CN109790524A

CN109790524A - 塔格糖-6-磷酸特异性新型耐热性磷酸酶和使用其制备塔格糖的方法

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Publication number: CN109790524A
Application number: CN201780052830.0A
Authority: CN
Inventors: 梁成才; 赵显国; 李英美; 金成俌; 赵成捘
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2037-06-30
Also published as: BR112018077358A2; JP6824298B2; EP3480304A4; WO2018004310A1; PL3480304T3; BR112018077358B1; RU2722208C1; KR20180004024A; CN109790524B; EP3480304A1; KR101981390B1; MX2019000082A; JP2019519238A; US20190203189A1; AU2017287766B2; AU2017287766A1; US10865395B2; EP3480304B1; ES2912103T3

Abstract

本申请涉及：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶；编码该塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的核酸；以及包含该核酸的转化体。此外，本申请涉及：用于生产塔格糖的组合物，其包含本申请的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶；以及通过使用本申请的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶制备塔格糖的方法。

Description

塔格糖-6-磷酸特异性新型耐热性磷酸酶和使用其制备塔格糖的方法

技术领域

本公开涉及塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶和使用其生产塔格糖的方法。

背景技术

已经报道了通过使用L-***糖异构酶从D-半乳糖生产D-塔格糖的方法和通过使用L-核酮糖-5-磷酸盐-4-差向异构酶从D-果糖生产塔格糖的方法作为使用常规单酶转化反应生产塔格糖的方法。然而，在这种单酶转化反应中，底物和产物之间存在一定水平的反应平衡(产物/底物＝约20％至50％)。因此，在使用单酶转化反应制备高纯度塔格糖的情况下，需要另外的从反应产物中分离和除去高浓度底物的纯化方法。

另一方面，对于使用多酶转化反应制备D-塔格糖的方法，已经报道了一种制备方法，其包括通过使用己糖激酶(EC 2.7.1.1)从三磷酸腺苷(ATP)和果糖制备D-果糖-6-磷酸盐，通过使用具有果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶活性的D-果糖-1,6-二磷酸盐-烯醇酶(EC4.1.2.13)将D-果糖-6-磷酸盐转化为D-塔格糖-6-磷酸盐，通过使用植酸酶作为磷酸酶从D-塔格糖-6-磷酸盐生产D-塔格糖(韩国专利号10-1627921和10-1620904)。然而，多酶反应需要昂贵的ATP作为磷酸盐供体，并且由于腺嘌呤核苷酸AMP、ADP和ATP的低物理化学(热、pH等)稳定性而在工艺应用中受到限制。此外，植酸酶由于其多种底物而诱导不可逆反应，因此在增加塔格糖的产量中具有限制。

发明内容

[技术问题]

本发明人进行了广泛的努力以开发一种在使用经济原料的同时以高产率生产塔格糖的方法。因此，当通过从作为经济原料的蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精转化为葡萄糖或葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐和果糖-6-磷酸盐来生产塔格糖-6-磷酸盐时，通过使用本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶进行塔格糖-6-磷酸盐去磷酸化作为不可逆反应途径，发现塔格糖能够通过一锅酶促转化生产，其中能够同时使用参与塔格糖生产途径的多种酶；并且能够显著增加塔格糖的转化率，从而完成本公开。

[技术方案]

本公开的目的是提供由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶。

本公开的另一个目的是提供编码本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的核酸。

本公开的又一个目的是提供包含编码本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的核酸的转化体。

本公开的又一个目的是提供用于生产塔格糖的组合物，其包含本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物的培养物。

本公开的又一个目的是提供使用本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶生产塔格糖的方法。

[有益效果]

由于本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶是热稳定的，它能够用于工业上生产塔格糖，通过利用不可逆的反应途径可以生产高浓度的塔格糖，并且能够通过使用作为经济原料的蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精作为原料用一锅酶促转化生产塔格糖。因此，由于能够简化制备高纯度塔格糖的方法，因此制备方法的优点在于它既简单又经济。

附图说明

图1示意性地显示了能够从淀粉(例如麦芽糖糊精)、蔗糖或葡萄糖生产塔格糖的反应途径，并显示其中参与的酶。

图2显示了通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)分析本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶(E：T6PP)的分子量的结果。“M”表示蛋白质大小标记，“CE”表示转化体破坏后的上清液。

图3是显示本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶从塔格糖-6-磷酸盐到塔格糖的转化活性的图。

图4是显示根据缓冲溶液和pH范围的本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的活性的图。

图5是显示根据温度的本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的活性的图。

图6是显示本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶在加入金属离子时的活性的图。

图7是显示本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶对塔格糖-6-磷酸盐的底物特异性的图。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其它解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开的限制。

为了实现本公开的目的，本公开的一个方面提供由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶。

本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多肽。例如，显而易见的是，具有某些序列的缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质落入本公开的范围内，只要其具有同源性并显示出与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质相对应的功效即可。

另外，只要蛋白质具有与本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶(其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成)相对应的功效，它不排除能够通过在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列而发生的突变、天然存在的突变或沉默突变。另外，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质也属于本公开的范围。

此外，塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶可以由SED ID NO：2的核苷酸序列编码，或者塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶可以由与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的核苷酸序列编码，但不限于此。基于密码子简并性，显然由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质或能够翻译成与上述蛋白质具有同源性的蛋白质的多核苷酸也可包括在本公开的范围内。

如本文所用，术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且同源性可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。同源序列可以通过例如标准软件，特别是BLAST2.0，其计算诸如得分，同一性，相似性等参数，或通过在限定的严格条件下比较Southern杂交实验中的序列来确定，并且限定合适的杂交条件在本领域技术范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法确定(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第二次编辑，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.，New York)。如本文所用，术语“严格条件”是指旨在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，这些条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook等人，同上)。

在本公开中，可以调整严格条件以确定同源性。为了证实多核苷酸之间的同源性，可以使用对应于55℃的T_m值的低严格性杂交条件。例如，可以使用5X SSC，0.1％SDS，0.25％乳和无甲酰胺；或者30％甲酰胺，5X SSC和0.5％SDS的条件。轻度严格的杂交条件对应于高T_m值；例如，可以使用40％甲酰胺和5X或6X SSC。高严格性的杂交条件对应于最高的T_m值；例如，可以使用50％甲酰胺和5X或6X SSC，但杂交条件不限于上述实例。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管碱基之间的错配可能取决于杂交的严格性。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括基本上相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体地，能够使用杂交条件检测具有同源性的多核苷酸，所述杂交条件包括T_m值为55℃的杂交步骤并使用上述条件。另外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此。本领域技术人员可以根据其目的适当地调整T_m值。

杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域熟知的。随着两个核苷酸之间的相似性或同源性变得更大，具有这种序列的多核苷酸的杂交体的T_m值变得更大。多核苷酸杂交的相对稳定性(对应于较高的T_m值)按以下顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。杂交体(其长度大于100个核苷酸)的T_m值的计算公式在本领域中公开(Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。为了与较短的多核苷酸(例如寡核苷酸)杂交，错配位置可能更重要，并且寡核苷酸的长度可决定其特异性(Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。

具体地，可以使用以下杂交条件检测多核苷酸：1)盐浓度低于500mM和温度为至少37℃的杂交步骤；和用2X SSPE在至少63℃的洗涤步骤；2)盐浓度低于200mM且温度为至少37℃的杂交步骤；或3)用2X SSPE在63℃的杂交和洗涤步骤两者。

杂交核酸的长度能够是例如至少约10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸或至少30个核苷酸。另外，本领域技术人员能够根据诸如探针长度的因素根据需要调节温度和洗涤液的盐浓度。

本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶可以是源自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)的酶，并且具体地可以是源自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的酶，但不限于此。

本公开的另一方面提供了编码本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的核酸。

本公开的又一方面提供了包含编码本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的核酸的转化体。

如本文所用，术语“转化”是指向宿主细胞中引入包含编码靶蛋白的核酸的载体的过程，从而使得能够在宿主细胞中表达由核酸编码的蛋白质。对于转化的核酸，其是否***宿主细胞的染色体并位于其中或位于染色体外是无关紧要的，只要它可以在宿主细胞中表达即可，并且两种情况都包括在内。另外，核酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。核酸可以以任何形式***，只要它可以被引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将核酸引入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可包括与核酸可操作地连接的启动子，转录终止信号，核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，核酸可以原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列，但核酸不限于此。

另外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动和介导编码本公开的靶蛋白的核酸的转录的启动子序列与上述基因序列之间的功能性连接。

用于转化载体的本公开的方法包括将核酸引入细胞的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适标准技术来进行。该方法的实例可包括电穿孔，磷酸钙(CaPO₄)沉淀，氯化钙(CaCl₂)沉淀，显微注射，聚乙二醇(PEG)技术，DEAE-葡聚糖技术，阳离子脂质体技术，乙酸锂-DMSO技术等，但不限于此。

作为宿主细胞，优选使用具有高效率导入DNA和高效率表达导入DNA的宿主。例如，它可以是大肠杆菌，但不限于此。

本公开的又一方面提供了用于生产塔格糖的组合物，其包含本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物的培养物。

用于生产塔格糖的组合物可以进一步包含参与本公开的塔格糖生产途径(参见图1)的酶，表达参与本公开的塔格糖生产途径的酶的微生物，或表达参与本公开的塔格糖生产途径的酶的微生物的培养物。然而，这只是一个实例；也就是说，对用于生产塔格糖的本公开组合物中含有的酶和用于生产塔格糖的底物没有限制，只要能够通过使用本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶生产塔格糖即可。

用于生产塔格糖的本公开组合物可进一步包含：(a)(i)淀粉，麦芽糖糊精，蔗糖或其组合，葡萄糖，葡萄糖-1-磷酸盐，葡萄糖-6-磷酸盐，果糖-6-磷酸盐，或塔格糖-6-磷酸盐；(ii)磷酸盐；(iii)果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和/或(vi)α-葡聚糖磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶，或α-淀粉酶，支链淀粉酶，异淀粉酶，葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何酶的微生物或该微生物的培养物，但不限于此。

本公开的淀粉/麦芽糖糊精磷酸化酶(EC2.4.1.1)和α-葡聚糖磷酸化酶可以包括任何蛋白质，只要这些蛋白质经历从磷酸盐到葡萄糖的磷酸转移，从而具有从淀粉或麦芽糖糊精生产葡萄糖-1-磷酸盐的活性即可。本公开的蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)可以包括任何蛋白质，只要蛋白质经历从磷酸盐到葡萄糖的磷酸转移，从而具有从蔗糖生产葡萄糖-1-磷酸盐的活性即可。本公开的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和异淀粉酶是用于淀粉糖化的酶，可以包括任何蛋白质，只要这些蛋白质具有将淀粉或麦芽糖糊精转化为葡萄糖的活性即可。本公开的蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可包括任何蛋白质，只要蛋白质具有将蔗糖转化为葡萄糖的活性即可。本公开的磷酸葡萄糖变位酶(EC 5.4.2.2)可包括任何蛋白质，只要蛋白质具有将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐的活性即可。葡萄糖激酶可以包括任何蛋白质，只要蛋白质能够将磷酸盐转移到葡萄糖，从而具有转化为葡萄糖-6-磷酸盐的活性即可。具体地，葡萄糖激酶可以是多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶，更具体地，可以是源自地球菌耐热酵母(Deinococcusgeothermalis)的多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ IDNO：7的核苷酸序列组成，或者可以是源自嗜热厌氧菌(Anaerolinea thermophila)的多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶，其由SEQ ID NO：6的氨基酸序列和SEQ ID NO：8的核苷酸序列组成。本公开的葡萄糖-6-磷酸盐异构酶可以包括任何蛋白质，只要蛋白质具有将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐的活性即可。本公开的果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶可以包括任何蛋白质，只要蛋白质具有将果糖-6-磷酸盐转化为塔格糖-6-磷酸盐的活性即可。

用于制备塔格糖的本公开组合物还可包含选自由Mg、Mn和Zn组成的组中的金属的离子或盐。具体地，本公开的金属盐可以是选自由MgCl₂、MgSO₄、MnCl₂、MnSO₄、ZnCl₂和ZnSO₄组成的组中的金属盐。

本公开的又一方面提供生产塔格糖的方法，包括通过使塔格糖-6-磷酸盐与本公开的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或表达塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物的培养物反应，以将塔格糖-6-磷酸盐转化为塔格糖。

本公开的制备方法还可以包括在将塔格糖-6-磷酸盐转化为塔格糖之前，通过使果糖-6-磷酸盐与果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶、表达果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶的微生物、或表达果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶的微生物的培养物反应，以将果糖-6-磷酸盐转化为塔格糖-6-磷酸盐。

另外，该制备方法还可以包括在将本公开的果糖-6-磷酸盐转化为塔格糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖-6-磷酸盐与葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、表达葡萄糖-6-磷酸盐异构酶的微生物或表达葡萄糖-6-磷酸盐异构酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐。

另外，该制备方法还可以包括在将本公开的葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖-1-磷酸盐与磷酸葡萄糖变位酶、表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物或表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

另外，该制备方法可以进一步包括在将本公开的葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖与葡萄糖激酶、表达葡萄糖激酶的微生物、或表达葡萄糖激酶的微生物的培养物和磷酸盐反应，以将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

另外，该制备方法还可包括在将本公开的葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐之前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与磷酸盐和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶；表达α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物；或表达α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖-1-磷酸盐。

另外，该制备方法还可以包括在将本公开的葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐之前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶；表达α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物；或表达α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖。

该制备方法可以进一步包括通过使葡萄糖与4-α-葡聚糖转移酶、表达4-α-葡聚糖转移酶的微生物、或表达4-α-葡聚糖转移酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糖糊精或蔗糖。

在制备方法中，“反应”可以在5.0至8.0的pH，60℃至90℃的温度和/或1分钟至24小时下进行。具体地，本公开的反应可以在6.0至8.0的pH，6.5至8.0的pH或6.5至7.5的pH下进行。另外，本公开的反应可以在60℃至90℃，70℃至90℃或75℃至85℃下进行。此外，本公开的反应可进行1分钟至12小时，1分钟至6小时，1分钟至3小时，1分钟至1小时，5分钟至24小时，5分钟至12小时，5分钟至6小时，5分钟至3小时，5分钟至1小时，10分钟至24小时，10分钟至12小时，10分钟至6小时，10分钟至3小时或10分钟至1小时。

另外，本公开的反应可以在选自由Mg、Mn和Zn组成的组中的金属的离子或盐的存在下进行。具体地，本公开的金属盐可以是选自由MgCl₂、MgSO₄、MnCl₂、MnSO₄、ZnCl₂和ZnSO₄组成的组中的金属盐。

本公开的又一方面提供一种生产塔格糖的方法，包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合和磷酸盐与(a)塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶；果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶；葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何酶的微生物或微生物的培养物反应。

[实施例]

在下文中，将结合示例性实施方式详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，不应解释为限制本公开的范围。

实施例1：含有塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶基因和转化微生物的重组表达载体的制备

为了发现新型热稳定性的D-塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶，从嗜热微生物新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)中分离基因，然后生产重组表达载体和转化的微生物。

具体地，基于在Genbank中登记的新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的基因序列，选择t6pp，其是预期编码塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的基因。此后，基于其氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)的信息，设计和合成正向引物(SEQ IDNO：3)和反向引物(SEQ ID NO：4)。使用新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)染色体DNA(基因组DNA)作为模板，用合成的引物进行聚合酶链式反应(PCR)。具体地，PCR在以下条件下进行总共25个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒和68℃下聚合2分钟。使用限制酶NdeI和XhoI将产物***pET21a(Novagen Inc.)，其是用于在大肠杆菌中表达的质粒载体，然后构建重组表达载体并命名为pET21a-CJ_tn_t6pp。通过常规转化方法(Sambrook等人，1989)将pET21a-CJ_tn_t6pp转化到大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)中以制备转化为包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的重组载体的微生物，并且这被命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp。

菌株大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp于2016年6月23日保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)，该中心是布达佩斯条约下的国际保藏机构，并获得登记号KCCM11850P。

实施例2：重组酶的制备

为了制备重组塔格糖磷酸酶(以下称为T6PP)，将大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp接种到含有5mL LB液体培养基的培养管中，然后在37℃下在振荡培养箱中开始种子培养，直至600nm处的吸光度达到2.0。将种子培养液接种到含有LB液体培养基的培养瓶中，并进行主培养。当600nm处的吸光度达到2.0时，加入1mM IPTG以诱导T6PP的表达/产生。种子培养和主培养在200rpm的搅拌速率和37℃的温度下进行。完成主培养后，将培养液在4℃以8000×g离心20分钟，然后回收细胞。将回收的细胞用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，悬浮在相同的缓冲液中，然后用超声波细胞破碎器破碎细胞。将细胞碎片在4℃以13000×g离心20分钟，然后仅获得上清液。使用His-标签亲和层析从上清液中纯化T6PP。

通过SDS-PAGE分析确认分子量，结果发现纯化的T6PP的分子量约为29kDa(在图2a中表示为“E”)。

实施例3：确认T6PP到塔格糖的转化活性

为了分析T6PP从塔格糖-6-磷酸盐到塔格糖的转化活性，将塔格糖-6-磷酸盐(50mM)悬浮于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，并向其中加入纯化的T6PP(0.1单位/mL)和MgCl₂(10mM)。此后，将产物在70℃下反应10分钟，然后用HPLC分析反应产物。使用HPX-87H柱(Bio-Rad，Inc.)进行HPLC分析，同时在60℃下在流动相中以0.6mL/min的流速流动5mM硫酸。通过折射率检测器检测塔格糖和塔格糖-6-磷酸盐。

结果发现塔格糖是由T6PP的反应产物产生的(图3)。

实施例4：确认根据pH、温度和添加金属离子的T6PP的活性

4-1.确认根据pH的活性

为了研究pH对T6PP的影响，将纯化的T6PP(0.1单位/mL)加入到悬浮于具有各种pH(pH4.0-7.0，柠檬酸钠；pH 4.0至7.0，乙酸钠；pH 6.0至8.0，磷酸钾：pH 7.0至9.0，Tris-HCl)的50mM缓冲液中的塔格糖-6-磷酸盐(50mM)中，然后在70℃反应10分钟。此后，在与实施例3相同的分析条件下通过HPLC定量分析塔格糖。

结果证实，T6PP在Tris-HCl缓冲液中显示出最大活性(特别是在pH7.0)，并且与最大活性相比，T6PP在非常宽的pH范围(5.0至8.0)显示其活性的80％或更高(图4)。

4-2.确认根据温度的活性

为了分析根据温度的T6PP的活性，将纯化的T6PP(0.1单位/mL)加入悬浮于50mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中的塔格糖-6-磷酸盐(50mM)中，然后在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下反应10分钟。此后，在与实施例3相同的分析条件下通过HPLC定量分析塔格糖。

结果证实，T6PP在70℃至90℃显示出高活性，特别是在80℃时显示出最大活性(图5)。

4-3.确认根据添加金属离子的活性

为了研究添加金属离子对T6PP活性的影响，将每种金属离子(例如NiSO₄，CuSO₄，MnSO₄，CaCl₂，ZnSO₄，MgCl₂，CoSO₄和APO)加入悬浮于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中的塔格糖-6-磷酸盐(50mM)中以使终浓度为0.5mM。为了除去金属离子，向其中加入通过用10mMEDTA处理透析的T6PP(0.1单位/mL)，然后将产物在70℃反应10分钟。此后，在与实施例3相同的分析条件下通过HPLC定量分析塔格糖。

结果证实，加入Mg离子后T6PP的活性最大增加，并且加入Mn和Zn离子后活性也增加(图6)。

实施例5：T6PP的底物特异性分析

为了确定T6PP是否对塔格糖-6-磷酸盐具有底物特异性，分析了T6PP对各种磷酸化糖类的活性。将葡萄糖-1-磷酸盐(50mM)、葡萄糖-6-磷酸盐(50mM)，果糖-6-磷酸盐(50mM)、塔格糖-6-磷酸盐(50mM)和塔格糖-6-磷酸盐(50mM)中的每一种用作底物。加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和纯化的T6PP(1单位/mL)，然后将产物在70℃反应1小时。此后，在与实施例3相同的分析条件下，通过HPLC定量分析糖类和磷酸化糖类中的每一种。

结果证实，T6PP仅对塔格糖-6-磷酸盐具有去磷酸化活性(图7)。

虽然已经参考特定的说明性实施方式描述了本公开，但是本公开所属领域的技术人员将理解，本公开可以以其它特定形式实施而不背离本公开的技术精神或者必要特征。因此，上述实施方式在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。此外，本公开的范围由所附权利要求而不是详细描述限定，并且应当理解，从本公开的含义和范围及其等同得出的所有修改或变化都包括在所附权利要求的范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 塔格糖-6-磷酸特异性新型耐热性磷酸酶和使用其制备塔格糖的方法

<130> OPA17110

<150> KR 10-2016-0082547

<151> 2016-06-30

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶

<400> 1

Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu

1 5 10 15

Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp

20 25 30

Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp

35 40 45

Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro

50 55 60

Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys

65 70 75 80

Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly

85 90 95

Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val

100 105 110

Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala

115 120 125

Glu Glu Asn Gly Gly Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Arg Val Ser

130 135 140

Gly Asn Thr Ser Leu Glu Glu Cys Val Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Val

145 150 155 160

Asp Phe Thr Gly Lys Phe Ile Glu Lys Met Glu Lys Lys Thr Arg Arg

165 170 175

Val Arg Ile Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asn Ala Cys Tyr Val Gly Ala

180 185 190

Gly Arg Val Asp Phe Phe Val Thr Trp Arg Ile Asn Pro Trp Asp Ile

195 200 205

Ala Ala Gly Leu Ile Val Val Lys Glu Ala Gly Gly Thr Val Thr Asp

210 215 220

Phe Ala Gly Lys Glu Ala Asn Val Phe Ser Lys Asn Phe Val Phe Ser

225 230 235 240

Asn Gly Leu Val His Glu Glu Val Leu Glu Val Val Asn Glu Val Leu

245 250 255

Lys Glu Ile Gly Glu Gly Lys

260

<210> 2

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶

<400> 2

atggagggag ggatcgaatt ggacagactg gacttttcga taaaactcct gagaagggtt 60

gggcactttc tcatgcttca ctggggaaag gtggacagtg tggagaaaaa gaccggtttc 120

aaagacatcg tgacggaaat agacaaaaag gcccaggaga tgatagtgga ggagatcaga 180

aaggtttttc cggatgagaa cataatagcg gaggagggaa tctcggagaa cggaaaaaaa 240

ctctggataa tagatcccat agacgggacg ataaacttcg ttcatggact tcccaacttt 300

tccatctcca tcgcttacgt ggagaatgga gaggtgaaga tgggagttgt gcacgctcct 360

gcactcaacg aaacactcta cgccgaagaa aacgggggtg cttttttgaa cggtgaaagg 420

atcagggtgt ctggaaacac aagtcttgaa gagtgcgtgg gatcaacggg aagctatgtg 480

gatttcaccg gaaagtttat cgagaagatg gaaaagaaaa caaggagagt gagaattctg 540

gggagtgcgg cgctgaacgc ctgctacgtg ggagcaggga gggtggattt cttcgtcact 600

tggaggatca atccgtggga catcgcagca ggcctgatag ttgtgaaaga ggcgggagga 660

acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720

aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780

gaggggaagt ga 792

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

catactcgag cttcccctct cctatct 27

<210> 5

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 5

Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr

1 5 10 15

Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu

35 40 45

Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys

50 55 60

Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val

65 70 75 80

Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe

100 105 110

Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala

115 120 125

Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly

130 135 140

Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu

165 170 175

Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu

180 185 190

Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr

195 200 205

Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly

210 215 220

Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr

225 230 235 240

Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile

245 250 255

Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp

260 265 270

<210> 6

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 6

Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala

20 25 30

Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val

35 40 45

Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg

50 55 60

Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr

65 70 75 80

Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu

85 90 95

Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp

100 105 110

Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys

115 120 125

Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu

130 135 140

Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu

145 150 155 160

Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln

165 170 175

Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His

180 185 190

Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly

195 200 205

Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu

210 215 220

Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val

225 230 235 240

Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala

245 250

<210> 7

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 7

atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60

agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120

gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180

gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240

ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300

aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360

accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420

ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480

tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540

cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600

tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660

tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720

acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780

atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813

<210> 8

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 8

atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60

gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120

gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180

tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240

gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300

tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360

tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420

gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480

attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540

acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600

tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660

tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720

ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762

Claims

1.一种塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

2.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶。

3.一种转化体，其包含根据权利要求2所述的核酸。

4.一种用于生产塔格糖的组合物，其包含：由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包含：

(a)(i)淀粉，麦芽糖糊精，蔗糖或其组合；(ii)磷酸盐；(iii)果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和(vi)α-葡聚糖磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，麦芽糖糊精磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶，α-淀粉酶，支链淀粉酶，异淀粉酶，葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或

(b)表达任何所述酶的微生物或所述微生物的培养物。

6.一种用于生产塔格糖的方法，其包括：通过使塔格糖-6-磷酸盐与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物反应，从而将塔格糖-6-磷酸盐转化为塔格糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述塔格糖-6-磷酸盐转化为塔格糖之前，通过使果糖-6-磷酸盐与果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶、表达所述果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物反应，从而将果糖-6-磷酸盐转化为塔格糖-6-磷酸盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述果糖-6-磷酸盐转化为塔格糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖-6-磷酸盐与葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、表达所述葡萄糖-6-磷酸盐异构酶的微生物或所述微生物的培养物反应，从而将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖-1-磷酸盐与磷酸葡萄糖变位酶、表达所述磷酸葡萄糖变位酶的微生物或所述微生物的培养物反应，从而将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐之前，通过使葡萄糖与葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物、和磷酸盐反应，从而将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐之前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与磷酸盐和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶；表达所述α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物；或所述微生物的培养物反应，从而将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖-1-磷酸盐。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐之前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶；表达所述α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物；或所述微生物的培养物反应，从而将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖。

13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中，所述反应在5.0至8.0的pH、60℃至90℃的温度和/或1分钟至24小时下进行。

14.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中，所述反应在选自由Mg、Mn和Zn组成的组中的金属的离子或盐的存在下进行。

15.一种用于生产塔格糖的方法，其包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合和磷酸盐与(a)根据权利要求1所述的塔格糖-6-磷酸盐磷酸酶；果糖-6-磷酸盐-4-差向异构酶；葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何所述酶的微生物或所述微生物的培养物反应。