CN109758447B - 一种特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。

Description

一种特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用。

背景技术

***病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的***，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。***传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为A类动物疫病名单之首，我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位，同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前，疫苗免疫是防控***的主要手段，然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此，为了弥补“免疫窗口期”，急需开发新型有效的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的在于提供特立氟胺(Teriflunomide)在制备预防***病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。

本发明提供了特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。

优选的是，所述特立氟胺在所述药物中的浓度为200～400μmol/L。

本发明还提供了一种***病毒抑制剂，所述抑制剂包括特立氟胺和药学上可接受的辅料。

优选的是，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明提供了特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用。特立氟胺对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，本发明将特立氟胺作为有效组分制备得到的药物能够抑制***病毒(FMDV)，防控***。细胞试验显示，特立氟胺细胞毒性低，对A型***病毒和O型***病毒的复制均具有抑制作用；进一步的实验证实，特立氟胺只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。特立氟胺能够作为一种有效的抗***病毒成分。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的Teriflunomide对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施例1中不同浓度的Teriflunomide对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施例1中不同浓度的Teriflunomide对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施例1中不同浓度的Teriflunomide对O型FMDV感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图5为本发明实施例1中不同浓度的Teriflunomide对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施例1中IFA检测不同浓度的Teriflunomide对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施例1中Teriflunomide在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图8为本发明实施例1中Teriflunomide在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图9为本发明实施例1中Teriflunomide对FMDV感染乳鼠死亡时间的影响。

具体实施方式

本发明提供了特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。特立氟胺对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，特立氟胺只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明将特立氟胺作为有效组分制备得到的药物细胞毒性低，对A型***病毒和O型***病毒的复制均具有抑制作用，能够抑制***病毒(FMDV)，防控***。本发明对特立氟胺的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品即可。

在本发明中，所述特立氟胺在所述药物中的浓度优选为200～400μmol/L，更优选为400μmol/L。

本发明还提供了一种***病毒抑制剂，所述抑制剂包括特立氟胺和药学上可接受的辅料。

在本发明中，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。在本发明中，所述甘油优选为注射用甘油。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油的市售产品即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1细胞、动物、病毒和药物

IBRS-2细胞由本课题组保存；3日龄乳鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场。FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家***参考实验室保存并提供；Teriflunomide购自MCE公司，以DMSO进行配制。

1.2试剂

DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBRPremix Ex Taq^Ⅱ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；Tween-20、Tween-80购自上海生工生物工程公司；TritonX-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体由国家***参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家***参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1Teriflunomide在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法测定Teriflunomide对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Teriflunomide 100μL，以Teriflunomide的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的Teriflunomide对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，其对IBRS-2细胞的毒性加大。当浓度为400μmol及以下浓度时，细胞活性在70％以上。当药物浓度的浓度高于400μmol时，细胞活性迅速下降，在1000μmol的浓度下，细胞的活性率为20％。所以，当利用该药物制备抗FMDV药物时，其浓度应不高于400μmol。

2.2Teriflunomide在IBRS-2细胞上抗***病毒活性的评价：

将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Teriflunomide 100μL，以Teriflunomide的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无Teriflunomide、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度Teriflunomide的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和WesternBlot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV2B基因mRNA特异的引物序列为：

FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据

方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDV VP1蛋白。为了研究Teriflunomide对其他***病毒亚型是否具有抑制作用，利用100TCID50A/GDMM/CHA/2013感染细胞，MTS法测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用MTS检测Teriflunomide对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为400μmol时，Teriflunomide才可以提供IBRS-2细胞70％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDV mRNA(图4)和VP1水平(图5)的表达。而当浓度低于400μmol时，Teriflunomide则不能提供细胞有效的保护以及降低FMDVmRNA和VP1水平的表达。同样，当用A型***病毒感染细胞时，200、400μmol的Teriflunomide能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明Teriflunomide对A型FMDV也有抗病毒活性。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Teriflunomide 100μL，以Teriflunomide的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％Triton X-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用50、100、200μmol的Teriflunomide处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而用400μmol Teriflunomide处理的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Teriflunomide在IBRS-2细胞上的抗***病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4Teriflunomide对***病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入Teriflunomide，使其的终浓度为400μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO2恒温细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。

实验结果如图7～8所示：在病毒感染后不同时间段用Teriflunomide处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平(图7)和VP1蛋白水平(图8)明显受到抑制。而在16h时Teriflunomide的抑制作用并不明显，说明Teriflunomide只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

2.5Teriflunomide在体内的抗***病毒活性评价：

3日龄SPF BALB/C乳鼠24只，随机分成两组，12只/组，乳鼠和母鼠一同饲养。实验分为两组，实验组12只乳鼠颈部皮下注射60μg Teriflunomide，对照组12只乳鼠全部颈部皮下接种含10％Tween-80的PBS100μL。2h之后，全部乳鼠颈部皮下注射含有100LD50O/MY98/BY/2010的PBS 100μL。连续观察并记录乳鼠死亡情况。为了保证实验的安全性，动物的攻毒在P3实验室进行，相关操作符合中国农科院实验动物管理委员会相关规定。

实验结果如图9所示：对照组乳鼠从病毒感染之后30h开始死亡，54h的时候已经全部死亡，而实验组在60h时开始死亡，到102h乳鼠才全部死亡，死亡时间与对照组相比延缓了48h。由此可以看出，Teriflunomide能够显著延缓***病毒对乳鼠的致死效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims (2)

1.特立氟胺在制备预防***病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述***病毒为A型***病毒和O型***病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特立氟胺在所述药物中的浓度为200～400μmol/L。

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