CN111088222B - 一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法。本发明将中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse六种酶组合，对脂肪组织进行酶解用于制备单细胞悬液。该方法步骤简单，获得的细胞数量多，细胞活率高，其中，活细胞总数为9.13×10⁵～1.12×10⁷cell/g脂肪组织，细胞活率为80～88％，细胞数量和细胞活率均明显优于对比方法。同时，实验表明，本发明制备的单细胞悬液适用于10xGenomics单细胞转录组测序，同时也可以用于组织细胞原代培养以及细胞分析。

Description

一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法。

背景技术

随着高通量测序技术的迅猛发展和普及，走在生命科学前沿的研究者们几乎都在谈论Single-Cell Sequencing对于整个生命科学研究的意义以及价值。单细胞转录组测序一个非常重要的研究方向就是单细胞分辨率下重新定义细胞类型，挖掘得到新的细胞亚群和marker基因。

基于10x Genomics平台最新的Chromium Single Cell 3'***，可快速进行单细胞的标记、测序和分析，高效获得多达10000个细胞的单细胞水平数字化基因表达谱，实现对复杂细胞群体深入分析，完美攻克了测序样本稀少、细胞异质性等难题，而到广泛应用。单细胞测序的主要应用领域为人类医学、神经生物学、遗传生殖、干细胞等研究领域，涉及到的主要样品类型十分广泛，但根据其来源，可分为如下几个大类：1)肿瘤组织，如脑肿瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌等；2)实体组织来源的原代分离细胞，如脂肪细胞、脑神经元、肠道组织来源的上皮及干性细胞等；3)血液来源的某些细胞亚群(一般可以通过不同biomarker进行FACS分选)，如通过5色标记的造血干细胞群体；4)干细胞诱导分化/重编程相关的细胞样品。

脂肪组织是机体内的能量储库，也是人和动物机体非常重要的内分泌器官，脂肪代谢是生命体基本的能量代谢方式。脂肪细胞的分化和增殖失常可引起脂肪组织过多堆积，容易导致肥胖、胰岛素抵抗的发生。脂肪干细胞拥有识别损伤部位、免疫调节和损伤修复的功能,拥有广阔的临床研究及应用前景。脂肪细胞的发育涉及脂肪细胞干细胞(ASCs)的增殖和分化，并与宿主免疫细胞发生密切的相互作用。不同部位发育机制不同，而过去的研究手段无法分析脂肪基质细胞的异质性。研究人员利用单细胞转录组测序技术，鉴别基质细胞的类型并探究脂肪干细胞的分化轨迹，聚类结果发现脂肪干细胞群可以被聚为八个亚细胞群，包括四个脂肪干细胞亚群，表明脂肪干细胞存在异质性。研究人员还对小鼠皮下脂肪基质血管部分(stromal vascular fraction，SVF)脂肪干细胞和前体细胞不同亚群进行了分析，鉴定到了一个不仅不能分化成脂肪细胞、还可以在体内/体外以旁分泌形式抑制脂肪细胞生成的细胞亚群，命名为脂肪生成调节细胞(Adipogenesis regulates cells，Aregs)。这项研究指出了Aregs的潜在关键作用：调节脂肪组织的可塑性，提高控制肥胖和胰岛素耐受的能力，从而治疗包括2型糖尿病在内的代谢疾病。

10xGenomics单细胞转录组测序是建立在GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序的目的。选择合适的单细胞制备方法，获得最佳的脂肪组织的单细胞悬液，确保细胞活率达到80％以上，细胞损失少，悬液干净无碎片，是事关本技术成败的第一要素！

虽然目前对于脂肪组织原代细胞分离方法比较成熟，但是目前用于单细胞测序的脂肪组织单细胞分离方法研究尚有欠缺，在细胞得率、细胞活率、细胞碎片与红细胞残留方面有待新的方法来提高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，使得获得的单细胞悬液细胞活率高，数量多，状态好。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，包括：

步骤1：取脂肪组织，以复合酶解液酶解；

步骤2：将所述酶解后的产物过滤，离心，取细胞沉淀清洗后加红细胞裂解液裂解；

步骤3：将所述裂解后的产物离心，取细胞沉淀清洗、重悬，获得单细胞悬液；

所述复合酶解液含有中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse。

本发明采用由中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse组成的复合酶对脂肪组织进行酶解用于制备单细胞悬液，实验表明，本发明制备的单细胞悬液中，细胞数量多、活率高，状态好，可用于10xGenomics单细胞转录组测序。

本发明步骤1中，进行所述酶解之前先对脂肪组织进行预处理，所述预处理具体为将脂肪组织用DMEM培养基漂洗三次，去除组织中血管及表面膜结构，然后剪切成1-3mm³大小的组织块。

本发明步骤1中，所述复合酶中，胶原蛋白酶I的工作浓度为200-400u/mL或1.0～2.0mg/mL；胶原蛋白酶II的工作浓度为100-200u/mL或0.5～1.0mg/mL；胶原蛋白酶IV的工作浓度为50-200u/mL或0.25～1.0mg/mL；中性蛋白酶的工作浓度为0.25～0.5mg/mL；胰蛋白酶的工作浓度为0.25～0.5mg/mL；DNAse的工作浓度为5-20u/mL或0.01～0.02mg/mL。

一些具体实施方案中，所述复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的工作浓度依次为1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.25mg/ml、0.25mg/ml、0.01mg/ml，即质量比为100:50:25:25：25:1。

本发明步骤1中，所述复合酶解液的溶媒为基础培养基或酶缓冲液。

一些实施方案中，复合酶解液由所述复合酶和酶缓冲液组成；优选地，复合酶的浓度为0.5～5mg/ml。一些具体实施方案中，复合酶解液由所述复合酶和PBS缓冲液组成，复合酶解液中复合酶的浓度为4.52mg/ml。

一些实施方案中，复合酶解液由所述复合酶和基础培养基组成；优选地，复合酶解液中复合酶的浓度为0.5～5mg/ml，更优选为2.26mg/ml。

一些实施方案中，步骤1中所述脂肪组织与复合酶解液的体积比为1:5～10。

一些实施方案中，步骤1中，所述酶解的温度为35～38℃，酶解的时间为20-40min；所述酶解用含血清的完全培养基终止。

一些实施方案中，步骤2中，所述过滤为70μm细胞筛子过滤；所述离心为300g～400g离心5min；所述清洗为取细胞沉淀以DMEM培养液重悬，使用Percoll非连续密度梯度离心液3000g离心10-20min，去除细胞碎片及上清，再以PBS缓冲液重悬细胞，500g离心5min，弃上清。其中，Percoll非连续密度梯度离心液的密度优选为1.19-1.31mg/ml。

本发明步骤3将裂解后的产物离心，取细胞沉淀清洗、重悬，获得单细胞悬液；其中，所述离心为300g～400g离心5min；所述清洗为取细胞沉淀以PBS缓冲液重悬，150-200g离心5min，去除残余红细胞裂解液及碎片，收集底部细胞。

其中，所述重悬以含0.5％BSA的PBS缓冲液重悬，所述重悬的次数为两次，所述两次重悬之间还包括以40μm细胞筛子过滤的步骤。

一些具体实施方案中，步骤3具体为：将裂解产物300g～400g离心5min；去除上清，取细胞沉淀用PBS缓冲液进行清洗，清洗步骤为：加入PBS缓冲液重悬细胞，150-200g离心5min，去除残余红细胞裂解液及碎片。将清洗后的细胞以含0.5％BSA的PBS缓冲液重悬，使用40μm细胞筛子过滤，然后用PBS缓冲液(0.5％的BSA)重悬细胞，获得单细胞重悬液。

本发明采用由中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse六种酶组成的复合酶对脂肪组织进行酶解，用于制备单细胞悬液，该方法步骤简单，获得的细胞数量多，活细胞总数为1.0⁶～1.12×10⁷cell，细胞活率高，细胞活率为78～88％，细胞数量和细胞活率均明显优于对比方法。同时，实验表明，本发明制备的单细胞悬液适用于10xGenomics单细胞转录组测序，同时也可以用于组织细胞原代培养以及细胞分析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示单细胞悬液的细胞活率，其中，图1A为实施例1制备的单细胞悬液，图1B为对比例1制备的单细胞悬液，图1C为对比例2制备的单细胞悬液；

图2示脂肪组织单细胞标记与文库构建示意图；

图3示脂肪组织单细胞文库质检示意图，其中图3A为利用实施例1单细胞悬液建立的cDNA文库的分析结果，图3B为标准DNA文库的分析结果；

图4示脂肪组织单细胞文库测序数据分析示意图，其中，图4A为数据测序QC结果，图4B～4C是单细胞数据Cell Ranger分析结果。

具体实施方式

本发明公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脂肪组织的单细胞悬液的制备

复合酶解液的制备：由复合酶和基础培养基配制而成，复合酶的浓度约为2.26mg/ml，其中，复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的质量比为100:50:25:25:25:1(1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.25mg/ml、0.25mg/ml、0.01mg/ml)。

(1)脂肪组织的获得、预处理：脂肪组织取自专业的医院或者美容院的脂肪组织废弃物。取脂肪组织组织用DMEM培养基漂洗三次，去除组织中血管及表面膜结构，称取1g组织，使用剪刀或者手术刀片把组织剪/切成1mm³大小；

(2)加入脂肪组织体积的5-6倍的复合酶解液进行消化处理，结合美天旎单细胞制备仪，解离20-30min；

(3)加入5ml含血清完全培养基终止，70μm细胞筛子过滤，300g～400g离心5min，此时细胞悬液分3层：油脂、消化液及沉淀；

(4)小心去除油脂层和消化液层，获得细胞，使用2ml DMEM重悬细胞；

(5)显微镜下进行观察，关注红细胞、碎片数量，细胞计数(自动细胞计数仪)；

(6)300g～400g离心5min获得细胞沉淀，使用1-2ml PBS重悬细胞后，按照1:2的比例加入2-4ml密度梯度离心液轻轻混匀，再加入3-4ml PBS覆盖，进行密度梯度离心去除细胞碎片，15ml离心管，3000g，10-20min，碎片在界面处，细胞在底部，碎片会残留在上面；

(7)去除碎片及上清，用PBS重悬，500g(2000rpm)离心5min，去上清；

(8)加入1x红细胞裂解液进行红细胞去除，避光处理2-3min,300～400g离心5min；

(9)去除上清，加入PBS重悬细胞，150-200g离心5min，去除残余红细胞裂解液及碎片；

(10)PBS缓冲液(0.5％的BSA)重悬细胞，使用40μm细胞筛子过滤；

(11)PBS缓冲液(0.5％的BSA)重悬细胞，获得单细胞重悬液。

实施例2脂肪组织的单细胞悬液的制备

复合酶解液的制备：由复合酶和PBS配制而成，复合酶的浓度约为4.52mg/ml，其中，复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的质量比为100:50:25:25：25:1(2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.02mg/ml)。

(1)脂肪组织的获得、预处理：脂肪组织取自专业的医院或者美容院的脂肪组织废弃物。取脂肪组织组织用DMEM培养基漂洗三次，去除组织中血管及表面膜结构，称取1.5g组织，使用剪刀或者手术刀片把组织剪/切成1mm³大小；

(2)加入脂肪组织体积的6倍的复合酶解液进行消化处理，结合美天旎单细胞制备仪，解离30min；

(3)加入5ml含血清完全培养基终止，70μm细胞筛子过滤，300g～400g离心5min，此时细胞悬液分3层：油脂、消化液及沉淀；

(4)小心去除油脂层和消化液层，获得细胞，使用2ml DMEM重悬细胞；

(5)显微镜下进行观察，关注红细胞、碎片数量，细胞计数(自动细胞计数仪)；

(6)1-1.5ml PBS重悬细胞后，按照1:2的比例加入2-3ml密度梯度离心液轻轻混匀，再加入2-3ml PBS覆盖，进行密度梯度离心去除细胞碎片，15ml离心管，3000g，10-20min，碎片在界面处，细胞在底部，碎片会残留在上面；

(7)去除碎片及上清，用PBS重悬，500g(2000rpm)离心5min，去上清；

(8)加入1x红细胞裂解液进行红细胞去除，避光处理2-3min,300g～400离心5min；

(9)去除上清，加入PBS重悬细胞，150-200g离心5min，去除残余红细胞裂解液及碎片；

(10)PBS缓冲液(0.5％的BSA)重悬细胞，使用40μm细胞筛子过滤；

(11)PBS缓冲液(0.5％的BSA)重悬细胞，获得单细胞重悬液。

实施例3

复合酶解液的制备：由复合酶和DMEM配制而成，复合酶的浓度约为4.52mg/ml，其中，复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的质量比为100:50:25:25:25:1(2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.02mg/ml)。

其他条件与实施例1相同。

对比例1～4

对比例1：采用国产某试剂盒制备单细胞悬液；

对比例2：采用德国品牌美天妮试剂盒-脂肪组织解离试剂盒制备单细胞悬液(产品货号：130-105-808)

对比例3：复合酶解液的制备：由复合酶和DMEM配制而成，复合酶的浓度约为3.52mg/ml，其中，复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ和DNAse的质量比为100:50:25:1(2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.02mg/ml)。其他条件与实施例1相同。

对比例4：复合酶解液的制备：由复合酶和DMEM配制而成，复合酶的浓度约为3.52mg/ml，其中，复合酶中，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胰蛋白酶和DNAse的质量比为100:50:25:1(2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.02mg/ml)。其他条件与实施例1相同。

对比例1～4采用的脂肪组织与实施例1来源相同，取材方法相同。

实施例4

对实施例1～3及对比例1～4的单细胞悬液进行台盼蓝染色以及显微镜观察、细胞计数与活力检测，统计每1g脂肪组织获得的细胞数量，其不同方法细胞数量与活率检测结果见表1～2和图1。其中，样品1～3分别来自于三份不同的脂肪组织。

表1细胞活率比较

表2细胞数量比较

由表1～表2结果可知，采用本发明提供的方法获得的细胞数量、细胞活率均显著高于对比方法和对比试剂盒(P<0.05)。

实施例5 10xGenomics脂肪组织单细胞标记与文库构建

将实施例1制备好的脂肪组织单细胞悬浮液利用微流控芯片，将带有细胞标签序列的胶珠和细胞包裹在液滴中，收集包有细胞的液滴，在液滴中，将细胞裂解，使得细胞中的mRNA与bead上面的cell Barcode相连，形成Single Cell GEMs，在液滴中进行RT反应，随后破乳，进行cDNA的文库构建。通过文库序列上的cell Barcode可以区分目标序列来自于哪一个细胞，通过序列上的sample Index可以区分目标序列来自于哪一个样品。细胞和反应试剂在微流控芯片上的一条通道中，胶珠在另一条通道，共同形成GEM。在每个GEM中独立进行反转录，之后带有标签的cDNA将被混合，然后扩增，再进行文库构建。10xGenomics脂肪组织单细胞标记与文库构建示意图见图2。

实施例6 10xGenomics脂肪组织单细胞文库质检

取实施例5构建的文库进行文库质检，结果如图3所示：(1)Qubit 4.0对文库浓度定量，质量浓度为28.6ng/ul；(2)Agilent 2100检测文库DNA片段的完整性及***片段大小，平均片段大小为426bp；(3)Q-PCR方法对文库有效浓度进行精确定量，浓度为82.8nM。结果显示，本发明实施例1制备的单细胞悬液制成的文库符合测序要求(单细胞文库满足以下条件可进行测序：***片段大小合格，峰型单一，无杂峰，无接头和无引物二聚体，Q-PCR浓度≥4nM。)。

实施例7 10xGenomics脂肪组织单细胞文库测序与数据分析

使用Illumina Novaseq 6000平台包lane进行测序，共产出Raw data共108.98G，过滤后的Clean data共107.08G。根据10x scRNA-Seq独特的文库结构，对reads的Barcode、UMI***片段部分进行拆分，之后***片段部分将比对到参考基因组，然后统计比对到各个区域的比例，并进行表达量统计。

采用以上方法对实施例5制备的文库进行测序，结果如图4所示，共获得了5332个单细胞的mRNA表达谱信息，平均每个细胞基因数为3992，测序深度约为70k Reads/cell，符合预期标准。

取实施例2～3制备的单细胞悬液进行上述试验，实验结果与实施例1结果相近，差异(P＞0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：取脂肪组织，以复合酶解液酶解；

步骤2：将所述酶解后的产物过滤，离心，取细胞沉淀清洗后加红细胞裂解液裂解；

步骤3：将所述裂解后的产物离心，取细胞沉淀清洗、重悬，获得单细胞悬液；

所述复合酶解液为中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse；

其中，步骤1中，所述复合酶中，胶原蛋白酶I的工作浓度为1.0~2.0mg/mL；胶原蛋白酶II的工作浓度为0.5~1.0mg/mL；胶原蛋白酶IV的工作浓度为0.25~1.0mg/mL；中性蛋白酶的工作浓度为 0.25~0.5mg/mL；胰蛋白酶的工作浓度为0.25~0.5mg/mL；DNAse的工作浓度为0.01~0.02mg/mL，胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的质量比为100:50:25:25:25:1；所述脂肪组织与复合酶解液的体积比为1:5~10；所述酶解的温度为35-38℃，酶解的时间为20-40min；所述酶解用含血清的完全培养基终止；

步骤2中，所述过滤为70µm 细胞筛子过滤；所述离心为300g ~400g离心5min；所述清洗为取细胞沉淀以DMEM培养液重悬，使用密度梯度离心液3000g离心10-20min，去除细胞碎片及上清，再以PBS缓冲液重悬细胞，500g离心5min，弃上清；

步骤3中，所述离心为300g ~400g离心5min；所述清洗为取细胞沉淀以PBS缓冲液重悬，150-200g离心5-10min，去除残余红细胞裂解液及碎片，收集底部细胞；所述重悬以含0.5%BSA的PBS缓冲液重悬，重悬的次数为两次，两次重悬之间还包括以40µm细胞筛子过滤的步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述复合酶解液的溶媒为基础培养基或PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述复合酶解液中，复合酶的浓度为0.5~5mg/ml。

4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述酶解前还包括对脂肪组织预处理的步骤，所述预处理为将脂肪组织用DMEM培养基漂洗三次，去除组织中血管及表面膜结构，然后剪切成1-3mm³大小的组织块。