CN109735437B - 一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法,包括:用于对弹射分选细胞进行接收以及盛装细胞裂解液或其他试剂的接收盖;用于盛装聚合酶链式反应混合物以及进行聚合酶链式反应的反应管;接收盖与反应管可组装与拆分;本发明可满足细胞弹射分选仪对接收高度的限制,又巧妙的解决了聚合酶链式反应对体积的需求;对于弹射分选的细胞可实现在细胞接收器中直接进行全基因组、全转录组扩增等后续研究,增加了全基因组扩增成功率及覆盖率,且结构简单,方法简明,工作结果高效可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞收集器及其操作方法技术领域,尤其是一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法。
技术背景
尽管现代医学飞速发展,但癌症、感染性疾病、代谢性等疾病仍然威胁着人类的生命与健康,对这些疾病的防治,需要更深入地探索生命过程;2003年,“人类基因组计划”完成了人体30亿个碱基对的测序工作,但如何破译这些基因密码,解析基因、表型与环境间的复杂关系仍是尚未解决的问题;这需要对与微环境相互作用的细胞表型进行深入研究,补充与基因型相对的表型信息,在单细胞层面上建立基因型与表型间的联系,实现对生命的真正***性科学解码,这项工作有助于精准医疗与疾病防治,支撑人口健康这一国家重大需求;
单细胞弹射分选技术是一种有效的细胞分离手段,其原理为:激光与物质相互作用的原理,将芯片上的目标单细胞精准分离至接收器中,具有无标记、非接触、精准、广泛适用等特点;但是基于该技术所采用的现有细胞收集器设计不合理,其本质原因在于细胞在分选过程中运动轨迹复杂,细胞收集器的收集孔体积较小,无法在收集器中直接进行基因组扩增等后续研究,导致细胞接收耗材的接收效率低,直接影响细胞表型与基因型相关性的深入研究。
发明内容:
本发明的目的是,提供一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法,该器皿采用可组装与拆分的分节式结构设计,包括用于放入细胞弹射分选仪中作为细胞收集容器的接收盖,以及用于后续基因扩增等实验操作的反应管,采用优化的结构设计,使得该细胞收集器同时满足弹射分选和后续研究的需要;减少了分选细胞进行后续处理时的转移步骤和操作流程,有效降低了外源污染几率,并节约了时间成本;同时采用科学的方法应用设计,有效的提高了细胞分选接收及基因组扩增的成功率。
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法,其中:
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿,包括:满足单细胞弹射分选仪接收高度限制,用来接收分选得到的单细胞或细胞群的接收盖;用于盛装后续实验操作试剂的反应管;所述接收盖和反应管可以进行组装与拆分;
作为一种举例说明,所述后续实验操作试剂为如聚合酶链式反应混合物等;
进一步的,所述接收盖结构包括:用于接收弹射分选细胞的细胞接收结构;用于与反应管相互连接、定位、密封的连接结构;用于固定在单细胞弹射分选仪接收装置上的固定结构;
其中,所述细胞接收结构设置在连接结构的内部;所述连接结构设置在所述固定结构上部;
作为一种举例说明,所述器皿集成了与其他耗材、仪器、工具的耦合结构,保证了器皿的通用性;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构还可以用于盛装细胞裂解液、培养基或其他固体及液体试剂;
作为一种举例说明,所述连接结构的设计,包括但不限于柱体、锥体、方体、球体、多面体或多种形状复合体中的一种;
作为一种优选举例说明,所述连接结构上部四周设置有密封圈结构,用于更好的与反应管形成封闭腔室;
作为一种优选举例说明,所述细胞接收结构的体积优选区间设置在:0.1μl-100μl;此体积优选区间通过科学的数学建模设计,并结合实际实验数据,通过电脑数据汇总分析后最终得出,该区间的设计大大增强了器皿的工作效率,又巧妙的解决了聚合酶链式反应对体积的需求;对于弹射分选的细胞可实现在细胞接收器中直接进行全基因组、全转录组扩增等后续研究;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构的上端设有开口,开口截面为圆形、方形、三角形或多种图形的复合图形中的一种;
作为一种优选举例说明,所述开口截面的截面积优选区间为:0.002~80平方毫米;
进一步的,所述固定结构用于与弹射分选仪的细胞接收装置进行可逆连接与固定;
作为一种应用举例说明,所述固定结构上可设计有便于使用镊子等转移器具夹取的夹取结构,此举可有效的避免碰触腔室带来的温度、压力以及外部菌群产生的数据干扰;
作为一种优选举例说明,所述接收盖其整体高度区间选取:0.1~50mm;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构、连接结构、固定结构均可设置成联排阵列。
作为一种举例说明,所述反应管的形状包括但不限于:柱体、锥体、方体、球体或多种形状的复合体中的一种或组合。
作为一种举例说明,所述反应管的体积优选范围:10μl-2000μl;
作为一种应用举例说明,所述器皿的材质为常见原材料,包括但不限于:聚丙烯(PP)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)中的一种或组合。
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之操作方法,用于对器皿中分选细胞进行聚合酶链式反应,包括如下具体步骤:
步骤一、使用所述接收盖对弹射分选的细胞进行收集:将接收盖放入单细胞弹射分选仪的接收装置中,操作单细胞弹射分选仪将待测样品中的目标细胞依次分选至一个或多个所述接收盖中;
进一步的,所述接收盖作为细胞收集器皿,每个接收盖可收集单个细胞或由多个细胞组成的细胞群;
进一步的,接收盖与样品芯片间的距离为0-5mm;
进一步的,可向接收盖内预先加入细胞裂解液、培养液或其他试剂,此举对腔室内形成软着陆表面,降低分选过程中,在接触接收盖内壁时的冲击损伤;
作为一种举例说明,所述细胞裂解液、培养液或其他试剂的体积为:0.1-100μl;
进一步的,所述接收盖可预先进行无菌处理,包括但不限于:高压灭菌、强氧化剂浸泡及放射性核素照射等杀菌方法中的一种或者组合;
作为一种优选实施例举例,所述强氧化剂浸泡为:次氯酸钠浸泡;
作为一种优选实施例举例,所述放射性核素照射为:钴-60照射;
步骤二、将所述包含有分选细胞的接收盖与反应管组合为器皿,形成具有一体封闭腔室的细胞收集与反应器;
作为一种举例说明,若在步骤一时没有向接收盖中加入裂解液、培养液或其他试剂或其他溶液,可在接收盖与反应管组合之前,向接收盖中加入上述溶液或试剂;
步骤三、将接收盖中的细胞或细胞裂解液转移至反应管中;
通过将组合后的所述器皿上下翻转,再通过对接收盖中的细胞或细胞裂解液施加作用力的方法,将所述接收盖中包含有细胞或细胞内容物的溶液转移至反应管底部;
作为一种举例说明,所述作用力包括但不限于:离心力、重力、静电力、磁场力中的一种或组合。
步骤四、对反应管中的细胞或细胞裂解液进行后续实验处理;
作为一种举例说明,所述后续实验处理包括但不限于:聚合酶链式反应、培养、生化分析;
作为一种举例说明,所述聚合酶链式反应包括:全基因组扩增、全转录组扩增、目标基因片段扩增等涉及聚合酶链式反应的实验;
为了更好的说明本发明的设计原理,现简要介绍其设计依据和设计思路如下:
首先,设计分节式细胞收集器是为了能够方便地拆分和组装,在弹射分选过程中,由于弹射分选仪的接收空间高度有限制,普通的聚合酶链式反应管(PCR管)无法放入其中作为细胞收集容器,故而本发明先行设计出一种分节式细胞收集器,用来接收分选得到的单细胞或细胞群,同时方便地在其中进行聚合酶链式反应等后续实验;
其次,分选结束后,将接收盖移出分选仪的接收装置,与反应管组装成分节式细胞收集器,上下翻转后,通过离心等方法将细胞收集盖中的细胞转移至反应管中;
再次,由于反应管体积够大,且尺寸、形状与热循环仪相匹配,可方便的在其中直接进行单细胞全基因扩增、单细胞全转录组扩增等后续研究,简化了操作流程,减少转移步骤,可有效防止引入外源污染;
最后,本发明通过优化单细胞全基因扩增反应体系与条件,在提高细胞收集效率的同时,增加了全基因组扩增成功率及覆盖率。
本发明的有益效果
1、本发明采用的优化结构设计,大大增强了分节式细胞收集器的使用效果,可满足细胞弹射分选仪对接收高度的限制,又巧妙的解决了聚合酶链式反应对体积的需求;对于弹射分选的细胞可实现在细胞接收器中直接进行聚合酶链式反应等后续研究;
2、简化了操作流程,减少转移步骤,可有效防止引入外源污染;
3、本发明通过优化细胞弹射分选的细胞收集与处理方法,在提高细胞收集效率的同时,增加了全基因组扩增成功率及覆盖率,且结构简单,方法简明,工作结果高效可靠。
附图说明
图1是本发明一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之结构示意图
图2是本发明一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿的接收盖之结构示意图
图3是本发明细胞接收、转移、聚合酶链式反应的分节式细胞收集器及其应用方法之实施例1全基因组扩增电泳图
图4是本发明细胞接收、转移、聚合酶链式反应的分节式细胞收集器及其应用方法之实施例2全基因组扩增及16S rRNA扩增电泳图
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明。
详见图1及图2所示,一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿及方法,其中:
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿,包括:满足单细胞弹射分选仪接收高度限制,用来接收分选得到的单细胞或细胞群的接收盖101;用于盛装后续实验操作试剂的反应管102;所述接收盖101和反应管102可以进行组装与拆分;
作为一种举例说明,所述后续实验操作试剂为如聚合酶链式反应混合物等;
进一步的,所述接收盖101结构包括:用于接收弹射分选细胞的细胞接收结构201;用于与反应管102相互连接、定位、密封的连接结构202;用于固定在单细胞弹射分选仪接收装置上的固定结构203;
其中,所述细胞接收结构201设置在连接结构202的内部;所述连接结构202设置在所述固定结构203上部;
作为一种举例说明,所述器皿100集成了与其他耗材、仪器、工具的耦合结构,保证了器皿的通用性;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构201还可以用于盛装细胞裂解液、培养基或其他固体及液体试剂;
作为一种举例说明,所述连接结构202的设计,包括但不限于柱体、锥体、方体、球体、多面体或多种形状复合体中的一种;
作为一种优选举例说明,所述连接结构202上部四周设置有密封圈结构,用于更好的与反应管102形成封闭腔室;
作为一种优选举例说明,所述细胞接收结构201的体积优选区间设置在:0.1μl-100μl;此体积优选区间通过科学的数学建模设计,并结合实际实验数据,通过电脑数据汇总分析后最终得出,该区间的设计大大增强了器皿的工作效率,又巧妙的解决了聚合酶链式反应对体积的需求;对于弹射分选的细胞可实现在细胞接收器中直接进行全基因组、全转录组扩增等后续研究;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构201的上端设有开口,开口截面为圆形、方形、三角形或多种图形的复合图形中的一种;
作为一种优选举例说明,所述开口截面的截面积优选区间为:0.002~80平方毫米;
进一步的,所述固定结构203用于与弹射分选仪的细胞接收装置进行可逆连接与固定;
作为一种应用举例说明,所述固定结构203上可设计有便于使用镊子等转移器具夹取的夹取结构,此举可有效的避免碰触腔室带来的温度、压力以及外部菌群产生的数据干扰;
作为一种优选举例说明,所述接收盖101其整体高度区间选取:0.1~50mm;
作为一种举例说明,所述细胞接收结构201、连接结构202、固定结构203均可设置成联排阵列。
作为一种举例说明,所述反应管102的形状包括但不限于:柱体、锥体、方体、球体或多种形状的复合体中的一种或组合。
作为一种举例说明,所述反应管102的体积优选范围:10μl-2000μl。
作为一种应用举例说明,所述器皿100的材质为常见原材料,包括但不限于:聚丙烯(PP)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)中的一种或组合。
一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之操作方法,用于对器皿100中分选细胞进行聚合酶链式反应,包括如下具体步骤:
步骤一、使用所述接收盖101对弹射分选的细胞进行收集:将接收盖101放入单细胞弹射分选仪的接收装置中,操作单细胞弹射分选仪将待测样品中的目标细胞依次分选至一个或多个所述接收盖101中;
进一步的,所述接收盖101作为细胞收集器皿,每个接收盖101可收集单个细胞或由多个细胞组成的细胞群;
进一步的,接收盖101与样品芯片间的距离为0-5mm;
进一步的,可向接收盖101内预先加入细胞裂解液、培养液或其他试剂,此举对腔室内形成软着陆表面,降低分选过程中,在接触接收盖101内壁时的冲击损伤;
作为一种举例说明,所述细胞裂解液、培养液或其他试剂的体积为:0.1-100μl;
进一步的,所述接收盖101可预先进行无菌处理,包括但不限于:高压灭菌、强氧化剂浸泡及放射性核素照射等杀菌方法中的一种或者组合;
作为一种优选实施例举例,所述强氧化剂浸泡为:次氯酸钠浸泡;
作为一种优选实施例举例,所述放射性核素照射为:钴-60照射;
步骤二、将所述包含有分选细胞的接收盖101与反应管102组合为器皿100,形成具有一体封闭腔室的细胞收集与反应器;
作为一种举例说明,若在步骤一时没有向接收盖中加入裂解液、培养液或其他试剂或其他溶液,可在接收盖101与反应管102组合之前,向接收盖101中加入上述溶液或试剂;
步骤三、将接收盖101中的细胞或细胞裂解液转移至反应管102中;
通过将组合后的所述器皿100上下翻转,再通过对接收盖101中的细胞或细胞裂解液施加作用力的方法,将所述接收盖101中包含有细胞或细胞内容物的溶液转移至反应管102底部;
作为一种举例说明,所述作用力包括但不限于:离心力、重力、静电力、磁场力中的一种或组合。
步骤四、对反应管102中的细胞或细胞裂解液进行后续实验处理;
作为一种举例说明,所述后续实验处理包括但不限于:聚合酶链式反应、培养、生化分析;
所述步骤四以聚合酶链式反应为例的具体过程为:裂解细胞;加入聚合酶链式反应混合物;进行聚合酶链式反应;对反应产物进行检测。
作为一种举例说明,所述聚合酶链式反应包括:全基因组扩增、全转录组扩增、目标基因片段扩增等涉及聚合酶链式反应的实验;
为了更好的说明本发明的设计原理,现简要介绍其设计依据和设计思路如下:
首先,设计分节式细胞收集器是为了能够方便地拆分和组装,在弹射分选过程中,由于弹射分选仪的接收空间高度有限制,普通的聚合酶链式反应管(PCR管)无法放入其中作为细胞收集容器,故而本发明先行设计出一种分节式细胞收集器,用来接收分选得到的单细胞或细胞群,同时方便地在其中进行聚合酶链式反应等后续实验;
其次,分选结束后,将接收盖101移出分选仪的接收装置,与反应管102组装成分节式细胞收集器,上下翻转后,通过离心等方法将细胞收集盖中的细胞转移至反应管102中;
再次,由于反应管102体积够大,且尺寸、形状与热循环仪相匹配,可方便的在其中直接进行单细胞全基因扩增、单细胞全转录组扩增等后续研究,简化了操作流程,减少转移步骤,可有效防止引入外源污染;
最后,本发明通过优化单细胞全基因扩增反应体系与条件,在提高细胞收集效率的同时,增加了全基因组扩增成功率及覆盖率。
为了更好的说明本发明的应用方法,举例操作实施例如下:
实施例1:使用本器皿100接收细胞并进行聚合酶链式反应;
对本发明之器皿100进行无菌处理;在层流柜中向接收盖101中加入适当体积的裂解液;用镊子夹取接收盖101,放入单细胞弹射分选仪的接收装置中,由于本接收盖高度较低,能够满足单细胞弹射分选仪对细胞收集耗材高度的限制;操作单细胞弹射分选仪,将一个或多个目标细胞分选至接收盖101中;随后将接收盖101移出分选仪,将反应管102倒扣着与接收盖101进行组装,形成密闭的器皿100,从而在细胞转移的过程中可以避免污染;将组装后的器皿100上下颠倒,通过离心原理将该接收盖101中的细胞液转移至反应管102底部(此时所述接收盖101处于反应管102的顶部,自身处于倒扣状),实现分选细胞的高效、无污染转移;再将器皿100放入热循环仪中,高温孵育,使细胞彻底裂解;将器皿100移回至层流柜中,将接收盖101与反应管102分离,向反应管102中加入中和液以及聚合酶链式反应混合液,再重新将接收盖101与反应管102组装成一体,随后将分节式细胞收集器102放入热循环仪中进行相应的聚合酶链式反应;反应结束后,使用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测,数据详见图3所示,其中1为Marker,2-8为分选细胞的全基因组扩增产物,9为阴性对照。
实施例2:基于分节式细胞收集器对弹射分选后的细胞进行全基因组扩增的方法;
对器皿100进行无菌处理,向接收盖101的腔室内中预先加入2μL体积裂解液,用镊子夹取接收盖101,放入单细胞弹射分选仪的接收装置中;操作单细胞弹射分选仪,将目标单细胞依次分选至各个接收盖101中;将接收盖101移出分选仪,并与反应管102组合,形成器皿100;上下翻转器皿100,离心将接收盖101中包含有细胞或细胞内容物的裂解液转移至反应管102底部;将器皿100放入热循环仪中,进行65℃孵育,时长10min,同时设置热盖温度为70℃,使细胞或微生物彻底裂解;向反应管102中加入中和液,轻弹管壁混匀并短暂离心,将体系pH调至中性;随后向反应管102中加入全基因组扩增反应混合物,包括两端随机引物、dNTP、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、无核酸水等成分;再将接收盖101与反应管201重新组合成器皿100,轻弹管壁混匀并短暂离心;将器皿100放入热循环仪中,进行30℃孵育,时长8h,完成全基因组扩增反应,再将温度调至65℃孵育3min,使DNA聚合酶失活;反应结束后,使用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测,数据图表详见图4所示;
本发明采用的优化结构设计,大大增强了细胞弹射分选后细胞收集器皿的使用效果,可满足细胞弹射分选仪对接收高度的限制,又巧妙的解决了聚合酶链式反应对体积的需求;对于弹射分选的细胞可实现在细胞接收器中直接进行全基因组、全转录组扩增等后续研究;简化了操作流程,减少转移步骤,可有效防止引入外源污染;本发明通过优化单细胞全基因扩增反应体系与条件,在提高细胞收集效率的同时,增加了全基因组扩增成功率及覆盖率,且结构简单,方法简明,工作结果高效可靠。
以上所述的仅为本发明的优选实施例,所应理解的是,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿,其特征在于:包括:满足单细胞弹射分选仪接收高度限制的接收盖,接收盖与样品芯片间的距离为0-5mm,以及用于盛装聚合酶链式反应混合物的反应管,接收盖和反应管可以组装与拆分;所述接收盖结构包括:用于接收弹射分选细胞的细胞接收结构;用于与反应管相互连接、定位、密封的连接结构;用于固定在单细胞弹射分选仪接收装置上的固定结构;所述细胞接收结构设置在连接结构的内部;所述连接结构设置在所述固定结构上部;
所述固定结构用于与弹射分选仪的细胞接收装置进行可逆连接与固定;所述固定结构上设计有夹取结构。
2.根据权利要求1所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿,其特征在于,所述连接结构为:柱体、锥体、方体、球体、多面体或多种形状复合体中的一种;所述反应管的形状为柱体、锥体、方体、球体或多种形状的复合体中的一种或组合。
3.根据权利要求1所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿,其特征在于,所述接收盖体积为0.1μl-100μl;反应管的体积为10μl-2000μl。
4.基于权利要求1所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,用于对器皿中分选细胞进行聚合酶链式反应,其特征在于,包括如下具体步骤:
步骤一、使用所述接收盖对弹射分选的细胞进行收集:将接收盖放入单细胞弹射分选仪的接收装置中,操作单细胞弹射分选仪将待测样品中的目标细胞依次分选至一个或多个所述接收盖中;
步骤二、将所述包含有分选细胞的接收盖与反应管组合为器皿,形成具有一体封闭腔室的细胞收集与反应器;
步骤三、将接收盖中的细胞或细胞裂解液转移至反应管中;
步骤四、对反应管中的细胞或细胞裂解液进行后续实验处理。
5.根据权利要求4所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,其特征在于,步骤一的具体过程为:将所述接收盖放入单细胞弹射分选仪的接收装置中,其与分选芯片的距离为0-5mm,操作单细胞弹射分选仪将待测样品中的单细胞或单个微生物依次分选至一个或多个所述接收盖中,每个接收盖可接收单个细胞或由多个细胞组成的细胞群。
6.根据权利要求4所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,其特征在于,所述步骤二的具体过程为:将所述接收盖移出单细胞弹射分选仪,并与反应管组合,形成分节式细胞收集器。
7.根据权利要求4所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,其特征在于,所述步骤三的具体过程为:使用离心方法将接收盖中的细胞或细胞裂解液转移至反应管底部。
8.根据权利要求4所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,其特征在于,所述步骤四对反应管中的细胞或细胞裂解液进行后续实验处理具体过程为:裂解细胞;加入聚合酶链式反应混合物;进行聚合酶链式反应;对反应产物进行检测。
9.根据权利要求4所述的一种细胞弹射分选后用于细胞收集与处理的器皿之应用方法,其特征在于,所述后续实验处理为:聚合酶链式反应、培养、生化分析。
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