CN109777785A - 杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物工程技术领域的杂交瘤细胞株及其应用。杂交瘤细胞株3H3 1D2的物保藏编号为CGMCC No.16697、杂交瘤细胞株5E10 1C6的物保藏编号为CGMCC No.16698。本发明还公开了杂交瘤细胞株3H3 1D2和杂交瘤细胞株5E10 1C6所产生的单克隆抗体。所述单克隆抗体间接ELISA效价分别为1:1025000和1:1280000，抗体亚型均为IgG2b，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry1C蛋白及转基因水稻中的内源Cry1C蛋白，为实现抗虫蛋白Cry1C在转基因水稻中的定性、定量检测奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry1C蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。
转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因水稻或者其衍生物中Cry1C蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到抗Cry1C蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)，其分泌的单克隆抗体为实现抗虫蛋白Cry1C在转基因水稻中的定性、定量检测奠定基础。
本发明提供的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)的生物保藏编号为CGMCC No.16697，所述Cry1C单抗杂交瘤细胞株 (PA1-1707016/5E10 1C6)的生物保藏编号为CGMCC No.16698。
上述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
a)通过原核表达得到Cry1C重组蛋白；
b)免疫动物：将Cry1C重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
上述制备方法在另一种实施方式中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:(5-10)。
本发明还提供了所述Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2) 所产生的单克隆抗体、Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体。
上述单克隆抗体在另一种实施方式中，Cry1C单抗杂交瘤细胞株 (PA1-1707016/3H3 1D2)以及Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体的类型均为IgG2b。
上述单克隆抗体在另一种实施方式中，Cry1C单抗杂交瘤细胞株 (PA1-1707016/3H3 1D2)以及Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价分别为为1: 1025000和1:1280000。
本发明还提供了上述单克隆抗体的制备方法，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
本发明还提供了上述单克隆抗体在检测Cry1C抗虫蛋白中的应用。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA法检测Cry1C抗虫蛋白的试剂中的应用。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA双抗体夹心法检测Cry1C 抗虫蛋白的试剂中的应用。
本发明提供的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和Cry1C 单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)，已依次于2018年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCC No.16697 和CGMCC No.16698。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度抗虫蛋白Cry1C作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株分泌抗Cry1C的特异、灵敏单抗的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)以及Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:1025000和 1:1280000，抗体亚型均为IgG2b，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry1C蛋白及转基因水稻中的内源Cry1C蛋白，分泌抗Cry1C抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因水稻中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
附图说明
图1是本发明的Cry1C重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图。
图2是本发明的Cry1C重组蛋白单抗筛选western结果图。
图3是本发明的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和 Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)纯化的单克隆抗体的 SDS-PAGE电泳结果图。
图4是本发明的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)所产生的单克隆抗体滴度图。
图5是本发明的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体滴度图。
图6是本发明的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)所产生的单克隆抗体特异性检测Cry1C重组蛋白和转基因水稻中的Cry1C Western 结果图。
图7是本发明的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体特异性检测Cry1C重组蛋白和转基因水稻中的Cry1C Western结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫抗原的制备
1.1重组蛋白Cry1C表达菌株构建、菌体培养及裂解
Cry1C编码基因扩增：以转基因水稻T1C-19基因组DNA为模板， Cry1C-NdeI-F:catatggaggagaacaatcagaac和Cry1C-XhoI-R: ctcgagctacttttgtgctctttc为引物，用高保真Fastpfu进行PCR扩增，扩增到的PCR 产物经(1.0％)琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将目的条带切胶回收，用Universal DNA纯化回收试剂盒(天根)回收，回收产物经限制性内切酶Nde I和Xho I 酶切、经胶回收与进行同样酶切、胶回收处理的pET28a质粒片段于4℃过夜连接，转化Trans10感受态细胞(北京全式金)，挑取克隆，进行菌落PCR 鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因公司进行测序。
将鉴定正确的重组表达载体pET28a-Cry1C转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50％的甘油溶液等体积混匀，于 -80℃冻藏。
将保存的重组蛋白Cry1C表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素 (50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体LB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中37℃过夜培养。第二天以1％接种量接种，于37℃培养至OD600为0.8左右，加入1mM IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导结束将菌液冰浴，于4℃，4000rpm，10min离心收集菌体，弃上清，菌体经PBS洗涤后用裂解液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCl，5％Glycerol和20mM 咪唑)悬浮；超声破碎(2s on/4s off，Amp：45％，Time：3min)；4℃15000rpm 离心1hr，收集上清。
1.2重组蛋白纯化
菌体裂解液上清与经裂解液平衡的Ni Sepharose 6FF Beads(GE Healthcare)混合，于4℃结合2-3hrs，3000rpm离心3min弃上清；已结合蛋白的Ni Sepharose 6FF beads经清洗液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCL， 5％Glycerol和50mM咪唑)洗2-3次；再用洗脱液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCL，5％Glycerol和200mM咪唑)洗脱。收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。
将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液(50mM Tris pH7.5， 300mMNaCL，5％Glycerol)，并用经相同溶液平衡的Superdex 200Increase 10/30GL(GEHealthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组分并经SDS-PAGE检测蛋白样品的纯度，通过图1可得，经过凝胶过滤最后获得电泳纯的Cry1C蛋白，分子量约为70kDa。
2.免疫动物
步骤1.2质控合格的Cry1C重组蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF级 BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号： SCXK(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫， 2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000 后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：
表1免疫次数及免疫剂量
免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3.细胞融合
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)， 50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。
4.细胞建株
1)融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在 ELISA质控合格(即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。
2)亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3)细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting 验证其稳定性，通过图2可知，Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry1C，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的2株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2) 和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)，已依次于2018年 11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏编号依次为CGMCC No.16697和CGMCCNo.16698。
4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA(OD450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做 western-blotting的鉴定，通过图3可知，Cry1C单抗杂交瘤细胞株 (PA1-1707016/3H3 1D2)和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry1C。
5备腹水
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株 3H3 1D2和杂交瘤细胞株5E10 1C6接种到两只小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/mL时， 800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡) 体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
6抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
1)缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mM甘氨酸盐酸。
2)准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCL。
3)样品准备：经50％SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过。
4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7-8mL、洗脱缓冲液6-7mL、起始缓冲液5mL洗涤，每管1mL收集洗脱液。
5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度，详见图3，通过图4可知，Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2) 和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55kDa和30kDa)。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和效价测定
将纯化好的单抗与sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b， IgG3，IgM抗体进行ELISA检测，检测结果表明：单抗类型为IgG2b，以重组蛋白Cry1C为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图4可知，经ELISA测定，纯化得到的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2) 单抗滴度为1:1025000；通过图5可知，经ELISA测定，纯化得到的Cry1C 单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)单抗滴度为1:1280000。
表2 Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
| Cry1C单抗杂交瘤细胞株编号 | 抗体(IgG)浓度 | 抗体亚型 |
| PA1-1707016/3H3 1D2 | 4.0mg/mL | IgG2b |
表3 Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
| Cry1C单抗杂交瘤细胞株编号 | 抗体(IgG)浓度 | 抗体亚型 |
| PA1-1707016/5E10 1C6 | 10.0mg/mL | IgG2b |
8.单克隆抗体特异性检测
分别提取转基因水稻及其其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗(Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6))作为一抗，Alexa FlurorTM 680goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740imager(9120, Li-COR Biosciences,Lincolin,NE)红外扫描仪western检测结果，通过图6可知，纯化得到的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)单抗能特异识别内源样本中的Cry1C和重组蛋白Cry1C；通过图7可知，纯化得到的 Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)单抗能特异识别内源样本中的Cry1C和重组蛋白Cry1C。
其中，转基因水稻蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1mL(按样品量，一般0.5g加1-2mL)蛋白提取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm 4℃离心15min，取上清)，蛋白提取液配方见表4：
表4蛋白提取液配方
| 成分 | 用量 |
| 1M Tris,pH 7.5 | 500uL |
| 1M NaCL | 1.5mL |
| 0.5M EDTA | 20uL |
| 50％glycerol | 2mL |
| 10％SDS | 1mL |
| 双蒸水(DDH<sub>2</sub>O) | 配成10mL |
| 蛋白酶抑制剂(Roche) | 用时添加一片 |
| 1mM PMSF(苯甲基磺酰氟,Sigma) | 用时添加50uL |
本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，生物保藏编号为CGMCC No.16697的杂交瘤细胞株3H31D2、生物保藏编号为CGMCC No.16698的杂交瘤细胞株5E10 1C6。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)通过原核表达得到Cry1C重组蛋白；
b)免疫动物：将Cry1C重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
3.根据权利要求2所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述小鼠脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:(5-10)。
4.权利要求1所述杂交瘤细胞株3H3 1D2所产生的单克隆抗体、杂交瘤细胞株5E10 1C6所产生的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的类型均为IgG2b。
6.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株3H3 1D2以及杂交瘤细胞株5E10 1C6所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价分别为1:1025000和1:1280000。
7.权利要求4所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
8.权利要求4所述单克隆抗体在检测Cry1C抗虫蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述单克隆抗体在检测Cry1C抗虫蛋白中的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在制备ELISA法检测Cry1C抗虫蛋白的试剂中的应用。
10.根据权利要求8所述单克隆抗体在检测Cry1C抗虫蛋白中的应用，其特征在于，所述隆抗体在制备ELISA双抗体夹心法检测Cry1C抗虫蛋白的试剂中的应用。
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