CN109781894B - 一种利非司特r异构体的检测方法 - Google Patents
一种利非司特r异构体的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种利非司特R异构体的检测方法，它是采用正相色谱法检测，其操作步骤如下：(1)配置溶液；(2)检测；(3)分析色谱图。本发明提供的一种利非司特R异构体的检测方法，通过选择特定的色谱条件，能简单、快速、准确地分离、检测出利非司特及R异构体杂质，从而保证了利非司特及其制剂的质量可控。对合成工艺的开发起到指导了作用，有助于对原料药的质量标准制订。
Description
技术领域
本发明涉及一种利非司特R异构体的检测方法，属于医药技术领域。
背景技术
利非司特(lifitegrast)由爱尔兰夏尔开发公司(Shire Dev Llc)研发,是新型的小分子整合素(integrin)抑制药,能拮抗淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),阻断与其同源配体细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的相互作用.干扰引起干眼病的角膜与结膜组织的ICAM-1过度表达.2015年4月9日向美国食品药品管理局(FDA)提出新药申请,并获得优先审查资格.在补充临床试验的有效性和安全性数据后,于2016年7月11日获得FDA批准上市,是首个治疗干眼症症状和体征的药物。
利非司特的化学结构式如下所示：
利非司特是手性化学药物，起药效作用的为S型，其R型异构体作为杂质在药学研究中严格控制。由于药物中的R异构体含量在药物质量中有着严格的限度规定，尤其是对原料药来说，此项目的规定更为严格。所以，对利非司特R异构体的定量检测不仅对合成工艺的开发起到指导作用，对原料药的质量标准制订更是必不可少的。
利非司特R异构体化学结构式如下所示：
需建立一种易操作的关于利非司特R异构体的检验方法，以便更好地促进该药物的研发，确保产品质量。
发明内容
为了更好地指导和促进对利非司特原料药的研究开发以及质量标准的制定，本发明的目的在于：提供一种检测利非司特R异构体的分析方法，有效用于利非司特合成工艺的研究开发和质量分析。
本发明提供了一种利非司特R异构体的检测方法，它是采用正相色谱法检测，其操作步骤如下：
(1)配置溶液
a、称取利非司特样品，加流动相溶解，作为A溶液；
b、称取利非司特R异构体对照品，加流动相溶解，作为B溶液；
c、将A、B溶液混合，加流动相稀释，摇匀，作为***适用性溶液；
d、取A溶液，用流动相稀释，作为供试品溶液；
e、取B溶液，用流动相稀释，作为对照品溶液；
(2)检测
分别取对照品溶液、***适用性溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相；流动相：正己烷(A)-异丙醇(B)-乙醇(C)-三氟乙酸(D)，流动相比例：A:B:C:D＝60-90：5-30：5-30：0-0.5；
(3)分析色谱图
进一步地，步骤a所述A溶液每1ml含利非司特样品1-3mg，优选2.5mg。
进一步地，步骤b所述B溶液每1ml含利非司特R异构体1-3mg，优选 2.5mg。
进一步地，步骤c所述***适用性溶液中A溶液、B溶液和流动相比例为1：1：10。
进一步地，步骤d所述供试品溶液中利非司特浓度为0.2～1.0mg/ml，优选为0.5mg/mL。
进一步地，步骤e所述对照品溶液中利非司特R异构体浓度为0.5mg/mL。
进一地，步骤2)所述注入液相色谱仪的溶液体积为10μl；和/或，流动相比例A:B:C:D＝75：15：15：0.1；和/或，所述色谱条件中波长为200～260nm，柱温为20～40℃，流动相流速为0.5～1.5ml/min。
更进一步地，所述波长为220nm，柱温为30℃，流动相流速为0.8ml/min。
进一步地，步骤3)所述色谱图中，根据对照品溶液色谱图确定利非司特 R异构体色谱峰保留时间，根据***适用性溶液色谱图确定利非司特主峰与利非司特R异构体色谱峰的分离度；根据供试品溶液色谱图计算利非司特样品中利非司特R异构体的含量。
进一步地，所述***适用性溶液色谱图中利非司特主峰与利非司特R异构体色谱峰的分离度大于2。
本发明中所述“利非司特”是指S型利非司特。
本发明中所述“利非司特R异构体”以及“R异构体”都是指R型利非司特。
本发明提供的一种利非司特R异构体的检测方法，通过选择特定的色谱条件，能简单、快速、准确地分离、检测出利非司特及R异构体杂质，从而保证了利非司特及其制剂的质量可控。对合成工艺的开发起到指导了作用，有助于对原料药的质量标准制订。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1***适用性溶液的HPLC图谱
图2为实施例1供试品溶液的HPLC图谱
图3为实施例2***适用性溶液的HPLC图谱
图4为实施例2供试品溶液的HPLC图谱
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料通过购买市售产品获得。
1)材料
利非司特R异构体杂质对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号 20160819)
利非司特原料(成都惟邦药业有限公司提供，批号20170601,20170602)
2)主要仪器
高效液相色谱仪LC-20AT日本岛津
CHIRALPAK IA色谱柱 4.6×250mm日本大赛璐
实施例1本发明测定利非司特R异构体含量
1、高效液相色谱法主要技术参数
a、高效液相色谱仪；
b、以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯) 为固定相的手性色谱柱；
c、流动相:正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1，流速为 0.8ml/min；
d、检测波长为220nm，柱温30℃。
2、测定法
(1)配置溶液
a、精密称取利非司特(批号20170601，成都惟邦药业有限公司提供) 24.98mg置于10ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为A溶液。
b、精密称取利非司特R异构体25.36mg置于10ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度作为B溶液。
c、***适用性溶液：各取上述A溶液1ml和B溶液1ml置于10ml容量中，用流动相稀释至刻度线，摇匀，即得***适用性溶液。
d、供试品溶液：取A溶液2ml于10ml量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。
e、取B溶液，以流动相稀释，得到对照品溶液，其中对照品溶液中R 异构体的浓度为0.5mg/mL。
(2)高效液相色谱法
a、分别取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得利非司特峰与其R异构体峰的出峰位置。
b、取本品***适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1 和表1所示。
表1***适用性溶液的HPLC分离情况数据
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 面积％ | 分离度 |
| 1 | 13.33 | 2096410 | 49.663 | 0.00 |
| 2 | 16.233 | 2124821 | 50.337 | 3.07 |
结论：利非司特峰与其R异构体峰的分离度为3.07，符合要求。
c、取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图2和表2 所示。供试品溶液的色谱图中，如有R异构体峰，按面积归一法计算含量。
表2供试品溶液的HPLC图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 面积％ |
| 1 | 16.343 | 4096212 | 100.000 |
(3)利非司特R异构体含量的计算
测定结果为：利非司特原料(批号20170601)中，利非司特R异构体含量为未检出。
实施例2高效液相色谱法测定利非司特R异构体含量
1、高效液相色谱法主要技术参数
a、高效液相色谱仪；
b、以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯) 为固定相的手性色谱柱；
c、流动相:正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1，流速为 0.8ml/min；
d、检测波长为220nm，柱温20℃。
2、测定法
(1)配制溶液
a、精密称取利非司特(批号20170602，成都惟邦药业有限公司提供) 24.18mg置于10ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为A溶液。
b、精密称取利非司特R异构体25.41mg置于10ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度作为B溶液。
c、***适用性溶液：各取上述A溶液1ml和B溶液1ml置于10ml容量中，用流动相稀释至刻度线，摇匀，即得***适用性溶液。
d、供试品溶液：取A溶液2ml于10ml量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。
e、取B溶液，以流动相稀释，得到对照品溶液，其中对照品溶液中R 异构体的浓度为0.5mg/mL。
(2)高效液相色谱法
a、分别取C溶液和D溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得利非司特峰与其R异构体峰的出峰位置。
b、取本品***适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3 和表3所示。
表3***适用性溶液的HPLC分离情况数据
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 面积％ | 分离度 |
| 1 | 13.322 | 2083610 | 49.275 | 0.00 |
| 2 | 16.289 | 2144923 | 50.725 | 3.22 |
结论：利非司特峰与R异构体峰的分离度为3.22，符合要求。
c、分别量取对照溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4和表4所示。供试品溶液的色谱图中，如有R异构体峰，按面积归一法计算含量。
表4供试品溶液的HPLC图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 面积％ |
| 1 | 16.323 | 4078306 | 100.000 |
(3)利非司特R异构体含量的计算
利非司特原料(批号20170602)中，利非司特R异构体含量为未检出。
以下用实验例的方式说明本发明的方法学验证结果：
实验例1***适用性考察
溶液配制：精密称取利非司特原料(批号20170602)和利非司特R异构体对照品适量，以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1) 配制成每ml含利非司特原料0.2520mg、利非司特R异构体0.2429mg的***适用性溶液，为供试品溶液。
取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，进样6次，考察保留时间和峰面积的相对标准偏差，结果见表5。
表5***适用性溶液测试结果汇总
结论：供试品溶液连续进样6次，峰面积的RSD不大于2％，保留时间的RSD不大于1.0％，符合中国药典2015年版规定的方法学验证标准，表明***适用性良好。
实验例2专属性实验
精密称取5.82mg、5.46mg、5.29mg的利非司特原料(批号20170601)3 份，分别加入1M盐酸、1M氢氧化钠、2％双氧水各2ml，放置6小时，将酸碱样品中和后与氧化样品一起以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1)稀释浓度至0.5mg/ml，作为A、B、C供试品溶液；另精密称取利非司特原料(批号20170601)10.64mg，置于100℃高温试验箱中6小时，以流动相稀释浓度至0.5mg/ml，作为D供试品溶液。
取供试品溶液A、B、C、D各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算分离度。结果为：
主峰与各相邻峰之间的分离度均>2.0(药典标准不低于1.5)，分离度良好。
实验例3检测限和定量限
检测限和定量限测定结果见表6。
精密称取利非司特R异构体(批号20160819)，以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1)溶解，配制成10μg/ml的母液，逐级稀释，进行检测限和定量限确定试验。
表6检测限和定量限测定结果
结论：换算成绝对值，检测限为0.3ng，定量限为1ng，能够满足测定要求。
实验例4线性与范围
溶液的配制：精密称取利非司特R异构体(批号20160819)6份，以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1)稀释，配制成浓度分别为0.9960μg/ml、1.494μg/ml、1.992μg/ml、2.490μg/ml、2.998μg/ml、 3.984μg/ml的1～6号供试品溶液。
精密量取1-6号供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，每个编号溶液进样3次，考察峰面积的相对标准偏差，结果见表7。
表7线性与范围测定结果
结论：线性范围为0.1028-5.1400μg/ml,符合中国药典验证方案要求(LOQ 至不低于150％指标浓度)，在此范围内线性方程为Y＝7427X-108，线性回归系数R2为0.9994，符合要求(R2>0.9990)；
Y轴截距在100％浓度响应值的25％以内(108<3999*0.25＝999.75)；响应因子的RSD值为5.40％，符合要求(RSD≤10％)；证实了良好线性关系。
实验例5精密度实验
溶液的配制：精密称取利非司特R异构体(批号20160819)6份，以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1)稀释，配制成浓度分别为0.5012μg/ml、0.5007μg/ml、0.4993μg/ml、0.5021μg/ml、0.5019μg/ml、 0.4996μg/ml的1～6号供试品溶液。
精密量取1-6号供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，考察峰面积的相对标准偏差，结果见表8。
表8精密度测定结果
结论：6份供试液含量的RSD值为2.72％，符合要求(RSD<10％)。
实验例6回收率
溶液的配制：精密称取利非司特R异构体(批号20160819)3份，以流动相(正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸＝75：15：15：0.1)稀释，配制成浓度分别为1.225μg/ml、2.4499μg/ml、3.6749μg/ml的1～3号供试品溶液，每个供试品溶液取10μl，注入液相色谱仪，每种溶液进样3次，计算回收率，结果见表9。
表9回收率测定结果
结论：回收率在97.3％-100.1％之间，符合验证要求(80％-120％)；回收率的RSD值为1.6％，符合验证要求(≤10％)；证实了该方法具有良好的回收率。
实验例7耐用性
考察不同柱温、流动相比例、不同批次色谱柱对利非司特异构体测定的影响，具体变动参数见表10。
供试品溶液配制：精密称取利非司特R异构体(批号20160819)5.18mg，置于100ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度；精密量取1ml该溶液置于100ml 容量瓶中，以流动相稀释至刻度，为供试品溶液。
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算回收率。
表10色谱变动参数
表11 不同条件对测定的影响
结论：经试验，采用不同柱温进行考察，峰面积和回收率基本一致。结果显示柱温在30～40℃范围内变化时，耐用性良好。
经试验，采用不同流动相比例进行考察，峰面积和回收率基本一致。结果显示流动相比例在±5％围内变化时，耐用性良好。
在色谱条件微调的情况下杂质的量几乎无变化，回收率为 98.2％-105.6％，符合要求(80.0％-120.0％)，证明了该方法耐用性较好。
综上，本发明提供了一种高效液相色谱法测定利非司特R异构体含量的方法，经方法学验证，结果符合要求，通过选择特定的色谱条件，能简单、快速、准确地分离、检测出利非司特及其R异构体杂质，从而保证了利非司特原料药及其制剂的质量可控性。对合成工艺的开发起到指导作用，有助于对原料药的质量标准制订。
Claims (11)
1.一种利非司特R异构体的检测方法，其特征在于：它是采用正相色谱法检测，其操作步骤如下：
(1)配置溶液
a、称取利非司特样品，加流动相溶解，作为A溶液；
b、称取利非司特R异构体对照品，加流动相溶解，作为B溶液；
c、将A、B溶液混合，加流动相稀释，摇匀，作为***适用性溶液；
d、取A溶液，用流动相稀释，作为供试品溶液；
e、取B溶液，用流动相稀释，作为对照品溶液；
(2)检测
分别取对照品溶液、***适用性溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相；流动相：正己烷(A)-异丙醇(B)-乙醇(C)-三氟乙酸(D)，流动相比例：A:B:C:D＝75：15：15：0.1；
(3)分析色谱图；
步骤2)所述注入液相色谱仪的溶液体积为10μl；和/或，所述色谱条件中波长为200～260nm，柱温为20～40℃，流动相流速为0.5～1.5ml/min；
步骤d所述供试品溶液中利非司特样品浓度为0.2～1.0mg/ml。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a所述A溶液每1ml含利非司特样品1-3mg。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a所述A溶液每1ml含利非司特样品2.5mg。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b所述B溶液每1ml含利非司特R异构体1-3mg。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b所述B溶液每1ml含利非司特R异构体2.5mg。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c所述***适用性溶液中A溶液、B溶液和流动相比例为1：1：10。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤d所述供试品溶液中利非司特样品浓度为0.5mg/mL。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤e所述对照品溶液中R异构体浓度为0.5mg/mL。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述波长为220nm，柱温为30℃，流动相流速为0.8ml/min。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱图中，根据对照品溶液色谱图确定利非司特R异构体色谱峰保留时间，根据***适用性溶液色谱图确定利非司特主峰与利非司特R异构体色谱峰的分离度；根据供试品溶液色谱图计算利非司特中利非司特R异构体的含量。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述***适用性溶液色谱图中利非司特主峰与利非司特R异构体色谱峰的分离度大于2。
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