641,515；5,580,579和5,792,451，各自以引用的方式整体明确并入本文)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下各物：粘合剂，诸如像黄蓍胶、***胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如像磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如像玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，诸如像硬脂酸镁；甜味剂，诸如像蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如像胡椒薄荷、冬青油、樱桃味调味剂、橙味调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，除以上类型的物质之外，它也可含有液体载体。各种其他物质可作为包衣存在或可存在以另外改进剂量单位的实物形式。举例来说，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或两者包覆。当剂型是胶囊时，除以上类型的物质之外，它也可含有载体诸如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可被肠溶性包覆。肠溶性包衣防止组合物在其中pH是酸性的胃或肠上部中变性。参见例如美国专利号5,629,001。在到达小肠后，其中的碱性pH使包衣溶解，并且容许组合物释放以及由特化细胞例如上皮肠上皮细胞和派伊尔氏斑(Peyer's patch)M细胞吸收。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃味或橙味调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质都应是药学上纯净的，并且在所用量下大致上无毒。此外，可将活性化合物掺入持续释放制备物和制剂中。
对于经口施用，本公开的组合物可或者与一种或多种赋形剂合并成嗽口剂、洁牙剂、经颊片剂、口腔喷雾剂或舌下经口施用制剂的形式。举例来说，可制备嗽口剂，从而将活性成分以所需量掺入适当溶剂诸如硼酸钠溶液(多贝尔氏溶液(Dobell's Solution))中。或者，可将活性成分掺入经口溶液诸如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的经口溶液中，或分散于洁牙剂中，或以治疗有效量添加至可包括水、粘合剂、磨蚀剂、调味剂、起泡剂和保湿剂的组合物中。或者，可将组合物塑造成可被放置在舌下或另外溶解于口腔中的片剂或溶液形式。
适于其他消化性施用模式的额外制剂包括栓剂。栓剂是具有各种重量和形状，通常含药，用于***直肠中的固体剂型。在***之后，栓剂软化，熔融，或溶解于腔液中。一般来说，对于栓剂，传统载体可包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可由含有例如在约0.5％至约10％，并且优选是约1％至约2％的范围内的活性成分的混合物形成。
胃肠外组合物和制剂
在其他实施方案中，一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物可通过胃肠外途径来施用。如本文所用，术语“胃肠外”包括绕过消化道的途径。具体来说，本文公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内、真皮内、肌肉内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内的方式施用(美国专利号6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363，各自以引用的方式整体明确并入本文)。
可制备呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物于以适合方式与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合的水中的溶液。也可制备于甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及于油中的分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利5,466,468，以引用的方式整体明确并入本文)。在所有情况下，形式必须无菌，并且就存在容易可注射性而言必须是流体。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须对抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用加以保存。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合混合物和/或植物油。适当流动性可例如通过使用包覆剂诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来达成。在许多情况下，将优选的是包括等张剂，例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
对于以水溶液进行胃肠外施用，举例来说，如果必要，那么溶液应加以适合缓冲，并且首先用足够盐水或葡萄糖致使液体稀释剂等张。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而论，可采用的无菌水性介质将为本领域技术人员鉴于本公开而得知。举例来说，可将一个剂量溶解于等张NaCl溶液中，并且添加至皮下灌注液中，或在提出的输注部位处注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,第1035-1038和1570-1580页)。视所治疗受试者的状况而定，某一剂量变化将必然存在。在任何情况下，负责施用的人士都将确定适于个别受试者的剂量。此外，对于人施用，制剂应满足如由FDA生物制剂标准办公室(FDA Office of Biologics standards)所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液通过将活性化合物以所需量在必要时与以上列举的各种其他成分一起掺入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将各种灭菌活性成分掺入含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。使粉状组合物与液体载体诸如像水或盐水溶液在有或无稳定剂下组合。
杂项药物组合物和制剂
在本发明的其他优选实施方案中，可配制一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物以通过各种杂项途径例如经表面(即经皮)施用、经粘膜施用(鼻内、经***等)和/或吸入来施用。
用于经表面施用的药物组合物可包括被配制以获得含药涂敷剂(诸如软膏剂、糊剂、乳膏剂或粉剂)的活性化合物。软膏剂包括用于表面涂敷的所有油性、吸附、乳化和水溶性基质化组合物，而乳膏剂和洗剂是仅包括乳化基质的那些组合物。经表面施用的药物可含有渗透增强剂以促进活性成分穿过皮肤进行吸收。适合渗透增强剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮卓酮。用于表面涂敷的组合物的可能基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂以及任何其他适合吸附、乳化或水溶性软膏基质。经表面制剂也可包括如为保存活性成分和提供均质混合物所必需的乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂。本发明的经皮施用也可包括使用“贴片”。举例来说，贴片可历经固定时期在预定速率下以及以连续方式提供一种或多种活性物质。
在某些实施方案中，药物组合物可通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入和/或其他气雾剂递送载体来递送。用于通过经鼻气雾喷雾剂来直接向肺递送组合物的方法已例如描述于美国专利号5,756,353和5,804,212(各自以引用的方式整体明确并入本文)中。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等,1998)和溶血磷脂酰基-甘油化合物(美国专利号5,725,871，以引用的方式整体明确并入本文)递送药物在药物领域中也是熟知的。同样，以聚四氟乙烯载体基质形式进行经粘膜药物递送描述于美国专利号5,780,045(以引用的方式整体明确并入本文)中。
术语气雾剂是指精细分散固体或液体粒子分散于液化或加压气体推进剂中的胶体***。用于吸入的本发明的典型气雾剂将由活性成分于液体推进剂或液体推进剂和适合溶剂的混合物中的混悬液组成。适合推进剂包括烃和烃醚。适合容器将根据推进剂的压力要求而变化。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、重量以及症状的严重性和响应而变化。
本公开的试剂盒
本文所述的任何组合物都可包括在试剂盒中。在一非限制性实例中，一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物可包括在试剂盒中。
试剂盒可包括以适合方式等分的一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ IDNO:11-15中的任一者或其融合蛋白并且在一些情况下包含一种或多种额外药剂的本发明组合物。可将试剂盒的组分包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器部件将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器部件，可向其中放置组分，并且优选的是所述组分以适合方式等分。当试剂盒中存在超过一种组分时，试剂盒也将通常含有可向其中单独放置额外组分的第二、第三或其他额外容器。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。本发明的试剂盒也将通常以紧密限制方式包括用于含有一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物的部件和任何其他试剂容器以进行商业销售。所述容器可包括所需小瓶被保持在其中的注射或吹气模制塑料容器。
当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液形式提供时，液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。可将一种或多种包含核酸或蛋白质序列诸如SEQ ID NO:11-15中的任一者或其融合蛋白的本发明组合物配制成可注射组合物。在所述情况下，容器部件可自身是注射器、吸移器和/或其他这样类似器具，制剂可从其向身体的受感染区域施加，向动物中注射，和/或甚至向试剂盒的其他组分中施加和/或与试剂盒的其他组分混合。
然而，试剂盒的组分可以干燥粉末形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末形式提供时，粉末可通过添加适合溶剂来复原。设想溶剂也可提供在另一容器部件中。
序列表
<110> 约翰·霍普金斯大学
<120> 产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途
<130> P13869-02
<140>
<141>
<150> 62/306,281
<151> 2016-03-10
<160> 48
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 1
ttaggatagc taagtccat 19
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 2
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc at 42
<210> 3
<211> 1711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 3
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc attattttat gagtcctggt 60
aaggggatac gttgtgagca gaaaactgtt tgcgtcaatc ttaatagggg cgctactggg 120
gataggggcc ccaccttcag cccatgcagg cgctgatgat gttgttgatt cttctaaatc 180
ttttgtgatg gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat 240
tcaaaaaggt atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa 300
agggttttat agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa 360
cccgctctct ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt 420
tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac 480
tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc 540
ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa 600
taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg 660
aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt 720
caggcgatca gtaggtagct cattgtcatg catcaacctg gattgggatg ttatccgtga 780
taaaactaaa actaagatcg aatctctgaa agaacacggt ccgatcaaaa acaaaatgag 840
cgaaagcccg aacaaaactg tatctgaaga aaaagctaaa cagtacctgg aagaattcca 900
ccagactgca ctggaacacc cggaactgtc tgaacttaag accgttactg gtaccaaccc 960
ggtattcgct ggtgctaact acgctgcttg ggcagtaaac gttgctcagg ttatcgatag 1020
cgaaactgct gataacctgg aaaaaactac cgcggctctg tctatcctgc cgggtatcgg 1080
tagcgtaatg ggcatcgcag acggcgccgt tcaccacaac actgaagaaa tcgttgcaca 1140
gtctatcgct ctgagctctc tgatggttgc tcaggccatc ccgctggtag gtgaactggt 1200
tgatatcggt ttcgctgcat acaacttcgt tgaaagcatc atcaacctgt tccaggttgt 1260
tcacaactct tacaaccgcc cggcttactc tccgggtcac aagacgcatg cacctacttc 1320
tagctctacc aagaaaaccc agctgcagct cgagcacctg ctgctggatt tgcagatgat 1380
cctgaacggt atcaacaatt acaagaaccc gaaactgacg cgtatgctga ccttcaagtt 1440
ctacatgccg aagaaggcca ccgaactgaa acacctgcag tgtctagaag aagaactgaa 1500
accgctggag gaagttctga acctggctca gtctaaaaac ttccacctgc ggccgcgtga 1560
cctgatctct aacatcaacg taatcgttct ggaactgaag ggctctgaaa ccaccttcat 1620
gtgtgaatac gctgatgaga ccgcaaccat cgtagaattc ctgaaccgtt ggatcacctt 1680
ctgtcagtct atcatctcta ccctgacctg a 1711
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 4
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgca 75
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 5
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25
<210> 6
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 6
atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
tcatgcatca acctggattg ggatgttatc cgtgataaaa ctaaaactaa gatcgaatct 660
ctgaaagaac acggtccgat caaaaacaaa atgagcgaaa gcccgaacaa aactgtatct 720
gaagaaaaag ctaaacagta cctggaagaa ttccaccaga ctgcactgga acacccggaa 780
ctgtctgaac ttaagaccgt tactggtacc aacccggtat tcgctggtgc taactacgct 840
gcttgggcag taaacgttgc tcaggttatc gatagcgaaa ctgctgataa cctggaaaaa 900
actaccgcgg ctctgtctat cctgccgggt atcggtagcg taatgggcat cgcagacggc 960
gccgttcacc acaacactga agaaatcgtt gcacagtcta tcgctctgag ctctctgatg 1020
gttgctcagg ccatcccgct ggtaggtgaa ctggttgata tcggtttcgc tgcatacaac 1080
ttcgttgaaa gcatcatcaa cctgttccag gttgttcaca actcttacaa ccgcccggct 1140
tactctccgg gtcacaagac gcatgcacct acttctagct ctaccaagaa aacccagctg 1200
cagctcgagc acctgctgct ggatttgcag atgatcctga acggtatcaa caattacaag 1260
aacccgaaac tgacgcgtat gctgaccttc aagttctaca tgccgaagaa ggccaccgaa 1320
ctgaaacacc tgcagtgtct agaagaagaa ctgaaaccgc tggaggaagt tctgaacctg 1380
gctcagtcta aaaacttcca cctgcggccg cgtgacctga tctctaacat caacgtaatc 1440
gttctggaac tgaagggctc tgaaaccacc ttcatgtgtg aatacgctga tgagaccgca 1500
accatcgtag aattcctgaa ccgttggatc accttctgtc agtctatcat ctctaccctg 1560
acctga 1566
<210> 7
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 7
atgggcgctg atgatgttgc tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
tcatgcatca acctggattg ggatgttatc cgtgataaaa ctaaaactaa gatcgaatct 660
ctgaaagaac acggtccgat caaaaacaaa atgagcgaaa gcccgaacaa aactgtatct 720
gaagaaaaag ctaaacagta cctggaagaa ttccaccaga ctgcactgga acacccggaa 780
ctgtctgaac ttaagaccgt tactggtacc aacccggtat tcgctggtgc taactacgct 840
gcttgggcag taaacgttgc tcaggttatc gatagcgaaa ctgctgataa cctggaaaaa 900
actaccgcgg ctctgtctat cctgccgggt atcggtagcg taatgggcat cgcagacggc 960
gccgttcacc acaacactga agaaatcgtt gcacagtcta tcgctctgag ctctctgatg 1020
gttgctcagg ccatcccgct ggtaggtgaa ctggttgata tcggtttcgc tgcatacaac 1080
ttcgttgaaa gcatcatcaa cctgttccag gttgttcaca actcttacaa ccgcccggct 1140
tactctccgg gtcacaagac gcatgcacct acttctagct ctaccaagaa aacccagctg 1200
cagctcgagc acctgctgct ggatttgcag atgatcctga acggtatcaa caattacaag 1260
aacccgaaac tgacgcgtat gctgaccttc aagttctaca tgccgaagaa ggccaccgaa 1320
ctgaaacacc tgctgcagtg tctagaagaa gaactgaaac cgctggagga agttctgaac 1380
ctggctcagt ctaaaaactt ccacctgcgg ccgcgtgacc tgatctctaa catcaacgta 1440
atcgttctgg aactgaaggg ctctgaaacc accttcatgt gtgaatacgc tgatgagacc 1500
gcaaccatcg tagaattcct gaaccgttgg atcaccttct gtcagtctat catctctacc 1560
ctgacc 1566
<210> 8
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 8
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
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atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
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<210> 9
<211> 402
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 9
gcacctactt ctagctctac caagaaaacc cagctgcagc tcgagcacct gctgctggat 60
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gaagaactga aaccgctgga ggaagttctg aacctggctc agtctaaaaa cttccacctg 240
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<210> 10
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
385 390 395 400
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
420 425 430
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
435 440 445
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
450 455 460
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
465 470 475 480
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
485 490 495
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
500 505 510
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 11
<211> 560
<212> PRT
<213> 白喉棒杆菌
<400> 11
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
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Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 12
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr
545
<210> 13
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 14
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
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Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr
545
<210> 15
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 16
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Met Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
385 390 395 400
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
420 425 430
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Leu Gln Cys Leu
435 440 445
Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser
450 455 460
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
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Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr
485 490 495
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
500 505 510
Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 17
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
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Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
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Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
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Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
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Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
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Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
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Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
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Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
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450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
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485 490 495
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500 505 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 18
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser
65 70 75 80
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Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
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195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
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His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 19
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr Gln Pro Phe Phe His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
385 390 395 400
Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465 470 475 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
485 490 495
Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu
500 505 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Phe Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 20
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Phe His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Phe Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 21
<211> 6402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 21
ggcgagtgct ttgaatgctt gggcttcttc acggcgggtc ttgaccgcgt tgataagttc 60
gcggccagag ctgaattgct ggcgtggggt ggggttgaac tggtcgtgtc ctgccatatc 120
ccttacctgc tttatcaagt ctccaaggcg catcacccgg ttgtgctgcc tataccaacg 180
ataagcggta ggggctttgc ctgtgtagaa cgggttgcgg ctaaagcggt gggaaaagtg 240
cgggtcatgg tctaaaagct cacccagcac acgcgtggtt gctgcaagaa gcttcatctg 300
cgcagattta ccgttacggt cagcgtagac agggtcaata agccatatga actgggcttt 360
gccgttagtt gggttaatac ccacccaggc tggcccgacg ctatgagtaa tcagtgagcg 420
caccacgtcg cggacgtacg ggtttaagtc tgcggggtca ccgcctgcgg tacctacttg 480
gtcaacgtct acgaccagga cggcggcgta ctgcttggtg gtgagcatgg cgtactcgca 540
ccgtcctaaa gcatcagtct cgaagcgata catacgcggc gagttcgtgc cgtcagcgtt 600
gcgtcgatag gcctttttaa agtctcgtgt gactgaaccg tggagtacat cgcggcctag 660
atgatcgcgt aaaaggtcgc ggtcactggc agatgctggg gtgttgtcca gtccaccacg 720
gtcgcgctcg acgcgggtag gtgttttagt gtgcgcattc tgcgcatgag tctgtaaact 780
catgaccgtg ctttctccca ggtgtgtgct gggtgataag cgaaagtcat cgggttgccg 840
cccggtggct ttcttcgttt ttcattgtct ttccctgact ctaaatgaca ccggtgttat 900
ttactagcca tgacacgcga aaaatatgcc ttttacctgc ggttacgtat ggctagacat 960
atggcaagct atacgtaacc gcgtttcagc tgcacagggc tgtctgcgca gatttaccat 1020
cacgggactt ttcccagttc aggctgcgca tatttacgca tacaacgaaa gcggttgcgc 1080
agatttacca cacactctgc gctgatttac cgatacgcag aaaaagcgtg cgcagattta 1140
cccatacggt ggcgaattat ccagagcaat aggtatacag caatacagta atacaggtgc 1200
cataaacctg tattactgta ttgctgtatg cctgtaaacc tttatttatt gttgtggacg 1260
tattcttcga ggtaggtgct aacaatctcg cggatggtca cgcctttttg ggcggcgatg 1320
actttaagtt ctgcgtgaag gtcgcggtcg atttcaatcg tcatcttctt gacgtagtcg 1380
cggcctgtgg gttggtggaa tgcgcttcgc actgttttct tctcggctgc tggagttagc 1440
ttcgtggctt ttttcattga ggttcgcggg ccttgctgcg ccctggcgcg ttctttactg 1500
gtgctcattt catcatctcc atgagttcgt cggcgacgtg gtcgtagccg tgcatgtcgg 1560
ggcctgggca gtatccaaac gctaggtgca tatcttcgcg tagcgggatt tcggttttaa 1620
agtgcggcat gtgttccgcg tcgagcgctt ctcgtgccgc gtcaagggcg ctggtgcctt 1680
tcctggcgaa cgtcagtaag actgcatgag gtgttccgtt gactgcgtcg cgcagctccc 1740
atactcggga gaggtcggca gcagcagaac gggtcggaag aatgatgaag tcgctgactg 1800
cgattgctgc ttcgatagcg ttctcgtctc ctggcggcac atcgataccg actgggcgat 1860
ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 1920
ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 1980
gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 2040
gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgct 2100
cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 2160
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 2220
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat 2280
agggcgaatt ggagctccac cgcggtggcg gccgctctag aactagtgga tccagggcat 2340
tgatttcaga gcacccttat aattaggata gctaagtcca ttattttatg agtcctggta 2400
aggggatacg ttgtgagcag aaaactgttt gcgtcaatct taataggggc gctactgggg 2460
ataggggccc caccttcagc ccatgcaggc gctgatgatg ttgttgattc ttctaaatct 2520
tttgtgatgg aaaacttttc ttcgtaccac gggactaaac ctggttatgt agattccatt 2580
caaaaaggta tacaaaagcc aaaatctggt acacaaggaa attatgacga tgattggaaa 2640
gggttttata gtaccgacaa taaatacgac gctgcgggat actctgtaga taatgaaaac 2700
ccgctctctg gaaaagctgg aggcgtggtc aaagtgacgt atccaggact gacgaaggtt 2760
ctcgcactaa aagtggataa tgccgaaact attaagaaag agttaggttt aagtctcact 2820
gaaccgttga tggagcaagt cggaacggaa gagtttatca aaaggttcgg tgatggtgct 2880
tcgcgtgtag tgctcagcct tcccttcgct gaggggagtt ctagcgttga atatattaat 2940
aactgggaac aggcgaaagc gttaagcgta gaacttgaga ttaattttga aacccgtgga 3000
aaacgtggcc aagatgcgat gtatgagtat atggctcaag cctgtgcagg aaatcgtgtc 3060
aggcgatcag taggtagctc attgtcatgc atcaacctgg attgggatgt tatccgtgat 3120
aaaactaaaa ctaagatcga atctctgaaa gaacacggtc cgatcaaaaa caaaatgagc 3180
gaaagcccga acaaaactgt atctgaagaa aaagctaaac agtacctgga agaattccac 3240
cagactgcac tggaacaccc ggaactgtct gaacttaaga ccgttactgg taccaacccg 3300
gtattcgctg gtgctaacta cgctgcttgg gcagtaaacg ttgctcaggt tatcgatagc 3360
gaaactgctg ataacctgga aaaaactacc gcggctctgt ctatcctgcc gggtatcggt 3420
agcgtaatgg gcatcgcaga cggcgccgtt caccacaaca ctgaagaaat cgttgcacag 3480
tctatcgctc tgagctctct gatggttgct caggccatcc cgctggtagg tgaactggtt 3540
gatatcggtt tcgctgcata caacttcgtt gaaagcatca tcaacctgtt ccaggttgtt 3600
cacaactctt acaaccgccc ggcttactct ccgggtcaca agacgcatgc acctacttct 3660
agctctacca agaaaaccca gctgcagctc gagcacctgc tgctggattt gcagatgatc 3720
ctgaacggta tcaacaatta caagaacccg aaactgacgc gtatgctgac cttcaagttc 3780
tacatgccga agaaggccac cgaactgaaa cacctgcagt gtctagaaga agaactgaaa 3840
ccgctggagg aagttctgaa cctggctcag tctaaaaact tccacctgcg gccgcgtgac 3900
ctgatctcta acatcaacgt aatcgttctg gaactgaagg gctctgaaac caccttcatg 3960
tgtgaatacg ctgatgagac cgcaaccatc gtagaattcc tgaaccgttg gatcaccttc 4020
tgtcagtcta tcatctctac cctgacctga ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc 4080
aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta ccagcttttg ttccctttag 4140
tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 4200
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 4260
gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag 4320
gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca 4380
gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga 4440
ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat 4500
ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt 4560
aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat 4620
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 4680
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 4740
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 4800
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 4860
aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 4920
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 4980
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 5040
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 5100
tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 5160
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 5220
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 5280
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 5340
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg 5400
ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt 5460
tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg 5520
gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag 5580
gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata 5640
agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag 5700
gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac cccttaaacg tccggatagt caccgctctt 5760
ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat 5820
ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg gaaatactga tcgttcacca tttggctaat 5880
acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga 5940
cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg 6000
tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg 6060
tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct 6120
tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg 6180
ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg 6240
ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc 6300
gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc 6360
atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc gtctacgtcc tg 6402
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签
<400> 23
His His His His His His
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知物
<220>
<223> 未知物的描述：野生型toxO序列
<400> 25
ttaggatagc tttacctaa 19
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val
20 25 30
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 28
Met Gly Ala Asp Asp
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 29
Gly Ala Asp Asp
1
<210> 30
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
515 520 525
<210> 31
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 31
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgaccgagaa cctgtacttc cagggccatc accaccacca ccaccatcat 1680
cactag 1686
<210> 32
<211> 250
<212> PRT
<213> 白喉棒杆菌
<400> 32
Met Arg Lys Ile Val Thr Leu Ala Ala Ala Ser Leu Leu Gly Ile Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ser Gly Val Leu Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Thr Asn
20 25 30
Gly Thr Pro Val Ser Pro Glu Asp Asp Thr Ala Ala Glu Gly Val Val
35 40 45
Gln Val Ala Ser Cys Thr Gly Thr Val Val Ala Ser Gln Trp Val Leu
50 55 60
Thr Ala Gln His Cys Val Glu Val Pro Asn Leu Gln Arg Pro Val Tyr
65 70 75 80
Val Gly Thr Thr Arg Glu Gln Gln Gln Arg Glu Glu Asn Thr Phe Thr
85 90 95
Ser Asp Tyr Ala Val Trp Ala Pro His Gly Asp Val Ala Leu Val His
100 105 110
Val Thr Asp Ala Leu Pro Gln Arg Leu Val Arg Ala Val Arg Arg Ala
115 120 125
Pro Val Ser Phe Gly Glu Gln Gly Arg Val Tyr Gly Trp Gly Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Glu Thr Leu Gln Tyr Ala Arg Ala Ala Val Gly Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Gly Val Arg Pro Gln Gly Asn Gln His Gly Ala Phe Ile Val Gln
165 170 175
Tyr Leu Asp Glu Ala Lys Ala Gly Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
180 185 190
Phe Val Asn Gly Glu Val Ala Gly Val Thr Ser Phe Lys Ala Pro Gln
195 200 205
Gly Gly Gly Arg Phe Ser Leu Phe Ala Ser Leu His Gly Leu Gly Asp
210 215 220
Trp Ile Ala Gln Thr Thr Ala Ala Lys Pro Glu Asn Pro Asn Ser Lys
225 230 235 240
Asn Gln Gln Ser Gln Gln Pro Arg Arg Pro
245 250
<210> 33
<211> 753
<212> DNA
<213> 白喉棒杆菌
<400> 33
atgcggaaaa ttgttactct tgctgcagca agcttgctgg gtattgcggg taccagcggt 60
gttcttggtg cggcaacagc caccgcactg acaaatggca cgcccgtctc ccctgaggac 120
gataccgctg ccgaaggcgt ggttcaagtg gctagttgta ctggcaccgt ggttgcttct 180
cagtgggtgc tgaccgccca gcattgcgtc gaggtgccca atttgcagcg gccggtctat 240
gttggcacca cccgcgagca gcaacaacgg gaagaaaata cgttcacctc ggattacgca 300
gtgtgggcac cgcacggcga tgtggcgttg gtgcatgtca ccgatgcgct gccgcagcgt 360
ctggtccgcg cggttcgccg cgcaccggtg agctttggtg agcagggacg cgtgtacggc 420
tggggtgctg gcaccggcga gacgctgcag tatgcccgcg ctgcggttgg taaaacttct 480
tccggagttc ggccgcaggg caaccagcat ggtgcattca tcgtgcagta tttggacgag 540
gctaaagccg ggcgtggcga ttccggcggg ccgctttttg tcaacggtga ggttgctggg 600
gtgacctcgt ttaaggctcc tcaaggtggt gggcgtttct cgctgtttgc ttcgctgcat 660
gggctaggcg attggattgc gcagaccacc gccgccaagc ccgagaaccc gaattccaag 720
aatcaacagt cccagcaacc acgtagaccg tag 753
<210> 34
<211> 1012
<212> DNA
<213> 白喉棒杆菌
<400> 34
ggatccgcaa ttgcgggaat cgtcgtgctt tttagccgaa attttcttgc agccagcgct 60
atgcttatcg cctcagggtt agccgctgac atttaccgct tgaggaataa tatgagtgga 120
aatcaacggt aatttcagaa gacttgccta cacctttagc tagcgaccac cattggtggt 180
cgctagcttt ttgatggctt aagggacatt tgggcatccg tgtatcgcac attagtcata 240
caggaaatcc tccaagattt cgtccgcatg cccgaccaga cactacagca cccacatagc 300
ttctcgattg tcttgcggag cgggagtagg tagctcacgt gctaccgcac ggggaaccgt 360
atattgctta tggtgtgccc attacccacc gttggtgcta tgatccgaac ggaaaaagtc 420
agtcgtatta gtgaatcacc gttccgccgc gcgagaacgc agggctccaa caagcgtgtg 480
gttccacaag attgcaagga tgtgtacggt gctggtggcg gtggctccag cctgggtctg 540
tcgtcttctt agcaagtctg cattcacggt tccctaggca atctttgagc aaatccctgt 600
ttaacgcccc tgtacgttcg gcgccgcaga aacctgccgg atcgtgatgt taatcctgcc 660
ttgttccagc ccgcagccgt cgggaagcgt ggcatcattc acgcgcacca ccccgtgata 720
agcaaaacgc ttcggcccac cgaaaaccac caagtcgccg gagcacagag tcacatcgtc 780
ccagggttgg gtgcgtgatt cggtgtgtcc catccgaaac agtgcttcgt cgccaatcga 840
tactgaaatg accggcgccc gcgattcctc aaattcatcg acgtgcatgc ccatcccgga 900
acccggcgga tagtagttga ccagcaccat ctctgtcacg aaggcctcta cccacggggc 960
tagttcttcg gcaacctccg ctgctgcgcg caacgctgcc ggcgccggat cc 1012
<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> 白喉棒杆菌
<400> 35
Met Lys Lys Leu Arg Thr Leu Ala Val Thr Leu Thr Ala Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ser Thr Met Ala Thr Met Pro Ala Gln Ala Val Ile Ser Pro Thr Pro
20 25 30
Ser His Gln Val Ser Leu Ala Tyr Val Ser Phe Asp Asn Met Gln Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Leu Val Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Ala Arg His Cys
50 55 60
Leu Asn Gly Gly Leu Gly His Val Arg Leu Gly Ala Asp His Phe Thr
65 70 75 80
Ala Val Arg Ala Val Ala His Pro Gln Ala Asp Leu Ala Val Leu His
85 90 95
Leu Asp Arg Pro Ala Pro Ile Ala Pro Ser Ala Ile Ser Gly Arg His
100 105 110
Thr Gln Pro Gly Asn Arg Phe Gly Val Ala Gly Tyr Gly Ser Thr Phe
115 120 125
Thr Gly Ile Pro Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Gln Arg Arg Val Thr
130 135 140
Asp Val Pro Ser Pro Asp Arg Gln Ala Val Met Ile Glu Asn His Ile
145 150 155 160
Ser Gln Gly Val Leu Arg Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Glu
165 170 175
Gly Asn His Val Ile Gly Val Leu Ser Met Ser Ser Ala Ser Gly Arg
180 185 190
Val Gly Trp Tyr Ile Pro Thr Ala Glu His Ala Asp Trp Ile Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Gly Ile Pro Ala Pro Gly Ser Val Asp Lys Pro Ala Pro Leu
210 215 220
Val Asp Ala Thr Ala Phe Pro Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ala Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 36
<211> 729
<212> DNA
<213> 白喉棒杆菌
<400> 36
atgaagaaac ttcgtaccct agccgtaacc ctgaccgcaa tcgcagcatc aaccatggcg 60
accatgccag cacaagcagt gattagtccg acaccgtcac atcaagtttc gctagcgtac 120
gtcagttttg acaacatgca gtgcaccggc acactcgtca gccccaccgc cgtgctcaca 180
gcacgacact gcctcaacgg cggcctcggc cacgtccgac tcggcgccga tcacttcacc 240
gccgtacgtg ccgtggcaca cccccaagca gaccttgccg tcctccacct cgatcgccca 300
gcgccaatag cgccatccgc aatctctgga cgtcacaccc aaccaggtaa ccgcttcgga 360
gttgccggct acggaagcac cttcaccggc atccccatgg cagcagctgc aaccatgcaa 420
cgccgcgtca ccgacgtccc cagccccgac cgccaagcag tcatgatcga aaaccacatc 480
agccaaggtg tactacgccc aggcgactct ggcggccccc tcctagaggg caatcacgtc 540
ataggagtac tcagcatgag cagtgcatcc ggccgcgtcg gctggtacat ccccaccgca 600
gaacacgccg actggatcgc ggcggcagcc ggaatccccg caccgggaag cgtcgacaag 660
cccgctccgc tcgtcgacgc cacagccttc ccgacgcaag agccaagcct cgctagccta 720
tcctcctag 729
<210> 37
<211> 1012
<212> DNA
<213> 白喉棒杆菌
<400> 37
ggatccgggc ttatcaccgc agaagacgcc gaaaaagcca tcgatgccac cctcctagcc 60
gtcgacggca tcacacgcca taacgacgac cccatggcat ggctcgccgc tatgggatac 120
ccactaacat gggcaaaaaa catcacgctt aaggaggccg aatgattacc gtctatcaca 180
acccccgctg ctccacctcg cgcaaagcct tggagtacat agaacaacac agcgacgacg 240
aggtgaccat catccgctac ctcgacgccc ctcctagtga acaagagctg cgcactttgc 300
ttgccgacgc ccacctcagc ccgcacgacg caatccgcac caaagaagcc gaatacaaag 360
aactcggact cagctccacc acccccgaat cagagctaat caaggccatg gtcacccacc 420
cacgcctcat tcagcgccca attgtggcaa catgcaaggg aacgcggatc gcccgaccaa 480
ccgaaattct gaaagaaatt ctctagccga atcgccagcg atctcggaag ccaaggaatc 540
cttcggcatg ttaaaaaatg taaaagttta atgcgggcac aaacgcgttg aaagagcaac 600
acaccaccat cgttgaacat acttgattat ttcccacttt ccagaatttt aatgagcatg 660
cccagctcga catcaagaac gcagggaaga tctcactagc aatcgacgat aggcccttct 720
tcgacaaccc ggaacatctt gccacgtacg acggaactac actggcagga tcgtcaatat 780
gtggtgaatt ccctgttaaa gtaggaagaa cagagggtgt cagtccgttt gtgtacgggg 840
actgacaccc tctgttcaaa tgattcatcg aagacggttt cacttttcta gcaaaacagc 900
aagacccgca agatttcata tattggtcaa gcgcagccac aaactatcac tcatagctat 960
gtagccccct attaattcat atctcaaaga gtatccaagc actttgggat cc 1012
<210> 38
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Met His His His His His His
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys
35 40 45
Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly
50 55 60
Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr
65 70 75 80
Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn
85 90 95
Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser
100 105 110
Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys
115 120 125
Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu
130 135 140
Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu
145 150 155 160
Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu
165 170 175
Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu
180 185 190
Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg
195 200 205
Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys
210 215 220
Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile
225 230 235 240
Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu
245 250 255
Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe
275 280 285
His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val
290 295 300
Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala
305 310 315 320
Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu
325 330 335
Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met
340 345 350
Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala
355 360 365
Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu
370 375 380
Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu
385 390 395 400
Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro
405 410 415
Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
420 425 430
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
435 440 445
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
450 455 460
Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
465 470 475 480
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
485 490 495
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
500 505 510
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
515 520 525
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
530 535 540
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
545 550 555
<210> 39
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile
35 40 45
Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys
50 55 60
Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val
65 70 75 80
Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val
85 90 95
Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala
100 105 110
Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met
115 120 125
Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala
130 135 140
Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val
145 150 155 160
Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu
165 170 175
Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr
180 185 190
Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val
195 200 205
Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp
210 215 220
Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys
225 230 235 240
Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala
245 250 255
Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu
260 265 270
Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly
275 280 285
Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser
290 295 300
Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu
305 310 315 320
Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His
325 330 335
Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met
340 345 350
Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val
370 375 380
His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His
385 390 395 400
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
405 410 415
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
435 440 445
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
450 455 460
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
465 470 475 480
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
485 490 495
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
500 505 510
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
515 520 525
Ile Ser Thr Leu Thr
530
<210> 40
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 41
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 41
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaatgca tcaccaccac caccacgaga acctgtactt ccagggcgct 120
gatgatgttg ctgattcttc taaatctttt gtgatggaaa acttttcttc gtaccacggg 180
actaaacctg gttatgtaga ttccattcaa aaaggtatac aaaagccaaa atctggtaca 240
caaggaaatt atgacgatga ttggaaaggg ttttatagta ccgacaataa atacgacgct 300
gcgggatact ctgtagataa tgaaaacccg ctctctggaa aagctggagg cgtggtcaaa 360
gtgacgtatc caggactgac gaaggttctc gcactaaaag tggataatgc cgaaactatt 420
aagaaagagt taggtttaag tctcactgaa ccgttgatgg agcaagtcgg aacggaagag 480
tttatcaaaa ggttcggtga tggtgcttcg cgtgtagtgc tcagccttcc cttcgctgag 540
gggagttcta gcgttgaata tattaataac tgggaacagg cgaaagcgtt aagcgtagaa 600
cttgagatta attttgaaac ccgtggaaaa cgtggccaag atgcgatgta tgagtatatg 660
gctcaagcct gtgcaggaaa tcgtgtcagg cgatcagtag gtagctcatt gtcatgcatc 720
aacctggatt gggatgttat ccgtgataaa actaaaacta agatcgaatc tctgaaagaa 780
cacggtccga tcaaaaacaa aatgagcgaa agcccgaaca aaactgtatc tgaagaaaaa 840
gctaaacagt acctggaaga attccaccag actgcactgg aacacccgga actgtctgaa 900
cttaagaccg ttactggtac caacccggta ttcgctggtg ctaactacgc tgcttgggca 960
gtaaacgttg ctcaggttat cgatagcgaa actgctgata acctggaaaa aactaccgcg 1020
gctctgtcta tcctgccggg tatcggtagc gtaatgggca tcgcagacgg cgccgttcac 1080
cacaacactg aagaaatcgt tgcacagtct atcgctctga gctctctgat ggttgctcag 1140
gccatcccgc tggtaggtga actggttgat atcggtttcg ctgcatacaa cttcgttgaa 1200
agcatcatca acctgttcca ggttgttcac aactcttaca accgcccggc ttactctccg 1260
ggtcacaaga cgcatgcacc tacttctagc tctaccaaga aaacccagct gcagctcgag 1320
cacctgctgc tggatttgca gatgatcctg aacggtatca acaattacaa gaacccgaaa 1380
ctgacgcgta tgctgacctt caagttctac atgccgaaga aggccaccga actgaaacac 1440
ctgcagtgtc tagaagaaga actgaaaccg ctggaggaag ttctgaacct ggctcagtct 1500
aaaaacttcc acctgcggcc gcgtgacctg atctctaaca tcaacgtaat cgttctggaa 1560
ctgaagggct ctgaaaccac cttcatgtgt gaatacgctg atgagaccgc aaccatcgta 1620
gaattcctga accgttggat caccttctgt cagtctatca tctctaccct gacctga 1677
<210> 42
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr His His His His His His
545 550
<210> 43
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr His His His His His His
515 520 525
<210> 44
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 44
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgacccacca tcaccatcat cactga 1656
<210> 45
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His His His
545 550 555 560
His
<210> 46
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His
515 520 525
His His His His His His His His
530 535
<210> 47
<211> 4679
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 47
ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg 60
gggcccggta ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca 120
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 180
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag 240
ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact 300
cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga 360
gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt 420
ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc 480
aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac 540
caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 600
attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 660
gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 720
aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 780
agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 840
aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 900
tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 960
aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 1020
atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 1080
ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 1140
cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 1200
tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 1260
ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 1320
taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 1380
actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat 1440
gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct 1500
cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag 1560
aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa 1620
gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac 1680
cccttaaacg tccggatagt caccgctctt ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt 1740
ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg 1800
gaaatactga tcgttcacca tttggctaat acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt 1860
tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg 1920
gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc 1980
tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt 2040
ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg 2100
catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata 2160
ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt 2220
cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag 2280
cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc 2340
gtctacgtcc tgggcgagtg ctttgaatgc ttgggcttct tcacggcggg tcttgaccgc 2400
gttgataagt tcgcggccag agctgaattg ctggcgtggg gtggggttga actggtcgtg 2460
tcctgccata tcccttacct gctttatcaa gtctccaagg cgcatcaccc ggttgtgctg 2520
cctataccaa cgataagcgg taggggcttt gcctgtgtag aacgggttgc ggctaaagcg 2580
gtgggaaaag tgcgggtcat ggtctaaaag ctcacccagc acacgcgtgg ttgctgcaag 2640
aagcttcatc tgcgcagatt taccgttacg gtcagcgtag acagggtcaa taagccatat 2700
gaactgggct ttgccgttag ttgggttaat acccacccag gctggcccga cgctatgagt 2760
aatcagtgag cgcaccacgt cgcggacgta cgggtttaag tctgcggggt caccgcctgc 2820
ggtacctact tggtcaacgt ctacgaccag gacggcggcg tactgcttgg tggtgagcat 2880
ggcgtactcg caccgtccta aagcatcagt ctcgaagcga tacatacgcg gcgagttcgt 2940
gccgtcagcg ttgcgtcgat aggccttttt aaagtctcgt gtgactgaac cgtggagtac 3000
atcgcggcct agatgatcgc gtaaaaggtc gcggtcactg gcagatgctg gggtgttgtc 3060
cagtccacca cggtcgcgct cgacgcgggt aggtgtttta gtgtgcgcat tctgcgcatg 3120
agtctgtaaa ctcatgaccg tgctttctcc caggtgtgtg ctgggtgata agcgaaagtc 3180
atcgggttgc cgcccggtgg ctttcttcgt ttttcattgt ctttccctga ctctaaatga 3240
caccggtgtt atttactagc catgacacgc gaaaaatatg ccttttacct gcggttacgt 3300
atggctagac atatggcaag ctatacgtaa ccgcgtttca gctgcacagg gctgtctgcg 3360
cagatttacc atcacgggac ttttcccagt tcaggctgcg catatttacg catacaacga 3420
aagcggttgc gcagatttac cacacactct gcgctgattt accgatacgc agaaaaagcg 3480
tgcgcagatt tacccatacg gtggcgaatt atccagagca ataggtatac agcaatacag 3540
taatacaggt gccataaacc tgtattactg tattgctgta tgcctgtaaa cctttattta 3600
ttgttgtgga cgtattcttc gaggtaggtg ctaacaatct cgcggatggt cacgcctttt 3660
tgggcggcga tgactttaag ttctgcgtga aggtcgcggt cgatttcaat cgtcatcttc 3720
ttgacgtagt cgcggcctgt gggttggtgg aatgcgcttc gcactgtttt cttctcggct 3780
gctggagtta gcttcgtggc ttttttcatt gaggttcgcg ggccttgctg cgccctggcg 3840
cgttctttac tggtgctcat ttcatcatct ccatgagttc gtcggcgacg tggtcgtagc 3900
cgtgcatgtc ggggcctggg cagtatccaa acgctaggtg catatcttcg cgtagcggga 3960
tttcggtttt aaagtgcggc atgtgttccg cgtcgagcgc ttctcgtgcc gcgtcaaggg 4020
cgctggtgcc tttcctggcg aacgtcagta agactgcatg aggtgttccg ttgactgcgt 4080
cgcgcagctc ccatactcgg gagaggtcgg cagcagcaga acgggtcgga agaatgatga 4140
agtcgctgac tgcgattgct gcttcgatag cgttctcgtc tcctggcggc acatcgatac 4200
cgactgggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 4260
tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 4320
aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 4380
ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 4440
ctacagggcg ctcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc 4500
gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt 4560
gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat 4620
acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgctct agaactagt 4679
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成9xHis标签
<400> 48
His His His His His His His His His
1 5

Claims (39)

1.一种DNA表达载体，其包含：
a.toxP；
b.阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；和
c.编码蛋白质的DNA序列，
其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的DNA区段的表达。
2.如权利要求1所述的DNA表达载体，其进一步包含编码信号肽的DNA序列。
3.如权利要求2所述的DNA表达载体，其中所述蛋白质连接于所述信号肽。
4.如权利要求1所述的DNA表达载体，其中所述突变toxO是SEQ ID NO:1。
5.如权利要求2所述的DNA表达载体，其中所述信号肽是SEQ ID NO:5。
6.如权利要求1所述的DNA表达载体，其中所述蛋白质选自由CRM 197、CRM 107或其组合组成的组。
7.如权利要求6所述的DNA表达载体，其中所述蛋白质选自SEQ ID NO:11、7至20中的任一者。
8.如权利要求1所述的DNA表达载体，其中所述蛋白质包含连接于受体结合蛋白或其功能性部分的白喉毒素或其功能性部分。
9.如权利要求8所述的DNA表达载体，其中所述受体结合蛋白选自包括以下的组：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、其功能性部分或其组合。
10.如权利要求8所述的DNA表达载体，其中所述蛋白质选自SEQ ID NO:12-15中的任一者。
11.一种DNA表达载体，其包含：
a.toxP；
b.阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；
c.编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质包含
i.信号序列；
ii.白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域，和
iii.靶标受体结合结构域，其选自包括以下的组：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、其功能性部分或其组合，
其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的所述DNA序列的表达。
12.如权利要求11所述的DNA表达载体，其中用所述DNA表达载体转化的细菌产生连接于信号肽的白喉毒素受体结合融合蛋白，其由所述信号肽引导至周质、培养基或这两个位置。
13.如权利要求12所述的DNA表达载体，其中所述细菌是大肠埃希氏菌，并且所述信号肽将所述白喉毒素受体结合融合蛋白引导至所述周质。
14.如权利要求12所述的DNA表达载体，其中所述细菌是白喉棒杆菌，并且所述信号肽将所述白喉毒素受体结合融合蛋白引导至所述培养基。
15.如权利要求11所述的DNA表达载体，其包含SEQ ID NO:3。
16.如权利要求12所述的DNA表达载体，其进一步包含编码可裂解蛋白质标签的DNA。
17.如权利要求12所述的DNA表达载体，其中所述可裂解蛋白质标签连接于所述白喉毒素受体结合融合蛋白。
18.如权利要求11所述的DNA载体，其中所述白喉毒素受体结合融合蛋白选自SEQ IDNo:12至15中的任一者。
19.一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a.用权利要求1-18的DNA表达载体转化细菌；
b.形成转化体；
c.在培养基中孵育所述转化体以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；和
d.从所述培养基纯化所述蛋白质。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌是白喉棒杆菌。
21.一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a.用DNA载体转化白喉棒杆菌菌株，所述DNA载体包含：
i.toxP；
ii.阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO；
iii.编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质包含：
a.信号肽；
b.白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域；和
c.靶标受体结合结构域，其选自包括以下的组：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、P物质、CD4、αMSH、GRP、TT片段C、GCSF、调蛋白β1、TNFα、TGFβ、其功能性部分或其组合，其中所述toxP和所述突变toxO调控编码所述蛋白质的所述DNA序列的表达；
b.形成转化体；
c.在培养基中孵育所述转化体以使所述蛋白质表达，并且其分泌至所述培养基中；和
d.从所述培养基纯化所述白喉毒素融合蛋白。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述白喉毒素受体融合蛋白选自SEQ ID NO:12至15中的任一者。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述白喉棒杆菌菌株是棒杆菌属C7β(-),tox(-)。
24.一种治疗患有结核病的患者的方法，其包括以下步骤：
a.制备如权利要求21中提供的白喉毒素融合蛋白；
b.向患有结核病的患者施用所述白喉毒素融合蛋白。
25.一种DNA表达载体，其包含突变toxO启动子。
26.一种白喉棒杆菌菌株，其含有如权利要求1至18所述的DNA表达载体。
27.一种制备蛋白质的方法，其包括以下步骤：
a.提供DNA表达载体，其包含toxP、阻断Fe介导的基因表达调控的突变toxO、信号序列和编码蛋白质的DNA序列；
b.用所述DNA载体转化细菌菌株以形成转化体；
c.在培养基中孵育所述转化体持续一段时期以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；和
d.从所述培养基纯化所述蛋白质。
28.一种融合蛋白，其选自SEQ ID NO:12-15中的任一者。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求28所述的融合蛋白。
30.一种药物组合物，其包含如权利要求28所述的融合蛋白和至少一种或多种其他化学治疗剂。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述其他化学治疗剂选自由以下组成的组：异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、特立齐酮、氨硫脲、环丝氨酸、缠霉素、对氨基水杨酸(PAS)、紫霉素、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、贝达喹啉、或迪拉马尼、利奈唑胺、特地唑胺、阿莫西林-克拉维酸、美罗培南、亚胺培南、克拉霉素或氯苯吩嗪。
32.如权利要求28所述的药物组合物，和至少一种或多种其他抗微生物剂。
33.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述抗微生物剂选自由以下组成的组：异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、特立齐酮、氨硫脲、环丝氨酸、缠霉素、对氨基水杨酸(PAS)、紫霉素、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、贝达喹啉、或迪拉马尼、利奈唑胺、特地唑胺、阿莫西林-克拉维酸、美罗培南、亚胺培南、克拉霉素或氯苯吩嗪。
34.一种治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自SEQ ID NO:12-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。
35.一种治疗或预防受试者的结核病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自SEQ ID NO:11-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。
36.一种原核细胞系，其包含如权利要求1-18中任一项所述的DNA表达载体。
37.一种试剂盒，其包括权利要求1至18中任一项所述的DNA表达载体。
38.一种tox P，其包含SEQ ID NO:2。
39.一种SEQ ID NO:12至15中的任一者的蛋白质。
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