CN109777775A - 一种循环肿瘤细胞分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种循环肿瘤细胞分离方法，包括如下步骤：1)取血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，进行密度梯度离心分离；2)将隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；3)在第二离心管中加入CD45和CD15混合磁珠，将含目的细胞溶液转入第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；4)将孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，离心，去除上清液，得纯化的循环肿瘤细胞。本发明采用密度梯度离心和免疫磁珠阴性富集相结合的方法从外周血中分离得到肿瘤细胞，分离周期短，且需要的样品量少，实现了对肿瘤细胞的高度富集，肿瘤细胞回收率高达70％以上，白细胞残留量低于1万个。
Description
技术领域
本发明属于循环肿瘤细胞分离技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞分离方法，主要适用于分离人或者动物血液中的循环肿瘤细胞，去除红细胞、白细胞，得到高纯度的肿瘤细胞。
背景技术
循环肿瘤细胞(CircμLating Tumor Cell，CTC)是外周血中各种肿瘤细胞的统称，其来源于原发肿瘤或者转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵过组织基质进入血管的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞比较稀有，一般比血液细胞和正常组织细胞体积大，细胞核大，不规则，细胞核质比高，不易发生变形。肿瘤细胞在进入外周血的过程中会发生上皮-间质转变(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)，因此，CTC包括上皮细胞表型、***表型和上皮细胞-***混合表型。CTC除了存在不同的类型，还会以不同的形态存在于外周血中，包括游离的单个细胞和聚集成团的细胞团(CircμLating Tumor Microemboli，CTM)。
1869年，澳大利亚医生Ashoworth首次在晚期癌症病人血样中发现CTCs。CTC在外周血中含量极少，每10mL血液中可能仅含有几个到几十个CTC，但是同时约含有5×1011个红细胞、1×108个白细胞和4×109个血小板。由于受当时技术条件和实验仪器限制，很难将CTCs从血液中分离出来进行研究。直到1998年，Racila等首次利用免疫学富集技术和流式细胞技术从乳腺癌病人血样中分离并鉴定了CTCs，此后，多种CTCs分离检测方法相继被开发出来。CTCs的分离方法主要分为非特异性方法和特异性方法，前者主要是根据肿瘤细胞大小、密度、电荷等物理性质，后者则主要是利用肿瘤细胞表面标记物及肿瘤细胞本身的生物学特征进行富集。非特异性富集方法主要包括密度梯度离心、过滤法、其他如红细胞裂解法。由于肿瘤细胞的高度异质性，非特异性分离方法大多存在灵敏度低、损失大、重复性差等缺点。特异性富集方法主要有免疫磁珠分选，其关键是选择合适的肿瘤特异性的抗原。免疫磁珠分选又分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法是通过磁珠偶联相应的抗体与CTCs表面的抗原结合，直接分离出CTCs。阴性富集法则通过磁珠偶联相应抗体与白细胞表面抗原相结合后去除白细胞，以到达富集CTCs的效果。
CellSearch***是第一个被美国食品和药品管理局(FDA)批准上市用于CTCs检测的产品，其采用免疫磁珠阳性富集法和免疫细胞荧光染色技术相结合检测上皮来源的CTC，主要用于晚期乳腺癌、结直肠癌和***癌患者的CTCs检测，这三种肿瘤患者的CTCs检出率较高(50-70％)，但是对于其他癌症如肺癌的检出率则明显偏低(30％)。CellSearch***是用来检测上皮来源的CTC，然而并非所有的肿瘤细胞都来源于上皮细胞，而且上皮肿瘤也可能会丧失上皮标志物，炎症也可能导致血液中存在上皮细胞；此外，CellSearch***只能捕获并记录CTC数量，不能对CTC进行后续的分子生物学分析，如基因测序、蛋白表达、药物敏感性检测等。因此，CellSearch***并不是一种理想的CTC富集检测方法。其他CTC富集方法如AdnaTest、微流技术、CTC-ichip等方法也存在和CellSearch***类似的不足。随着科学技术的发展，CTC下游的检测方法越来越丰富，如荧光原位杂交(Fish)、数字PCR(ddPCR)、单细胞测序、细胞培养等等。因此，如何分离出高质量的CTC成为关键。
发明内容
本发明的目的是克服现有循环肿瘤细胞分离周期长、分离纯度不高、需要依赖于肿瘤细胞表面特殊标记进行分离的问题。
为此，本发明提供了一种循环肿瘤细胞分离方法，包括如下步骤：
1)取新鲜外周血血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，进行密度梯度离心分离；
2)将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；
3)在第二离心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再将步骤2)中的含目的细胞的溶液加入至第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；
4)将步骤3)中经过孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，第三离心管进行离心，去除上清液，即得纯化的循环肿瘤细胞。
进一步的，所述新鲜外周血血液样本置于2～8℃环境保存。
进一步的，所述多孔隔膜离心管为15mL离心管中加装孔径0.5～0.8mm之间的多孔树脂隔膜，将离心管分隔成上下两部分，下半部分可容纳3mL液体。
进一步的，所述细胞密度梯度离心液为Percoll分层液和生理盐水配制而成的密度为1.0500～1.0700g/mL溶液。
进一步的，所述步骤1)具体过程：在底部装有细胞密度梯度离心液的多孔隔膜离心管中加入4ml新鲜外周血血液样本与1ml的PBS溶液进行密度梯度离心，且密度梯度离心条件为4℃，1200g，离心25min。
进一步的，所述步骤2)中将密度梯度离心后隔膜上层溶液取出置于第一离心管后，向多孔隔膜离心管中加入PBS溶液清洗多孔隔膜管的管壁和隔膜上层，并将PBS洗涤液并入第一离心管中混合，再对第一离心管内溶液进行离心，离心条件为4℃，200g，离心15min。
进一步的，所述步骤3)中含有CD45和CD15混合磁珠的制备过程：取1.5mL的第二离心管，加入1mL磁珠孵育缓冲液，分别取10μL的CD45beads和5μL的CD15beads至第二离心管中，混匀，将第二离心管放置到磁力架上，静置2min，去掉液体，保留磁珠，再加入50μL磁珠孵育缓冲液重悬磁珠即可。
进一步的，所述步骤4)中含目的细胞的上清液转移至第三离心管后，取磁珠孵育缓冲液重悬磁珠，放置于磁力架上静置2min，将液体并入第三离心管中，再对第三离心管进行离心，离心条件为20℃，200g，离心15min。
本发明的基本原理：循环肿瘤细胞与红细胞、白细胞、血小板等血液成分的存在密度差异和离心速度差异，利用多孔隔膜分离管、密度梯度离心液和离心，可以将红细胞、部分白细胞和血小板与肿瘤细胞进行分离，得到初步纯化的肿瘤细胞。CD45广泛存在于白细胞表面，是白细胞共同抗原，而CD45在髓细胞中表达较弱，CD45磁珠对髓细胞的去除作用较差，CD15磁珠能够有效去除表达CD15的髓细胞；因而采用含CD45抗体的磁珠和CD15抗体的磁珠对初步纯化的肿瘤细胞进行阴性富集，进一步弃除白细胞包括髓细胞，得到纯度较高的循环肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用密度梯度离心和免疫磁珠阴性富集相结合的方法仅需要90分钟，便能够从4mL人或者动物外周血中分离得到肿瘤细胞，分离周期短，且需要的样品量少，实现了对肿瘤细胞的高度富集，肿瘤细胞回收率高达70％以上，白细胞残留量低于1万个。
(2)本发明提供的这种循环肿瘤细胞分离方法得到的细胞为活细胞，可直接进行其下游检测分析，如PCR、FISH、免疫荧光、细胞培养等。
(3)本发明提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用带多孔隔膜的离心管对样本进行密度梯度分离，降低了操作难度，不仅能够有效的防止细胞密度梯度离心液与血液样本预混、离心后隔膜以下的液体污染隔膜以上液体，而且能够去除部分白细胞，降低了后期去除白细胞的费用。
(4)本发明提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用Percoll分层液和生理盐水配制细胞密度梯度离心液，具有等渗、不穿透生物膜、无毒、粘度低、不引起细胞聚集等优点，能够较好的将红细胞、白细胞、肿瘤细胞、血浆分层，最大程度的降低非目的细胞的干扰，便于目的细胞的获取。
(5)本发明提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用CD45和CD15混合磁珠进行阴性富集，能更有效的去除血液中的白细胞包括髓细胞，进一步降低非目的细胞残留量，提高肿细胞回收纯度，大大降低后期肿瘤细胞识别难度，尤其针对荧光定量PCR检测效果较明显，避免了单一CD45在髓细胞中表达较弱，CD45磁珠对髓细胞的去除作用较差的问题。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明循环肿瘤细胞分离方法的技术流程图；
图2是本发明中血液样本经过多孔隔膜离心管分离图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
实施例1：
如图1和图2所示，本实施例提供了一种循环肿瘤细胞分离方法，具体过程如下：
(1)采集4mL新鲜的外周血，加至EDTA K2/K3抗凝管中，采集后立即轻柔颠倒混匀5次，置于2～8℃环境保存；之后向4mL的血液样本中加入1mL的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)，轻柔颠倒混匀5次，转移至多孔隔膜离心管的隔膜上层，进行密度梯度离心分离，离心条件：4℃，1200g，离心25min。
其中，多孔隔膜离心管为15mL离心管中加装孔径0.5～0.8mm之间的多孔树脂隔膜，将离心管分隔成上下两部分，下部分可容纳3mL液体。该多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，细胞密度梯度离心液为Percoll分层液和生理盐水配制而成的密度为1.0500～1.0700g/mL溶液。通过该多孔隔膜离心管对样本进行密度梯度分离，降低了操作难度，不仅能够有效的防止细胞密度梯度离心液与样本预混、离心后隔膜以下的液体污染隔膜以上液体，而且能够去除部分白细胞，降低了后期去除白细胞的费用；而且该多孔隔膜离心管中所采用的细胞密度梯度离心液由Percoll和生理盐水配制，具有等渗、不穿透生物膜、无毒、粘度低、不引起细胞聚集等优点，Percoll主要由表面包被聚乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒组成，颗粒大小不等，在离心过程中自发形成密度梯度，将不同密度的细胞分离，从而能够较好的将红细胞、白细胞、肿瘤细胞、血浆分层，最大程度的降低非目的细胞的干扰，便于目的细胞的获取。
(2)离心完成后，如图2所示，将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于15mL离心管中待用。而为了提高目的细胞的收率，优化的，可向多孔隔膜离心管中加入1mL PBS溶液，清洗其管壁和隔膜上层2～3次，取出PBS洗涤液于上述15mL离心管中，与含有目的细胞的溶液混合。然后对15mL离心管中含目的细胞的溶液离心，离心条件：4℃，200g，离心15min，去除上清液，得含目的细胞的30μL左右溶液。
(3)取1.5mL离心管，加入1mL磁珠孵育缓冲液，再分别取10μL的CD45磁珠和5μL的CD15磁珠至该1.5mL离心管中，与加入的磁珠孵育缓冲液混匀，将该1.5mL离心管放置到磁力架上，静置2min，去掉液体，保留磁珠，再向磁珠中加入50μL磁珠孵育缓冲液重悬磁珠，即得到CD45和CD15混合磁珠。然后，将上述步骤(2)得到的含目的细胞的溶液中加入150μL磁珠孵育缓冲液重悬，并将其转移至得到的CD45和CD15混合磁珠中，得到混合液，优化的，取150μL磁珠孵育缓冲液清洗重悬含目的细胞的管子，并入混合液中；再将混合液在2～8℃温和震荡孵育30min，混合磁珠不能沉降至管壁。
其中，CD45磁珠为磁珠表面包被CD45抗体，能够与白细胞表面的CD45抗原结合，通过负向富集能够去除表达CD45的白细胞，而CD45在髓细胞中表达较弱，CD45磁珠对髓细胞的去除作用较差；CD15磁珠为磁珠表面包被CD15抗体，能够与白细胞表面的CD15抗原结合，通过负向富集能够去除表达CD15的白细胞，CD15磁珠能够有效去除表达CD15的髓细胞。本实施例中采用CD45和CD15混合磁珠能够进一步降低非目的细胞残留量，提高肿细胞回收纯度，大大降低后期肿瘤细胞识别难度，尤其针对荧光定量PCR检测效果较明显。
(4)将上述混合液的离心管放置于磁力架上，静置2min，将含目的细胞的上清液转移至新的1.5mL无菌离心管中，并取400μL磁珠孵育缓冲液重悬混合磁珠，放置于磁力架上，静置2min，液体并入含目的细胞的1.5mL无菌离心管中，丢弃磁珠。然后将该含目的细胞的1.5mL无菌离心管离心，离心条件：20℃，200g，离心15min，动作轻柔，去除上清液，剩余20μL左右的目的细胞，即为纯化的循环肿瘤细胞。
实施例2：
本实施例是在健康人外周血中掺入一定数量的GFP标记的肿瘤细胞(H1975-GFP)，作为模拟样本进行肿瘤细胞分离，最后通过显微镜镜检计数H1975-GFP细胞和白细胞数目，以此来评价肿瘤细胞分离技术的肿瘤细胞回收效率和白细胞残留量。具体详述如下：
(1)样本的制备
将1mL H1975-GFP细胞(105个/mL)接种至T25细胞培养瓶中，加入4mL生长培养基培养过夜；第二天消化细胞，制备单细胞悬液，并使用血球计数板计数。采用PBS将细胞进行梯度稀释至1个/μL，向4mL新鲜的EDTA抗凝外周血中加入100μL的H1975-GFP细胞(1个/μL)，设置6组重复，分别标记为1～6。
(2)样本分离
样本分离步骤采用实施例1中循环肿瘤细胞分离步骤(1)～(4)。
(3)样本检测
取1～3组纯化的肿瘤细胞，采用荧光显微镜计数H1975-GFP细胞数目，即回收的肿瘤细胞数目；取4～6组纯化后的肿瘤细胞，分别采用血球计数板计数，并计算白细胞残留量，检测结果如表1和表2所示。
表1：肿瘤细胞回收效率
表2：白细胞残留量
由表1和表2可知，采用本发明的循环肿瘤细胞分离实现了对肿瘤细胞的高度富集，肿瘤细胞回收率高达70％以上，白细胞残留量低于1万个。
实施例3：
本实施例是在健康人外周血中掺入20个肿瘤细胞(H1975-GFP)，作为模拟样本进行肿瘤细胞分离，最后通过荧光定量PCR检测EGFR T790M突变(H1975-GFP细胞为EGFRT790M突变细胞株，正常血液细胞不含有此突变)，以此来评价只使用一种磁珠(CD45磁珠)与使用两种磁珠(CD45磁珠和CD15磁珠)的效果差异。具体详述如下：
(1)样本的制备
将1mL H1975-GFP细胞(105个/mL)接种至T25细胞培养瓶中，加入4mL生长培养基培养过夜；第二天消化细胞，制备单细胞悬液，并使用血球计数板计数。采用PBS将细胞进行梯度稀释至1个/μL。向4mL新鲜的EDTA抗凝外周血中加入20μL H1975-GFP细胞(1个/μL)，设置6组，分别标记为1～6。
(2)样本的分离
样本分离步骤与实施例1中循环肿瘤细胞分离步骤大致相同，不同之处在于步骤(3)中取6个1.5mL离心管，标记1～6，分别加入1mL磁珠孵育缓冲液，再分别取10μL的CD45磁珠至1～3号离心管中，取10μL的CD45磁珠和5μL的CD15磁珠至4～6号离心管中，与加入的磁珠孵育缓冲液混匀，将该6个离心管放置到磁力架上，静置2min，去掉液体，保留磁珠，再向磁珠中加入50μL磁珠孵育缓冲液重悬磁珠。
(3)样本的检测
取上述1～6组纯化的肿瘤细胞，采用QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit，按照说明书操作，分别提取基因组DNA。采用人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(武汉海吉力生物科技有限公司)试剂盒检测EGFR T790M突变，检测结果如表3所示。
表3：EGFR T790M突变检测结果
| 编号 | FAM 0.12 | ROX 0.12 | ΔCt |
| 1 | 18.0 | 10.9 | 7.1 |
| 2 | 21.3 | 10.2 | 11.2 |
| 3 | 21.9 | 10.2 | 11.6 |
| 4 | 17.9 | 11.9 | 6.1 |
| 5 | 17.9 | 11.1 | 6.8 |
| 6 | 19.6 | 11.2 | 8.4 |
由表3可看出，4～6号内控信号(ROX)CT值明显比1～3号内控信号(ROX)CT值大，由此表明4～6号细胞残留量更少；而4～6号突变信号(FAM)CT值比1～3号突变信号(FAM)CT值小，则表明4～6号突变更容易被检测，即同时采用CD45磁珠和CD15磁珠比只采用CD45磁珠去白细胞效果更好，基因突变更容易被检测。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)取新鲜外周血血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，进行密度梯度离心分离；
2)将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；
3)在第二离心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再将步骤2)中的含目的细胞的溶液加入至第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；
4)将步骤3)中经过孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，第三离心管进行离心，去除上清液，即得纯化的循环肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述新鲜外周血血液样本置于2～8℃环境保存。
3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述多孔隔膜离心管为15mL离心管中加装孔径0.5～0.8mm之间的多孔树脂隔膜，将离心管分隔成上下两部分，下半部分可容纳3mL液体。
4.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述细胞密度梯度离心液为Percoll分层液和生理盐水配制而成的密度为1.0500～1.0700g/mL溶液。
5.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述步骤1)具体过程：在底部装有细胞密度梯度离心液的多孔隔膜离心管中加入4ml新鲜外周血血液样本与1ml的PBS溶液进行密度梯度离心，且密度梯度离心条件为4℃，1200g，离心25min。
6.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述步骤2)中将密度梯度离心后隔膜上层溶液取出置于第一离心管后，向多孔隔膜离心管中加入PBS溶液清洗多孔隔膜管的管壁和隔膜上层，并将PBS洗涤液并入第一离心管中混合，再对第一离心管内溶液进行离心，离心条件为4℃，200g，离心15min。
7.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述步骤3)中含有CD45和CD15混合磁珠的制备过程：取1.5mL的第二离心管，加入1mL磁珠孵育缓冲液，分别取10μL的CD45beads和5μL的CD15beads至第二离心管中，混匀，将第二离心管放置到磁力架上，静置2min，去掉液体，保留磁珠，再加入50μL磁珠孵育缓冲液重悬磁珠即可。
8.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述步骤4)中含目的细胞的上清液转移至第三离心管后，取磁珠孵育缓冲液重悬磁珠，放置于磁力架上静置2min，将液体并入第三离心管中，再对第三离心管进行离心，离心条件为20℃，200g，离心15min。
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