CN109771453A - 桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途 - Google Patents
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本发明涉及一种食用菌提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途,尤其涉及桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途。本发明的制备方法简单易行、运行成本低,本发明的制备方法中的提取溶剂可以回收再利用,无有机试剂残留风险,保证了桦树茸提取物的天然品质的同时且对环境友好,属于绿色制造技术。本发明原料提取较完全,充分利用了原料,原料利用率高。本发明的桦树茸提取物不仅能明显有助于肠道内优势菌群结构恢复,有助于菌群多样化,而且还对与肠道菌群结构相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果,可以用于药物、保健品等各种领域中,具有极大的经济和社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种食用菌提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途,尤其涉及桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途。
背景技术
近年来,关于肠道菌群的研究不断涌现,肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。肠道菌群是人体肠道的所有微生物总和,种类繁多(包括细菌、真菌和病毒),数目更是惊人。据估算,一个正常成人体内,肠道细菌总重量可达1~1.5kg。它们能够影响体重、消化和吸收能力,抵御感染和自身免疫疾病等的患病风险;除此之外,还与一些内分泌代谢性疾病、肾脏疾病、神经***疾病、心血管疾病、呼吸***疾病以及癌症的发生具有密切关联。
肠道菌群按一定的比例组合,各菌间互相制约,互相依存,在质和量上形成一种生态平衡,一旦机体内外环境发生变化,例如包括长期应用广谱抗生素,敏感肠菌被抑制而未被抑制的细菌乘机繁殖,从而引起菌群失调,其正常生理组合被破坏,从而产生病理性组合,引起临床症状,称为肠道菌群失调症。肠道菌群失调症不仅本身有危害,而且肠道菌群失调症还会带来一些相关的疾病,包括例如因肠道菌群失调症引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、道组织损伤、败血症、炎症例如肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症、过敏等。因此,肠道菌群失调症及其相关疾病的危害广泛。
目前,国内外研究开发的具有调节肠道菌群功能的物质主要有两种:一是有益活菌制剂,主要是以双歧杆菌和各种乳酸菌为主,二是有益菌增值促进剂,即通过这类物质使机体自身的生理性固有的菌增殖,形成以有益菌占优势的肠道生态环境。
在古代,就已经采用乳酸菌来发酵食品,特别是显微镜发明后,一些细菌开始逐渐被人们所利用,从此开始有了益生菌(probiotics)的雏形。人们对于益生菌的定义存在着不同的看法,但基本上都包含了益生菌的一些基本特点,即益生菌及其制品使用后能保持宿主机体的健康,抑制不良状态的产生。
益生菌制品是指由细菌为生产者发酵的产品,如酸奶,乳酪等。益生菌还包括单纯活的菌体、死亡细菌的菌体、以及细菌分泌的一些酶及代谢产物等。益生菌通常是一些同属或不同属细菌组成的复合物,也包含单种细菌的益生菌。益生菌在属分类水平上,主要是双歧杆菌属和乳杆菌属细菌,双歧杆菌主要包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌;肠道内乳杆菌属主要包括干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌等。
自从发现幽门螺旋杆菌能引起胃溃疡以来,人们开始意识到肠道菌群与疾病也有关。科学家和商人们对肠道菌群作为药物治疗靶标的防治策略变得越来越感兴趣。肠道菌群具有可塑性,与宿主致病基因的改变相比,调整肠道菌群结构显得更为简单有效,如粪便移植;通过合理饮食调控肠道菌群相关的疾病;指导合理使用抗菌素以维持肠道微生物的稳态;甚至于定点给药,发现药物新靶点等等。
伴随着益生菌而发现了另一类物质益生元(Prebiotics),它是一种膳食补充剂,通过选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分。成功的益生元应是在通过上消化道时,大部分不被消化而能被肠道菌群所发酵的。最重要的是它只是刺激有益菌群的生长,而不是有潜在致病性或腐败活性的有害细菌。因此,补充益生元也是改善菌群结构、增加益生菌丰度的有效方法之一。
健康食品的研发需综合考虑人体和肠道菌群的营养需求。研究发现调整加工工艺、增加食物颗粒体积和基质强度,可降低人体对营养物质的生物利用率,增加肠道菌群可利用的营养物质,达到人体和菌群双赢的状态;食物中的前体物质经过菌群的转化,可形成短链脂肪酸、雌马酚、尿石素、异硫氰酸酯、AHR配体等有益代谢产物,是食品研发的新切入点,但菌群也会产生有害代谢产物;藉由肠道与其他器官的联系,食物可能影响肝脏、心血管、神经、行为和精神状态等。因此,调整食品加工工艺,使人体和菌群对营养物质的利用达到双赢状态,是现代食品加工工艺需要考虑的因素。
***粮农组织(FAO)曾提出,二十一世纪人类最佳饮食结构是“一荤、一素、一菇”,其中的“菇”实际就是多种类的食用菌。食用菌是具有广泛的保健功能和药理活性的食品营养补充剂。国内外大量药理及临床研究证实,灵芝、猴头菇、灰树花、银耳等食用菌具有调节免疫、抗癌等生理功能,是健康食品的新型基料及优良的食品营养保健添加剂。
中国是食用菌物种多样性高度丰富的国家,总数统计可达1000多种。真菌作为食用、药用或保健品,在中国有悠久的历史,其最大优点和共同点就是无毒副作用。近代医学研究表明,它们不仅是传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能,还具增强人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等功效,以食、药用菌为基础的健康食品已在国际市场上占有一席之地。随着消费者健康素质的提高,对健康产品的精细化要求更甚,但现有食药用菌健康产品大多功能范围和市场宣传混乱,功能因子及质控指标等不明确、功能不够显著不能药用化,因此,急需更加明确的功能因子(活性部位)、具有能够药用化效果以及精准化的质控体系。
发明内容
针对以上不足,本发明提供一种桦树茸提取物在治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病中的新用途,功能显著明确,能够药用化,具有实用性。
本发明通过以下方案达到上述目的:
在本发明的第一方面,提供一种桦树茸提取物在治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病中的用途。
在本发明的第二方面,提供一种桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途。
在本发明的第三方面,提供一种治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂,所述制剂包含桦树茸提取物。
在本发明的第四方面,提供一种预防和/或治疗肠道菌群失调症及相关疾病的药物,包含桦树茸提取物和药学上可接受的载体。
在本发明的第五方面,提供一种桦树茸提取物的制备方法,包括:将桦树茸子实体粉碎后,依次用醇提、水提、氢氧化钠(NaOH水溶液)碱水提取,分别得到提取溶液,再分别经浓缩、冷冻干燥,得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物、桦树茸碱提取物。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明的制备方法简单易行、运行成本低,本发明的制备方法中的提取溶剂只使用了乙醇、水和NaOH碱水、乙醇可以回收再利用,无有机试剂残留风险,保证了桦树茸提取物的天然品质的同时且对环境友好,属于绿色制造技术。
(2)本发明依次采用乙醇、水、和NaOH碱水提取桦树茸子实体,原料提取较完全,充分利用了原料,原料利用率高。
(3)本发明的桦树茸提取物不仅能明显有助于肠道内优势菌群结构恢复,有助于菌群多样化,而且还对与肠道菌群结构相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果,例如能有效缓解炎症的恶化,改善免疫相关的各项生理病理指标,可以用于药物、保健品等各种领域中,具有极大的经济和社会价值。
附图说明
图1小肠组织HE染色病理切片。
具体实施方式
在本发明的第一方面,提供一种桦树茸提取物治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病中的用途。
其中,所述肠道菌群失调症包括由非正常饮食导致的肠道菌群失调症。
其中,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏。
进一步地,上述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
在本发明的第二方面,提供一种桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途。
其中,所述肠道菌群失调症包括由非正常饮食导致的肠道菌群失调症。
其中,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏。
进一步地,上述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
例如,在一个实施例中,提供一种桦树茸提取物在制备免疫增强剂中的用途。
在本发明的第三方面,提供一种治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂,所述制剂包含桦树茸提取物。
优选的,所述制剂包括药物、保健品或食品。
其中,所述肠道菌群失调症包括由非正常饮食导致的肠道菌群失调症。
其中,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏。
进一步地,上述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
在本发明的第四方面,提供一种预防和/或治疗肠道菌群失调症及相关疾病的药物,包含桦树茸提取物和药学上可接受的载体。
其中,所述肠道菌群失调症包括由非正常饮食导致的肠道菌群失调症。
其中,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏。
进一步地,上述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
本发明中所述的“药学上可接受的载体”还可以理解为“稀释剂”或“辅料”等,在医药领域内众所周知且描述于例如雷明顿医药科学(Remington’s PharmaceuticalSciences),马克出版公司(Mack Publishing Co.)(A·R·格纳诺(A.R.Gennaro)编,1985)。这些物质在所使用的剂量和浓度下对接受者来说是无毒,包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐等缓冲液;诸如抗坏血酸等抗氧化剂;诸如聚精氨酸等低分子量(小于约10个残基)肽;诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质;诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物;诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸等氨基酸;单糖、二糖和包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物;诸如EDTA等螯合剂;诸如甘露醇或山梨醇等糖醇;诸如钠等抗衡离子;和/或诸如吐温(Tween)、泊洛尼克(Pluronics)或聚乙二醇等非离子型表面活性剂;还包括包括无菌水、盐水、葡萄糖、油(如玉米油、花生油及类似物)、酸。进一步还可以包括防腐剂、润湿剂、乳化剂、及类似物等。
本发明的桦树茸提取物或药物的给药剂量可以随具体给药方法和被治疗的客体或类型而变化。该剂量足以产生预期的有益效果,并且可以配制用于单一剂量施用或多重剂量施用。
本发明中所述的药物可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用,包括口服、肌内、静脉内、真皮内、病灶内等途径。施用可以是局部、表面或者全身的。在任何给定的情况下最合适的途径取决于多种因素,例如疾病的性质、疾病的进程、疾病的严重性等。作为优选,本发明的桦树茸提取物或包含桦树茸提取物在内的药物通过口服给药。
本发明的所述桦树茸提取物还可以与第二活性化合物/第二治疗剂一起施用,同时、相继或并行施用。在分别施用时,本发明的所述桦树茸提取物或包含桦树茸提取物的药物与第二活性化合物或第二治疗剂可以以不同的用药频率或间隔施用。
在本发明的上述四个方面的用途或制剂中,所述桦树茸提取物包括桦树茸水提取物、桦树茸醇提取物、桦树茸碱提取物。
在一个实施例中,所述桦树茸醇提取物为桦树茸乙醇提取物。
在一个实施例中,所述桦树茸碱提取物为桦树茸氢氧化钠提取物。
更优选的,在本发明的上述四个方面的用途或制剂中,所述桦树茸提取物优选为下述制备方法制备得到的桦树茸提取物。
在本发明的第五方面,提供一种桦树茸提取物的制备方法,包括:将桦树茸子实体粉碎后,依次用醇提、水提、NaOH碱水提取,分别得到提取溶液,再分别经浓缩、冷冻干燥,得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物、桦树茸碱提取物。
优选的,一种桦树茸提取物的制备方法,包括:将桦树茸子实体粉碎后,依次用95%乙醇提取、水提取、1%-2%NaOH碱水提取,分别得到提取溶液,再分别经浓缩、冷冻干燥,得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物、桦树茸碱提取物。
优选的,一种桦树茸提取物的制备方法,包括:将桦树茸子实体粉碎后,采用乙醇回流提取,得到第一滤渣和醇提取溶液,将第一滤渣采用水回流提取溶液,得到第二滤渣和水提取溶液,再将第二滤渣采用1%-2%NaOH碱水回流提取,得到第三滤渣和碱提取溶液,将醇提取溶液、水提取溶液分别经过浓缩、冷冻干燥得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物;将碱提取溶液经过浓缩、醇沉、冷冻干燥得到桦树茸碱提取物。
优选的,所述乙醇回流提取包括:加入料液比为1:8-1:15的乙醇,回流提取2-4小时,抽滤,得到滤液、减压浓缩得到稠膏,稠膏经-80℃冷冻过夜,冷冻干燥,即得桦树茸醇提物。
优选的,所述水回流提取包括:取醇提后的滤渣,采用料液比为1:8-1:15的水,回流提取 1-3小时,抽滤,得到滤液、减压浓缩得到稠膏,稠膏经-80℃冷冻过夜,冷冻干燥,即得桦树茸水提物。
优选的,所述1%-2%NaOH碱水提取包括:取经醇和水提后的滤渣,采用料液比为1:8-1:15 的碱水,搅拌下超声提取1-2小时,抽滤,得到滤液,加入醇类试剂沉淀,沉淀12-24小时,收集沉淀,经-80℃冷冻过夜,冷冻干燥,即得桦树茸碱提物。
所述1%-2%NaOH或所述1%-2%NaOH碱水是指重量百分含量为1%-2%的NaOH水溶液。
优选的,所述1%-2%NaOH为2%NaOH。
进一步优选的,所述沉淀的醇类试剂包括乙醇、甲醇。
进一步优选的,所述沉淀为加入液体4-6倍量的乙醇,沉淀12-24小时。
在本发明的第六方面,提供一种上述制备方法制备得到的桦树茸提取物。
桦树茸:[Inonotuso bliquus(Fr)Pilat.]其菌核是药用真菌,又称:桦褐孔菌、白桦茸、西伯利亚灵芝、桦树菇。桦树茸菌核呈现瘤状,菌核无柄,一般直径25cm~40cm,外表黑褐色或黑色,内部黄褐色,老后表面深裂,很硬,干时脆。生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上,其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。桦树茸的菌丝体极其耐寒,生活在木材中的菌丝体能耐零下40℃的低温。主要分布在北半球北纬 45°~50°的地区,如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、勘察加半岛)、中国(黑龙江、吉林省长白山地区)、日本(北海道)等国家。桦树茸含有大量的抗癌、降血压、降血糖、降血脂、复活免疫作用的植物纤维类多糖体。可以提高免疫细胞的活力,抑制癌细胞扩散和复发,在胃肠内防止致癌物质等有害物质的吸收,并促进***。
本发明中所述的“失调”可以理解为“失衡”、“紊乱”、或“疾病”等。
如本文中所使用,术语“包含”或“包括”指方法包括所列举的要素,但不排除其它要素。
本发明所述的桦树茸的化学成分有多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸,还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1:桦树茸提取物的制备,步骤如下:
(1)取桦树茸子实体原料,采用料液比为1:8-1:15的乙醇,回流提取2-4小时,抽滤,得到滤液、减压浓缩得到适当浓度的稠膏,稠膏经-80℃冷冻过夜,入冷冻干燥机干燥,即得桦树茸醇提物。
(2)取上述(1)经醇提后的滤渣,采用料液比为1:8-1:15的水,回流提取1-3小时,抽滤,得到滤液、减压浓缩得到适当浓度的稠膏,稠膏经-80℃冷冻过夜,入冷冻干燥机干燥,即得桦树茸水提物。
(3)取上述(2)经醇和水提后的滤渣,采用料液比为1:8-1:15的水,搅拌下超声提取 1-2小时,抽滤,得到滤液,加入适当浓度乙醇,沉淀12-24小时;收集沉淀,经-80℃冷冻过夜,入冷冻干燥机干燥,即得桦树茸碱水提物。
多糖含量测定采用中华人民共和国农业行业标准NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》方法;蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。桦树茸提取物中粗多糖及蛋白质含量如表 1所示。
表1桦树茸提取物中粗多糖及蛋白质含量
实施例2:桦树茸提取物对高脂饮食致小鼠肠道菌群失调相关指标的改善作用
1、试剂:
总胆固醇(T-CHO)测试盒:南京建成生物工程研究所。
甘油三酯(TG)测试盒:南京建成生物工程研究所。
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒:南京建成生物工程研究所。
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒:南京建成生物工程研究所。
雌性C57小鼠30只,SPF级,体重12-14g,日龄28-30d,购自于广东省医学实验动物中心,许可证号为SCXK(粤)2013-0002。
大小鼠维持饲料:广东省医学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2013-0002。
高脂高胆固醇饲料配方如表2所示。
表2高脂高胆固醇饲料的主要成分及能量构成
桦树茸提取物按本发明实验例1制备得到。
2、方法
高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的制备:受试动物饲养在广东省微生物所动物实验中心,饲养温度与湿度:23±1℃,55±10%,采用12h昼夜间断照明;饲养室条件始终保持稳定,以保证试验结果的可靠性。小鼠自由进食饮水。期间每日检查动物一次,未发现不健康的动物,取全部健康小鼠进行实验。50只C57小鼠经适应性饲养7d后,随机分成正常组、模型组、桦树茸醇提组、桦树茸水提组和桦树茸碱提组,每组10只。正常组用普通饲料喂养,模型组和给药组用高脂高胆固醇饲料喂养,连续喂养2个月。
造模成功后,开始给药,给药组分别给予桦树茸水提取物、桦树茸醇提取物和桦树茸碱提取物灌胃,药物浓度6mg/ml(180g提取物溶于30ml水中),剂量3mg/只/天,给药量0.5ml/ 只/天,连续给药35天,同时正常组小鼠继续用普通饲料喂养,给药组和模型组小鼠换用普通饲料喂养。
3、结果观察
每天观察动物的外观体态(毛、色、形)和动态并作相应记录,每隔7d测量动物体重1 次。
血液:停药24h后,动物取材测定指标。采集血样,摘眼球取血,血浆经3000RPM,10min 离心两次收集血清,测定血清中总胆固醇(TG)、甘油三酯(T-CHO)、低密度脂蛋白(LDL-C) 和高密度脂蛋白(HDL-C)水平。小肠组织:摘眼球取血后,处死并解剖小鼠,取小鼠小肠组织,固定在4%多聚甲醛中。小肠组织被制成石蜡切片,采用HE法染色,进行病理切片观察。
4、数据处理
所有数据以均数±标准差表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间均数两两比较,方差齐时采用LSD法;方差不齐时采用Dunnett’s T3法。由 SPSS软件完成,α=0.05。
各组的体重变化如表3所示。
表3小鼠体重变化
#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常组;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组
观察发现,给药组的动物的毛皮比模型组的毛皮更平滑。
从表3可以看出,经过治疗的动物的毛皮比模型组的毛皮更平滑。正常组和模型组之间的平均体重差异显著(P<0.05),模型组小鼠在开始时平均体重约65.45g,在实验结束时平均体重为72.76g,说明高脂饮食诱导肥胖小鼠模型造模成功;与模型组相比,3个给药组小鼠平均体重显著下降(P<0.001)(表3)。这表明:给肥胖小鼠灌胃适量的桦树茸提取物可以显著减缓体重增加,特别是桦树茸水提物对于肥胖小鼠的减重效果特别显著。
各组的血脂四项检测结果如表4所示。
表4小鼠血清生化指标(mmol/L)
#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常组;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组
从表4可以看出,模型组中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇比正常组显著升高(P<0.001或P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇比正常组显著降低(P<0.001);与模型组相比,给药组中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著下降(P<0.01或P<0.001),高密度脂蛋白胆固醇水平显著升高(P<0.05)。这表明:给肥胖小鼠灌胃适量的桦树茸提取物可以显著降低血清中的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平。特别是桦树茸醇提物对于总胆固醇T-CHO的降低效果特别显著,而桦树茸水提物对于低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的降低效果特别显著。
小肠组织HE染色病理切片结果如图1所示,从图1可见,正常组小肠组织绒毛长而完整,模型组肠绒毛脱落严重,说明高脂饮食能够对小鼠的肠道造成损伤,说明模型是成功的。与模型组相比,经过药物处理后,给药组能够缓解损伤,促进肠道的修复。
以上结果可以看出,本发明的桦树茸醇提物、桦树茸水提物、桦树茸碱提物均能显著减缓高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重增加,并且能显著降低肥胖小鼠的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平。
实施例3:桦树茸提取物对高脂饮食诱导肥胖小鼠肠道菌群失调的改善作用
1、实验方法
采集实施例2中动物实验结束时小鼠粪便,经过液氮快速冷冻后,保存在-80℃冰箱中。从粪便样品中提取DNA,并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量,同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。采用正向引物5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和反向引物 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'对小鼠16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并对目标片段进行切胶回收,回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。参照电泳初步定量结果,将PCR扩增回收产物进行荧光定量,荧光试剂为Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit,定量仪器为Microplate reader(BioTek,FLx800)。根据荧光定量结果,按照每个样本的测序量需求,对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。使用MiSeq测序仪进行2×300bp 的双端测序,相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)。
1、实验结果
各组的肠道菌群多样性结果如表5所示。
表5小鼠肠道菌群多样性指数
#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常组;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组
从表5可以看出,与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群的Alpha多样性指数Chao1、Shannon 和Simpson显著下降(P<0.05),说明高脂饮食改变了小鼠肠道菌群结构,使其多样性降低;与模型组相比,给药组小鼠肠道菌群多样性指数Chao1、Shannon和Simpsonn显著升高(P<0.05),说明高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道菌群给予桦树茸提取物治疗后,肠道菌群多样性显著增加。
各组的OTU丰度分析如表6和表7所示。
表6小鼠肠道菌群在门水平上的相对丰度
#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常组;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组
表7小鼠肠道菌群在属水平上的相对丰度
#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs正常组;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组
从表6可以看出,在门水平上,与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群Bacteroidetes和 Firmicutes相对丰度发生了显著变化,Bacteroidetes相对丰度显著降低(P<0.05),Firmicutes 嫌贵丰度显著增加(P<0.05);与模型组相比,给药组Bacteroidetes相对丰度显著增加(P<0.05 或P<0.001),Firmicutes相对丰度显著降低(P<0.05)。
从表7可以看出,在属水平上,与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群Bacteroides、Lactobacillus和Odoribacter相对丰度显著降低(P<0.05),Ruminococcus相对丰度显著增加 (P<0.05);与模型组相比,给药组Bacteroides、Lactobacillus和Odoribacter显著增加(P<0.05 或P<0.01),Ruminococcus相对丰度显著降低(P<0.05)。
这说明,本发明的桦树茸提取物具有调节肠道菌群失调的功能。
综上可以看到,桦树茸提取物不仅能明显有助于肠道内优势菌群结构恢复,有助于菌群多样化,而且还对与肠道菌群结构相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果,能有效缓解炎症的恶化,改善免疫相关的各项生理病理指标,可以用于药物、保健品等各种领域中,具有极大的经济和社会价值。
以上所述,仅为本发明的较佳的具体实施例,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.桦树茸提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏;优选的,所述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述桦树茸提取物在制备免疫增强剂中的用途。
4.一种治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂,其特征在于,所述制剂包含桦树茸提取物。
5.根据权利要求4所述的制剂,其特征在于,所述肠道菌群失调症的相关疾病包括但不限于因肠道菌群失调引起的免疫力低下、高血脂、高胆固醇、肥胖、肠道组织损伤、败血症、炎症、过敏;优选的,所述炎症包括但不限于肠道炎症、结肠炎、神经炎症、肿瘤炎症。
6.一种预防和/或治疗肠道菌群失调症及相关疾病的药物,其特征在于,包含桦树茸提取物和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物,其特征在于,所述桦树茸提取物包括桦树茸水提取物、桦树茸醇提取物、桦树茸碱提取物。
8.一种桦树茸提取物的制备方法,其特征在于,包括:将桦树茸子实体粉碎后,依次用醇提、水提、NaOH碱水提取,分别得到提取溶液,再分别经浓缩、冷冻干燥,得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物、桦树茸碱提取物。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,包括:将桦树茸子实体粉碎后,依次用95%乙醇提取、水提取、1%-2%NaOH碱水提取,分别得到提取溶液,再分别经浓缩、冷冻干燥,得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物、桦树茸碱提取物。
10.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,包括:将桦树茸子实体粉碎后,采用乙醇回流提取,得到第一滤渣和醇提取溶液,将第一滤渣采用水回流提取溶液,得到第二滤渣和水提取溶液,再将第二滤渣采用1%-2%NaOH碱水回流提取,得到第三滤渣和碱提取溶液,将醇提取溶液、水提取溶液分别经过浓缩、冷冻干燥得到桦树茸醇提取物、桦树茸水提取物;将碱提取溶液经过浓缩、醇沉、冷冻干燥得到桦树茸碱提取物。
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