CN109776495A - 抗肿瘤化合物及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，该抗肿瘤化合物具体为式I所示的结构。本发明还涉及所述式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，或含其药物组合物通过抑制布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)发生磷酸化进而***疾病，特别是用于治疗髓细胞白血病的用途；

Description

抗肿瘤化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，具体而言，该抗肿瘤化合物为嘧啶类化合物，属于医药技术领域。

背景技术

白血病是一种骨髓和外周血被造血干/祖细胞浸润的恶性血液肿瘤，主要表现为白血病细胞过度增殖，并多存在分化障碍，病态的幼稚细胞大量浸润骨髓和外周血，引起人体血液***异常，出现贫血、出血、感染和发热等症状。临床上常将白血病分为髓细胞白血病和淋巴细胞白血病两大类，与淋巴细胞白血病相比，髓细胞白血病有更高的发病率和死亡率。在我国恶性肿瘤死亡率排行中，白血病为第八位，但在35岁以下青壮年和儿童人群中却高居首位，且仍以每年10％左右的比例上升，严重危害着我国人民的生命健康。

目前，化疗是国内外治疗白血病的一线治疗方式，其主要机制为通过抑制DNA的复制，阻碍RNA的合成等来抑制肿瘤细胞的增殖。急性髓细胞白血病的主要疗法为阿糖胞苷(Ara-C)联合其他化疗药物，此外还有干扰素化疗药物联用的治疗方法，但以上的方法因缺乏靶向性、特异性，对正常细胞也具有一定的毒性作用，治疗的过程中，患者经常会出现脱发、口腔溃疡、呕吐、便秘或腹泻等副作用，对于一些身体较弱、耐受力较差的患者而言，通常需要减少药量，缩短疗程，因而难以达到理想的治疗作用，并且在长期使用后容易出现耐药等情况。因此，寻找靶向性较强的治疗方法在近几十年受到了广泛的重视，也有许多令人满意的成果，如我国科学家发现和推广的全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(M3型)，该疗法已经成为治疗急性早幼粒细胞白血病的一线治疗方法，极大的改善了患者的预后，降低了死亡风险。但因其具有较强的基因选择性，对其他类型的白血病效果较差，难以推广到其他类型的白血病治疗当中。目前，FLT3靶向药物Midostaurin已经被FDA批准上市，除此之外，还有许多种靶向性治疗急性髓细胞白血病(AML)的药物已经进入临床研究阶段，为肿瘤患者带来了新生机。但相比于其他实体肿瘤，AML相关的靶向药物的研究进展和临床应用都比较落后。

依鲁替尼(Ibrutinib)是一种小分子布鲁顿式酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，FDA批准其治疗的适应症为套细胞淋巴瘤(MCL)，但当该药物面世后，由于其优秀的靶向性和理想的治疗效果，被广泛的应用于包括AML在内的各类肿瘤治疗的研究。首先有研究证实大部分患有AML的患者体内都存在BTK的高表达，并且包括HL-60在内的多种白血病细胞株均存在BTK的高表达，随后陆续有研究证实了Ibrutinib可能抑制AML细胞的增殖和迁移等功能。这些研究为AML的靶向治疗提供了新思路。

鉴于治疗癌症的迫切需要，本领域有必要开发新型作用机制、且效果更佳良好的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具体为嘧啶类化合物，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性。

本发明的另一目的在于提供前述抗肿瘤化合物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供含所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，或所述组合物的用途。

为此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物为式(I)所示的结构：

式(I)所示结构化合物为嘧啶类化合物，命名为BY4009，本发明抗肿瘤活性筛选显示，与Ibrutinib(依鲁替尼)、Ara-C(阿糖胞苷)、Dasatinib(达沙替尼)相比，BY4009对HL-60、K562、U937三种髓系白血病细胞，尤其是急性髓细胞白血病(HL-60，U937)，有较好的抑制细胞增殖的能力；BY4009对健康人PBMC几乎无毒性作用，对肿瘤细胞和正常细胞有较强的分辨能力；BY4009对三种细胞的增殖抑制作用均呈现浓度依赖性和时间依赖性。作为一类结构新颖的分子，本发明中研究化合物具有开发成新型高效BTK靶点抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是急性髓细胞白血病有较大的应用价值。

前述式(I)所示的结构具有如下名称：

(I)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-(4-哌啶醇))甲基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺。

另一方面，本发明提供前述抗肿瘤化合物的制备方法，该抗肿瘤化合物按如下路线制备：

本发明所述化合物由于它们在药物中的可能用途，式(I)所示化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱，其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸处理游离碱、所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidy1acid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实施例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolates)、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐(phenylbutrates)、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有有效剂量的本发明所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

本发明的药物组合物通常含有一种本发明化合物。然而，在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有超过一种本发明的化合物。另外，本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。本发明所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体具有良好的抑制BTK发生磷酸化。因此，本发明还提供所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体，或所述药物组合物在制备BTK酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

本发明发现所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体具有良好的抑制BTK酪氨酸激酶的活性，因此，本发明还提供所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体，或所述药物组合物在制备BTK酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

本发明还提供所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备***的药物中的用途。优选地，所述肿瘤选自急性髓细胞白血病。更优选地，所述用途主要通过抑制BTK酪氨酸激酶实现的。

附图说明

图1为表示BY4009不同处理组对HL-60、U937、K562三种髓系白血病细胞的抑制作用随时间变化情况。

图2为检测BY4009对健康人外周血PBMC的毒性作用。

图3为Western Blotting法检测不同浓度BY4009处理HL-60细胞48h后BTK、p-BTK、Bcl-2以及Bax蛋白水平的表达变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1目标分子的制备

薄层层析硅胶板使用烟台黄海GF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胺板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。

本发明使用的原料主要购自可购买自国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃-30℃。

本发明采用的技术方案如下：

化合物(I)的合成路线.试剂及条件:(a)4-羟基哌啶,K₂CO₃,KI,CH₃CN,80℃,12h,91％；(b)Fe-NH₄Cl,MeOH-H₂O,2h,80℃,72％；(c)丙烯酰氯,NaHCO₃,CH₃CN,NaHCO₃,CH₃CN,0℃,0.5h,95％；(d)Fe-NH₄Cl,MeOH-H₂O,70℃,2h,81％；(e)2,4,5,-三氯嘧啶,DIPEA,1,4-二氧六环,60℃,2h,82-91％；(f)TFA,2-BuOH,100℃,12h,18-31％。

根据以上方法合成了目标分子，所合成目标分子的理化数据如下：

(I)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-(4-哌啶醇))甲基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺；产率30.4％；黄白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆):δ10.20(s,1H),9.38(s,1H),8.91(s,1H),8.07(s,1H),7.77(s,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,3H),7.28(d,J＝6.4Hz,2H),7.02(d,J＝8.4Hz,2H),6.42(dd,J＝17.2,10.0Hz,1H),6.20(dd,J＝17.2,2.0Hz,1H),5.70(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),3.60(s,2H),3.50(m,1H),3.28(m,4H),2.10(m,4H).HRMS(ESI)forC₂₅H₂₇ClN₆O₂,[M+H]⁺理论计算:479.1957,实测:469.0233。

目标分子成盐的方法

无机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加无机酸(1mmol)的5mL无水甲醇溶液，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除甲醇，即得目标分子的无机酸盐。通过该方法制备了化合物I的盐酸盐(I-1)、氢溴酸盐(I-2)、硫酸盐(I-3)及磷酸盐(I-4)；

有机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有机酸(1mmol)的5mL干燥***，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除溶剂，即得目标分子的有机酸盐。通过该方法制备了化合物I的马来酸盐(I-5)、琥珀酸盐(I-6)及富马酸盐(I-7)。

实施例2目标分子生物活性评价

2.1细胞培养

2.1.1HL-60细胞的培养选择IMDM培养基，培养基中含有20％的FBS、1％的双抗，在37℃，5％CO₂的环境中进行培养，通常为1传3，加入5ml培养基，2-3天传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.1.2K562细胞使用1640培养基培养，培养基中含有15％的FBS、1％的青霉素/链霉素双抗，在37℃，5％CO₂环境中培养,通常1传5，培养基5ml，每2天传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.1.3U937细胞使用1640培养基培养，培养基中含有15％的FBS、1％的双抗，在37℃含有5％CO₂的培养箱中培养,通常为1传5，加入培养基5ml，每2天传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

2.1.4PBMC的提取和培养

取新鲜健康人抗凝血10ml-20ml，与PBS1:1混匀后，加入到等体积的淋巴细胞分离液液面上，加入过程要缓慢操作，避免血液冲破淋巴细胞分离液的液面，迅速2000rpm离心20min。离心后的液体共分四层，由上到下分别为：血浆层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层以及红细胞层。取单个核细胞层加入2-3倍的PBS清洗细胞中的分离液等1-2次，每次2000rpm离心20min。以上操作均在细胞间无菌环境下进行，随后用含有20％FBS的1640培养基进行培养，培养条件为37℃、5％CO₂，一周内进行试验。

2.2CCK8法检测药物对HL-60、U937、K562及PBMC细胞的增殖抑制能力及IC₅₀的计算

2.2.1CCK8法测定不同浓度BY4009在24h、48h、72h对HL-60细胞、U937细胞、K562细胞的生长抑制率

5×10⁴密度的HL-60细胞接种于96孔培养板，5×10³密度的K562、U937细胞接种于96孔培养板使其终体积均为100μL/孔，设对照组(加入0.5％DMSO)，空白组(仅加完全培养液)，加药组，加药浓度如表1所示(经过多次实验后，确定合适的加药浓度范围)，每组设3个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中培养分别培养24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育0.5-4h，酶标仪在450nm波长下检测吸光度值，计算各组增殖抑制率。实验重复3次，取其均值。增殖抑制率＝1-(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)％。所得结果如图1所示。

2.2.2CCK8法测定BY4009、Ibrutinib、Dasatinib以及Ara-C对HL-60细胞、U937细胞、K562细胞IC₅₀值

5×10⁴密度的HL-60细胞接种于96孔培养板，5×10³密度的K562、U937细胞接种于96孔培养板使其终体积均为100μL/孔，设对照组(加入0.5％DMSO)，空白组(仅加完全培养液)，加药组，加药浓度如表1所示(经过多次实验摸索浓度后，确定合适的加药浓度范围)，每组设3个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育0.5-4h，酶标仪在450nm波长下检测吸光度值。最后使用SPSS23.0软件求得IC₅₀。所得结果如表2所示：

2.2.3测定BY4009对健康人PBMC的毒性作用

1×10⁵密度的PBMC细胞接种于96孔培养板，加入培养基，使其终体积均为100μL/孔，设control组(加入0.5％DMSO)，空白组(仅加完全培养液)，加药组，加药组浓度设置均为：200μM、100μM、50μM、12.5μM、6.25μM，均设三个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育0.5-4h，使用酶标仪Gene5在450nm的波长下检测各孔吸光度值，计算各组细胞的存活率。细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)％。所得结果如图2所示。

表1：CCK8药物作用浓度

表2

2.3蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测BY4009对HL-60细胞在蛋白水平表达的作用

2.3.1提取总蛋白

铺板HL-60细胞，六孔板中每孔细胞数量为5×10⁶个，设置以下几组：空白对照组、0.5μM、1μM以及2μM BY4009处理组，加药处理时间均为48h。随后用1.5ml离心管收集带有细胞的培养基，800rpm离心5min，弃上清。PBS洗3次。每个样本加入配置好的的细胞裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)100-150μl，加样枪反复吹打混匀，一般在50次以上，置4℃环境等待裂解，15min震荡一次，每次30s,重复4次。最后4℃，12,000rpm离心20min，上清即所提蛋白。所有操作在冰上进行，且提取的蛋白应尽快使用，避免反复冻融。

2.3.2蛋白浓度测定

(1)配制工作液：计算所需工作液总量，每个样本需要200μl工作液(BCA:Cu＝50:1),使用一天内进行配制，并充分混匀。

(2)稀释标准品：取20μl标准品用PBS稀释到200μl,使终浓度为1mg/ml。把标准品按0、1、2、3、4、6、8、10μg的总量加到96孔板的标准品孔中,加PBS补足至20μl，均设置三个复孔。

(3)样品稀释：将样品适当稀释，用PBS补足至20μl。

(4)每孔中加入200μl BCA工作液,37℃放置30min。

(5)570nm波长处检测各孔的吸光度值。根据标准曲线计算蛋白浓度,确定WesternBlot所需的蛋白体积，一般情况下蛋白上样量为20-40μg，根据具体的目的蛋白进行调整。

2.3.3进行蛋白质免疫印迹(Western Blotting)

(1)制胶：根据目的蛋白分子量BTK(76KD)、p-BTK(76KD)选用10％的分离胶(其配制体系如表3所示)和5％的浓缩胶(其配制体系如表4所示)。配制如下:

表3:10％分离胶配制体系(10ml)

表4:5％浓缩胶配制体系(5ml)

(2)电泳：4×上样缓冲液与待测蛋白3:1混匀，并用1×上样缓冲液将体积补充至30μl，100℃、8min使蛋白变性。按顺序上样，每孔加30μl样品，Marker5μl。浓缩胶阶段，采用电压90V，使样本聚集在一条线上，当样品进入分离胶时，调节电压为130V，继续电泳至Marker条带分离到合适的程度，结束电泳，并在室温放置一段时间后转膜。

(3)转膜：根据胶的大小裁剪PVDF膜，PVDF膜先在甲醛中平衡15s，随后在转膜液中浸泡20s-30s。在转膜液中按从下到上的顺序，依次放置海绵垫1张，滤纸3张，胶，PVDF膜,滤纸3张，海绵1张的顺序叠放，置于转膜装置中。连接电源，调节电流为300mA，时间根据分子量的大小而定，一般1KD＝1min。转膜时保持周围低温环境。

(4)封闭：5％的脱脂奶粉封闭PVDF膜，通常为常温下封闭至少1h。

(5)抗体孵育：按比例用5％脱脂奶粉稀释抗体，将PVDF膜放入其中4℃孵育过夜，次日常温下继续孵育1h，从而使抗体更好的与膜上的蛋白结合，随后用，PBST/TBST洗膜3次,每次15min。再加入稀释后的二抗，室温孵育1h；弃二抗，PBST/TBST洗膜3次,每次15min(当目的蛋白为p-BTK时选择TBST，其他蛋白选择PBST)。

2.3.4图像扫描与分析

将ECL检测试剂的A液和B液按1:1混匀后均匀加在PVDF膜上，显影机在暗场和明场分别获得图片，合成后通过Marker确定目的条带。采用Image J软件对目的条带进行灰度分析。

3数据统计

本研究实验数据均用平均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS23.0统计软件对数据进行分析；t检验进行组间均数的比较；当p＜0.05时认为有显著性差异。所得结果如图3所示。

以上生物活性结果表明:

(1)BY4009对三种髓细胞白血病细胞有良好的生长和增殖抑制作用，且该作用具有浓度和时间依赖性。

(2)BY4009对HL-60和U937都有较好的药理活性，并且与临床常用治疗急性髓细胞白血病的Ara-C相比，IC₅₀水平近似甚至更低；而K562作为慢性髓细胞白血病，IC₅₀值稍大，与其临床常用药物Dasatinib相比差距较大，但与Ibrutinib相比IC₅₀偏低。

(3)BY4009对健康人PBMC几乎不存在生长抑制，仅在作用浓度达到100μM时才会有较小的毒性作用，即在后续实验中所采用的低浓度BY4009对正常细胞几乎无毒性作用。

(4)不同浓度BY4009处理HL-60细胞后评估其蛋白表达水平，发现BTK蛋白表达并没有出现明显的改变，而p-BTK随着药物浓度的增加其表达逐渐下调，Bcl-2/Bax下降，表明BY4009可有效抑制BTK磷酸化进而抑制肿瘤细胞生长。结合Ibrutinib(依鲁替尼)、Ara-C(阿糖胞苷)及Dasatinib(达沙替尼)三种药物的IC₅₀，及对相关凋亡因子的评估，发现BY4009作为一类结构新颖的分子，本发明中研究化合物呈现出很好的BTK抑制潜力，可开发成高效BTK靶点抑制剂，对治疗急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病慢性期、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒或淋巴细胞性白血病进展期、套细胞淋巴瘤及小淋巴细胞淋巴瘤等相关肿瘤具有较好的应用价值。

以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具有式(I)所示的结构：

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述的药学上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐中的一种或多种。

3.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中，该抗肿瘤化合物按如下路线制备：

4.一种药物组合物，其含有有效剂量的权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

5.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备酪氨酸激酶BTK抑制剂中的应用。

6.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备***的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述肿瘤选自髓细胞白血病。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中，所述用途主要通过抑制BTK酪氨酸激酶发生磷酸化实现的。