CN107299049B - 婴儿的口腔细胞dna提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒，包括口腔细胞采集拭子、保温部件、封装部件；所述口腔细胞采集拭子、保温部件封装于所述封装部件中，还涉及用所述试剂盒提取口腔细胞DNA的方法。本发明有益效果为：口腔细胞采集拭子安全、舒适、高效；取样后在寄送过程中能够持续低温杜绝微生物污染；操作简易，减少拭子暴露时间；得率高，目前市场上的口腔细胞DNA提取试剂盒最多只能从一次采样中提取3ug基因组，若后续需要进行大量基因操作，则要多次采样提取才能满足；本发明在同样采样量的情况下可以获得50ug基因组；是一款专门针对婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒，考虑到婴儿取样、扩增的种种困难，能高效的完成采样、保存与提取等步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒。
背景技术
随着近年来婴儿基因保存、易感基因检测与产前诊断需求的急剧增加，对口腔细胞DNA提取试剂盒的需求也逐年增加。
但是目前市场上的口腔细胞DNA提取试剂盒有如下显著的缺陷：(1)取样拭子简陋，通常使用粗糙的棉棒或者粗糙的化纤刮棒，取样效率不高，难以判断取样效果。(2)拭子取样后在寄送往检测单位过程中容易腐败变质，无法进行后续操作。(3)现行的试剂盒为防止取样拭子腐败变质往往要求将拭子在空气中晾干，此步操作极易引起样品污染。(4)目前市场上的口腔细胞DNA提取试剂盒最多只能从一次采样中提取3ug基因组，若后续需要进行大量基因操作，则要多次采样提取才能满足。(5)目前市场上没有专门针对婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒，因为婴儿口腔细胞采样困难，并且采样量极小，如果用目前市场上的常用的口腔细胞DNA提取试剂盒进行操作，难以得到需要的基因量。
授权公告号为CN 1943517B的发明专利公开了一种口腔粘膜细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒(联合基因生物科技(上海)有限公司)，该发明是一个口腔细胞采集、保存试剂盒，通过取样后立即裂解细胞、失活蛋白来防止腐败，延长了细胞样品保存时间。尽管其技术方案取得了一定的突破，但并未解决取样效率不高、得率低、操作复杂等问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种口腔细胞采集拭子，包括采样头和拭子杆；还包括容纳所述采样头的保存管，所述保存管的管口设有可拆卸的盖体；所述盖体上设有与所述拭子杆外径大小匹配的孔，拭子杆可自由穿过所述孔；所述盖体包括铰接在一起的内盖与外盖，所述内盖的外径与所述保存管管口的内径相匹配，所述外盖的外径与所述孔的直径相匹配。
优选地，所述保存管的材质为聚乙烯，具有较好的刚性强度。
优选地，所述采样头为八边形的片状结构。进一步地，所述八边形为长八边形，即与所述拭子杆平行的一组对边长度大于其他三组对边。
优选地，所述采样头的直径为0.4～0.8mm，远大于普通采样棉签(直径0.2mm)能够大大减少婴儿采样时的不适感，提高采样效率；所述直径具体指采样头垂直于所述拭子杆方向的宽度。
优选地，所述采样头的表面分布有绒毛，绒毛密度细密，易吸附口腔细胞，增加了采样成功率；所述绒毛的长度小于0.5mm。
优选地，所述采样头采用柔软吸水材料制作而成。
优选地，所述拭子杆的长度为200mm，直径为2mm。
采样结束后将采样头置于保存管中，盖紧外盖，再拔出拭子杆，此时采样头携带口腔细胞留在保存管中，再用存管盖内盖封上外盖上的孔，即完成采样。
第二方面，本发明提供一种口腔细胞采集盒，包括所述口腔细胞采集拭子、保温部件、封装部件；所述口腔细胞采集拭子、保温部件封装于所述封装部件中。
优选地，所述保温部件包括冰袋，用于控制温度。进一步地，所述冰袋选自普通市面所售的冰袋，型号包括65mm×65mm。
优选地，所述封装部件包括自封袋。进一步地，所述自封袋具体为铝箔基质自封袋，外涂不透明涂料，涂料有一定隔热效果，是一种增厚隔热自封袋，对冰袋的保温起辅助作用；所述自封袋的型号为14cm×23cm。
使用本发明口腔细胞采集盒采集样品后，带有采集样品的采样头保存在保存管中，保存管与保温冰袋一同放入增厚隔热自封袋中，封上袋口即可保证样品保持-20℃至少8个h。在这段时间里将样品运回检测单位待检。
以上第一方面所述的口腔细胞采集拭子的结构设计、第二方面所述口腔细胞采集盒部件组成设计具备如下有益效果：
1、提出了婴儿专用的口腔细胞采样拭子，大大提高了采样效率；
2、该采集拭子采样过程快，暴露时间短，采样全程不需要借助其他工具即可分离样品与多余的部件，大大减少了污染
3、一体式低温保存设计阻止了样品腐败的发生，无需像同类产品在空气中晾干拭子，减少了空气中微生物污染样品的可能。
第三方面，本发明提供一种口腔细胞DNA提取试剂盒，包括所述口腔细胞采集盒、口腔细胞DNA提取试剂盒。
优选地，所述口腔细胞DNA提取试剂盒包括悬浮缓冲液、裂解液、Phi29DNA聚合酶(Polymerase)、反应缓冲液(Reaction Buffer)。
优选地，所述悬浮缓冲液、裂解液常温保存。
优选地，所述悬浮缓冲液配方为：0.1％吐温-20，NaCl 200mmol/L，KCl 2mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。
优选地，所述裂解液的配方为：DTT 0.1M，Tris-HCl 20mM，盐酸胍5M。
优选地，所述Phi29DNA聚合酶(Polymerase)和反应缓冲液(Reaction Buffer)保存于-10℃～-30℃。进一步优选地，所述Phi29DNA聚合酶(Polymerase)和反应缓冲液(Reaction Buffer)保存于-20℃。
第四方面，本发明提供一种用所述试剂盒进行口腔细胞DNA提取的方法，包括：
第一步，裂解细胞：向装有采样头的保存管内加入悬浮缓冲液，混合；取混合所得混合液加至PCR管，再加入裂解液，混合、加热，制成细胞裂解液；
第二步，扩增基因：向所得细胞裂解液中加入Phi29DNA聚合酶(Polymerase)和反应缓冲液(Reaction Buffer，孵育完成DNA扩增，再次孵育、使酶失活，即可。
优选地，第一步中，向保存管内加入悬浮缓冲液的体积以足够浸没采样头，且保证保存管内液体体积大于采样头体积。进一步优选地，加入悬浮缓冲液的体积为1～2ml，特别优选为1ml。
优选地，第一步中，加入悬浮缓冲液后混合的时间为5～20s。优选为20s。
优选地，第一步中，向PCR管中加入的混合液与裂解液为等体积。优选为5uL。
优选地，第一步中，加入裂解液后混合的时间为5～20s。优选为20s。
优选地，第一步中，所述加热的条件为60～75℃、1～10min。优选为70℃、5min。此处加热的温度越高，所需时间越短，高于70℃时加热所需时间不到5min，70℃时需要加热5min，60℃需要加热10min。
优选地，第二步中，所述孵育的条件为30℃、6～10h。优选为8h，8h后Phi29DNAPolymerase酶基本进入平台期，复制不再进行，产物达到最大浓度。
优选地，第二步中，所述再次孵育的条件为65℃、5min，使酶失活。
以上所述的口腔细胞DNA提取的方法具备如下优势：
1、高效：首次将MDA技术引入“婴儿口腔细胞提取”产品，大大提高了产物得率。
2、省时：原先复杂的先提取再扩增的方法需要人工操作4h以上。本发明提出的“两步法MDA直接扩增技术”只需人工操作20min。
3、原先复杂的先提取再扩增的方法需要20万至100万个细胞才能满足提取要求，本方法只需要采取的细胞量达到1000个即可。
本发明扩增基因使用的主要技术为MDA，关键成分是Phi29DNA聚合酶，为了使得本发明的内容更加的清晰，以下是对MDA与Phi29DNA聚合酶的介绍：
Phi29DNA聚合酶是从一种携带有噬菌体phi29DNA聚合酶基因重组E.coli菌株(AnE.coli strain that carries the phi29DNA Polymerase gene from bacteriophagephi29)中发现的，能够在30℃条件下对DNA进行扩增的酶。这种酶是人们在扩增大的环状DNA模板如质粒或噬菌体DNA时发现了这种酶具有滚环扩增DNA的能力，由Blanco等于1984年率先报道(1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81,5325-5329)。最早该酶被用于扩增环状DNA，称为滚环扩增方法。但是后来发现phi29DNA聚合酶还可以扩增线性DNA(称为多重置换扩增-multiple displacement amplification,MDA)。在MDA中，phi29DNA聚合酶和耐核酸外切酶活性的随机引物，不需要经过PCR热循环过程，只在30℃条件下恒温即可反应。将上述反应中的模板换成人类基因组DNA,发现线性的模板同样也可被扩增，其扩增的机制是一种链置换反应。首先随机6碱基寡核苷酸作为引物在多个位点与基因组模板DNA退火，接下来phi 29 DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，成为一个级联分支的放大***。因此最终可以获得大量高相对分子质量的DNA，因而，这种方法被称为多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)。
Phi29DNA聚合酶扩增具有以下优点：
1、样本无需纯化：可用来进行基因组DNA扩增的样本种类有很多，包括新鲜或水冻的全血、组织培养细胞、口腔拭子细胞、病灶的炎性白膜层等。在多重置换扩增反应中，样本不需要经过纯化，可以直接作为起始模板进行全基因组扩增，并能获得高纯度的DNA产物。传统样本的处理往往要经过费时的步骤，很难实现自动化，限制了高通量的使用。而进行MDA反应的细胞或全血，只要经过简单的裂解步骤就可进行后续的扩增，DNA抽提及各种纯化步骤都省略了，有效避免了处理过程中可能的污染，而且大大简化了操作，特别适用于临床样品的分析和检测。通过MDA扩增10000倍甚至获得更多的DNA，而且比通过传统抽提法得到的样本DNA纯度还要高。这是因为phi29DNA聚合酶高效的活性能确保各种不同的模板有一致的产量。另一方面，如果将0.05L的血液加入到100IxL的MDA反应体系中，血液被稀释了2000倍，一些抑制反应的因素如血液中的血红素或样品添加剂EDTA等，经过这样的稀释后所造成的影响就几乎可以忽略了。所以能确保未经纯化后的样本经过MDA扩增后有较高的纯度，可以直接用于后续的遗传分析研究。
2、产量稳定：基因组DNA经过30℃反应4～6h,MDA扩增达到高峰后维持在一个稳定水平，使所有反应的DNA产量几乎相等。lOOμL的反应体系中，无论起始模板量差别多大(100fg～10ng),扩增后的DNA产量都一致保持在20～30g左右，十分稳定。这种一致的产量在某些方面是很重要的。因为无需对DNA定量，所以允许使用不同起始浓度或数量的样品，并且对下游的遗传分析提供可重复的结果。而传统的方法所产生的基因组DNA，在产量和纯度方面都有显著的不同，在进行基因检测前必须重新测量和调整浓度。而且相对于其他全基因组扩增如PEP法产生大小不一的短片段，MDA能扩增出集中均一的长片段产物。这是因为来自于噬菌体phi29的DNA聚合酶能与DNA模板结合得非常紧密，每次能持续扩增约70000个碱基而不解离，所以能在MDA反应中产生长片段的DNA产物，平均12kb，最长可达100kb。长片段的产物有利于多方面的应用，包括限制性片段长度多态分析，设计探针及DNA测序等方面。
3、对基因组均匀扩增：在许多情况下，全基因组扩增应以最低的位点扩增误差提供尽可能完全的基因组覆盖率，使产物保持模板的遗传序列信息。任何一种扩增方法都会导致一定的序列偏差，导致的因素很多如引物效率、模板的结合力、GC含量、与端粒和着丝粒的远近等。一种全基因组扩增方法是否有效，取决于能否以最小的扩增偏差代表整个基因组的能力。这些基于PCR用于WGA的方法如DOP和PEP，因为在不同位点间存在大范围的偏差，从而限制了这些方法的使用。扩增偏差改变了DNA序列组成的信息，使它在诊断性的检测中成为不可靠的模板。有些情况下，基因组的某些区域完全缺失，导致等位基因丟失和误诊的发生。MDA能使基因组DNA得到均匀的扩增，从而使各个位点达到较完全的覆盖，确保后续遗传分析的准确性。
4、操作简单，不依赖PCR反应：操作比较简单，原始样本(全血、血浆、细胞等)无需纯化，经细胞裂解提取DNA后，加入到Eppendof管的反应液中，包括dNTP、六核苷酸随机引物、phi29DNA聚合酶以及酶緩沖液，然后置于30℃水浴下蜉育4～6h进行多重置换扩增反应，最后65℃8min灭活酶的活性。反应结束后即可产生大量长片段均一、完整的全基因组DNA序列。因为反应在水浴中进行，而不是在热循环仪中，从而避免了PCR反应所带来的非特异性扩增产物，反应体系可以根据需要按比例任意配制。该方法高效、简单，非常适合于临床的遗传分析检测。
尽管上述技术及其优势已被在先技术CN101619364A(检测HPV的方法及Phi29DNA聚合酶在检测HPV中的应用)公开，但是具体到婴儿的口腔细胞DNA，是无法进行借鉴、应用的，这是是目前应用的难题，因此本发明将上述技术在婴儿的口腔细胞DNA中的应用从而实现优异的效果，是付出了大量的创造性的劳动的。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)口腔细胞采集拭子安全、舒适、高效；
(2)口腔细胞采集拭子取样后在寄送往检测单位过程中能够持续低温杜绝微生物污染；
(3)操作简易无需晾干拭子，减少拭子暴露时间；
(4)得率高，目前市场上的口腔细胞DNA提取试剂盒最多只能从一次采样中提取3ug基因组，若后续需要进行大量基因操作，则要多次采样提取才能满足；本发明在同样采样量的情况下可以获得50ug基因组；
(5)这是一款专门针对婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒，考虑到婴儿取样、扩增的种种困难，能高效的完成采样、保存与提取等步骤。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为口腔细胞采集拭子结构示意图；其中，1是保存管，2是采样头，3是盖体，31是外盖，32是内盖，4是拭子杆，5是孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种口腔细胞采集拭子，结构见图1所示，包括采样头2和拭子杆4；还包括容纳所述采样头2的保存管1，所述保存管1的管口设有可拆卸的盖体3；所述盖体3上设有与所述拭子杆4外径大小匹配的孔5，拭子杆4可自由穿过所述孔5；所述盖体3包括铰接在一起的内盖32与外盖31，所述内盖32的外径与所述保存管1管口的内径相匹配，所述外盖31的外径与所述孔5的直径相匹配。
上述结构中，所述保存管1的材质为聚乙烯，刚性强度较好；所述采样头2为八边形的片状结构，直径为0.8mm，采用柔软吸水材料制作而成；所述采样头2的表面分布有细密的绒毛，绒毛的长度为0.3mm，易吸附口腔细胞，增加了采样成功率；所述拭子杆4的长度为200mm，直径为2mm。
需要说明的，本发明提供的口腔细胞采集拭子，采样头的直径为0.4～0.8mm中的任意值均可，绒毛的长度小于0.5mm即可。
在使用本实施例提供的口腔细胞采集拭子采样结束后，将采样头2置于保存管1中，盖紧外盖31，再拔出拭子杆4，此时采样头2携带口腔细胞样品留在保存管1中，再用内盖32封上外盖31上的孔5，即可。
实施例2
本实施例提供一种口腔细胞采集盒，包括实施例1所述的口腔细胞采集拭子、保温部件、封装部件；所述口腔细胞采集拭子、保温部件封装于所述封装部件中；
其中，所述保温部件为市售常见冰袋，用于控制温度，防止样品高温腐蚀；所述封装部件主要用于盛装冰袋和口腔细胞采集拭子，一般采用自封袋，涂有不透明涂料的铝箔基质自封袋具有一定隔热效果，可以辅助冰袋进行温度控制。
使用本实施例的口腔细胞采集盒采集样品后，含有采样头的保存管与冰袋一同放入自封袋中，封上袋口即可保证样品保持-20℃至少8h。这段时间足以将样品运回检测单位待检。
实施例3
本实施例提供一种婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒：包括实施例2所述口腔细胞采集盒、口腔细胞DNA提取试剂盒；其中，所述口腔细胞DNA提取试剂盒包括悬浮缓冲液、裂解液、Phi29DNA聚合酶(Polymerase)、反应缓冲液(Reaction Buffer)；
所述悬浮缓冲液配方为：0.1％吐温-20，NaCl 200mmol/L，KCl 2mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO4 2mmol/L；所述裂解液的配方为：DTT 0.1M，Tris-HCl 20mM，盐酸胍5M；一般情况下，所述悬浮缓冲液、裂解液常温保存；
所述Phi29DNA聚合酶(Polymerase)和反应缓冲液(Reaction Buffer)保存于-10℃～-30℃，保存于-20℃更佳。
实施例4
本实施例提供一种利用实施例3试剂盒进行婴儿口腔细胞DNA提取DNA的方法，整个流程如下：
1、将口腔细胞采集盒部分由采样人员分发给受试者；口腔细胞DNA提取试剂盒部分根据实施例3所列条件进行保存。
2、预冷口腔细胞采集盒中冰袋10h(-20℃以下预冷，优选-30℃)，采样4个月龄婴儿。
用采样头2在婴儿口两侧腔壁上刮擦1～5次(优选5次及以上)，将采样头2放入保存管1，盖紧外盖31，拔出拭子杆4，再盖紧内盖32。取样时间约5min(优选2min以内)。
3、将装有采样头2的保存管1放与保温冰袋一同放入增厚隔热自封袋中，封上袋口将样品送往实验室，可在常温下放置8～14h(优选8h以内送往检测实验室)，用口腔细胞DNA提取试剂盒进行DNA提取；如不能立即操作，则将保存管放置于冰箱-20℃冷冻层保存，可储存一个月(优选2周以内进行提取)
4、实验室收到样品后向装有采样头2的保存管1内加入1mL悬浮缓冲液，混合10s；取出5uL加入5uL裂解液混合10s，70℃加热1～10min(优选5min)，制成细胞裂解液。
5、向10uL细胞裂解液中加入Phi29DNA Polymerase和反应缓冲液，30℃孵育6～10h(优选8h)，即完成扩增反应。之后，65℃孵育产物5min，使酶失活。
6、检测产物浓度为1800ng/uL，共50uL。即获得基因组DNA 90ug。
本实施例提供的提取方法，与现有技术相比，具有如下的有益效果：(1)口腔细胞采集拭子安全、舒适、高效；(2)口腔细胞采集拭子取样后在寄送往检测单位过程中能够持续低温杜绝微生物污染；(3)操作简易无需晾干拭子，减少拭子暴露时间；(4)得率高，目前市场上的口腔细胞DNA提取试剂盒最多只能从一次采样中提取3ug基因组，若后续需要进行大量基因操作，则要多次采样提取才能满足；本发明在同样采样量的情况下可以获得50ug基因组；(5)这是一款专门针对婴儿的口腔细胞DNA提取试剂盒，考虑到婴儿取样、扩增的种种困难，能高效的完成采样、保存与提取等步骤。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种口腔细胞采集拭子，其特征在于，包括采样头(2)和拭子杆(4)；还包括容纳所述采样头(2)的保存管(1)，所述保存管(1)的管口设有可拆卸的盖体(3)；所述盖体(3)上设有与所述拭子杆(4)外径大小匹配的孔(5)，拭子杆(4)可自由穿过所述孔(5)；所述盖体(3)包括铰接在一起的内盖(32)与外盖(31)，所述内盖(32)的外径与所述保存管(1)管口的内径相匹配，所述外盖(31)的外径与所述孔(5)的直径相匹配；所述采样头为八边形的片状结构，所述八边形为长八边形，所述拭子杆平行的一组对边长度大于其他三组对边；采样头的直径为0.4～0.8mm。
2.一种口腔细胞采集盒，其特征在于，包括权利要求1所述的口腔细胞采集拭子、保温部件和封装部件；所述口腔细胞采集拭子和保温部件封装于所述封装部件中。
3.一种口腔细胞DNA提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的口腔细胞采集盒和口腔细胞DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求3所述的口腔细胞DNA提取试剂盒，其特征在于，所述口腔细胞DNA提取试剂盒包括悬浮缓冲液、裂解液、Phi29 DNA聚合酶和反应缓冲液。
5.一种用权利要求4所述试剂盒进行口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，包括：
第一步，裂解细胞：向装有采样头的保存管内加入悬浮缓冲液，混合；取混合所得混合液加至PCR管，再加入裂解液，混合、加热，制成细胞裂解液；
第二步，扩增基因：向所得细胞裂解液中加入Phi29 DNA聚合酶和反应缓冲液，孵育完成DNA扩增，再次孵育、使酶失活，即可。
6.根据权利要求5所述的口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，第一步中，加入悬浮缓冲液后混合的时间为5～20s。
7.根据权利要求5所述的口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，第一步中，加入裂解液后混合的时间为5～20s。
8.根据权利要求5所述的口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，第一步中，所述加热的条件为60～75℃、5～10min。
9.根据权利要求5所述的口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，第二步中，所述孵育的条件为30℃、6～10h。
10.根据权利要求5所述的口腔细胞DNA提取的方法，其特征在于，第二步中，所述再次孵育的条件为65℃、5min。
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