CN109734677A - 抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶nsd2的小分子化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学医药领域，具体涉及抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其通式如下：通过该小分子化合物的一些实施方案证实，该小分子化合物对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2有较好的抑制作用，同时对肿瘤细胞具有很好的抑制作用，可将其制成抑制剂，能够作为制备治疗癌症药物进行使用；本发明制备得到的化合物生物活性较高，对肿瘤细胞的选择性强，类药性显著，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成药物技术领域，具体是指一种抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物及其应用。
背景技术
组蛋白的甲基化修饰由组蛋白甲基转移酶(PMTs)所介导，此类转移酶能够催化甲基从辅因子S-5’-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)到组蛋白赖氨酸或精氨酸残基上的转移。根据发生甲基化的氨基酸残基的不同，组蛋白甲基转移酶可分为两类：组蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)和组蛋白赖氨酸甲基转移酶(PKMTs)。在赖氨酸或精氨酸残基上发生的甲基化修饰不会改变残基的电荷性，但是会改变蛋白质的大小和疏水性，从而影响蛋白质之间的相互作用。
核受体结合SET结构域蛋白NSD家族是属于SET2家族的一组与肿瘤发生密切相关的赖氨酸甲基转移酶，该家族包括三个成员：NSD1、NSD2(MMSET/WHSC1)和NSD3(WHSC1L1)。NSD蛋白家族成员的结构非常相似，都含有SET、PWWP和PHD结构域。NSD2即核受体结合SET结构域蛋白2，是一种与许多人类肿瘤的发生、发展相关的组蛋白赖氨酸甲基转移酶。一系列实验结果证实了NSD2在参与基因转录激活过程中会特异性地催化H3K36me和H3K36me2，而H3K36me2是NSD2发挥其生理功能的主要产物。NSD2的过表达则与许多人类疾病尤其是肿瘤的发生、发展相关。由于NSD2是染色质结构和转录的主要调节者，其过表达会导致基因组H3K36me2水平异常增高，同时伴随有H3K37甲基化水平的显著下降，从而影响大量基因的转录水平。
同时研究表明NSD2的过表达会加速肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡，同时会促进肿瘤细胞的转移。Min等发现，NSD2可以刺激c-MYC的表达，从而提升多发性骨髓瘤细胞的增殖能力。在***癌细胞中，NSD2的表达水平明显高于正常***细胞。NSD2能够通过激活TWIST1，促进EMT的发生，增加***癌细胞的侵袭能力。NSD2还能与雄激素受体(AR)结合，促进相关基因的表达，从而增加***特异抗原(PSA)的产生，促进***癌的发生。另外，在神经胶质瘤、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中也能检测到NSD2的过表达。因此核受体结合SET结构域蛋白NSD2被认为是一种重要的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，它在许多肿瘤包括多发性骨髓瘤、***癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肺癌等的发生、发展中起到了重要的作用。现目前对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的研究还十分有限，还未见有关于组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2针对疾病治疗方面的相关报道，更无高活性的NSD2小分子抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物。
本发明的另一个目的在于提供一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制剂。
本发明还有一个目的在于提供一种活性较高，选择性强，类药性显著的治疗癌症的药物。
本发明提供抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其通式如下：
其中，
A为独立的含有至多一个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环或含有至多一个氮原子的芳环或含有一个氧原子、一个氮原子的六元杂环；
B为独立的含有最多三个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环或含有至多两个氮原子的芳环或含有一个氮原子的六元杂环；
R1为独立的H、甲基、新丁基、硝基、羧基、醚键、肽键、酯键、卤素、
R2为独立的H、甲基、新丁基、硝基、羧基、醚键、肽键、酯键、卤素、
R3为独立的H、O、甲基或不存在；
R4为独立的H、O、甲基或不存在；
R5为独立的H、O、甲基或不存在。
鉴于目前尚无高活性的NSD2小分子抑制剂，本发明通过在对现有的甲基转移酶抑制剂进行结构分析后，结合高通量筛选，我们发现这化合物：1-(1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三氮唑-5-)-3-(3-硝基苯基)脲，对NSD2的IC50分别为8.3μM。对这该化合物的结构进行分析，我们设计并合成了包含苯并杂环类双环结构系列化合物来对它们进行结构优化。获取了更高活性的NSD2抑制剂小分子结构。
具体包括以下结构：
上述小分子化合物具有抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的效果，因而可以以该系列小分子化合物作为主要活性成分制备得到抑制蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制剂中，而NSD2在参与基因转录激活过程中会特异性地催化H3K36me和H3K36me2，H3K36me2是NSD2发挥其生理功能的主要产物。NSD2的过表达则与许多人类疾病尤其是肿瘤的发生、发展相关。由于NSD2是染色质结构和转录的主要调节者，其过表达会导致基因组H3K36me2水平异常增高，同时伴随有H3K37甲基化水平的显著下降，从而影响大量基因的转录水平。同时NSD2的过表达会加速肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡，同时会促进肿瘤细胞的转移。Min等发现，NSD2可以刺激c-MYC的表达，从而提升多发性骨髓瘤细胞的增殖能力。在***癌细胞中，NSD2的表达水平明显高于正常***细胞。NSD2能够通过激活TWIST1，促进EMT的发生，增加***癌细胞的侵袭能力。NSD2还能与雄激素受体(AR)结合，促进相关基因的表达，从而增加***特异抗原(PSA)的产生，促进***癌的发生。另外，在神经胶质瘤、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中也能检测到NSD2的过表达。因此核受体结合SET结构域蛋白NSD2被认为是一种重要的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，它在许多肿瘤包括多发性骨髓瘤、***癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肺癌等的发生、发展中起到了重要的作用。因此该小分子化合物能够直接作为制备治疗癌症药物的主要活性成分使用，也可以将其制备成抑制剂，该抑制剂能够直接被作为治疗癌症的药物使用，或者作为治疗癌症药物的主要活性成分来使用，重点针对的癌症有包括***癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明合成了一种新的能够抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分化合物，并证实了该小分化合物的一些实施方案中，能够对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2产生较好的抑制作用，同时对肿瘤细胞具有很好的抑制作用，具有很好的药用潜力，为临床用药提供了一种新的潜在选择；同时，本发明提供的新化合物的制备方法简便，反应条件温和，便于操作和控制，能耗小，产率高，成本低，可适合产业化生产，制备得到的化合物生物活性较高，对肿瘤细胞的选择性强，类药性显著，具有广阔的市场前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更为明显：
图1为本发明中化合物22抑制***癌细胞22Rv-1的增殖抑制折线图；
图2为本发明中化合物22在在22Rv-1细胞内抑制H3K36的甲基化效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明，此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
化合物1：化合物N-环丙基-3-(3-(1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三氮唑-5)脲基)苯磺酰胺
合成路线如下：
具体合成步骤如下：
在0℃条件下，将N-甲基-4-硝基苯-1,2-二胺(A01a)(1.13g，6.76mmol)分散于22ml水中，然后加入5.6ml浓盐酸形成强酸性混合物后滴入溶于10ml的亚硝酸钠(568mg,8.23mmol)水溶液。保持0℃条件搅拌4小时后慢慢升至室温，过滤并用冷水洗涤滤饼，得到灰白色的化合物为5-硝基苯并(1-甲基)三氮唑(A01b)。
然后将A01b(950mg,5.3mmol)分散于约50ml EtOH:H2O＝2:1的溶剂体系里，加入氯化铵(570mg,10.6mmol)后升温，在温度升至60℃时加入铁粉(1190mg,21.2mmol)，继续升温至80℃回流反应。2h后停止反应，反应液冷却至室温，抽滤后用无水乙醇洗涤，将所得滤液减压蒸馏除去溶剂后，用饱和碳酸氢钠溶液(200ml)和二氯甲烷(200ml×2)萃取，再用纯水(200ml)洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥后减压蒸馏除去溶剂得到中间体(A01c)。
将3-氨基-N-环丙基苯磺酰胺(A01d)(180mg，0.85mmol)与1滴三乙胺溶解于约30ml甲苯中，在-5℃条件下缓慢滴入由10ml溶解的三光气(A01e)(252mg，0.85mmol)中，滴完之后，将反应液移至常温搅拌半个小时后升温至110℃回流反应，3小时后反应完全，将反应液减压蒸馏除去溶剂，所得固体混悬于乙酸乙酯中，抽滤后将滤液减压蒸馏除去溶剂得到中间体异氰酸酯，将该中间体与所合成的中间体5-氨基苯并(1-甲基)三氮唑(A01c)(63mg，0.42mmol)溶解于30ml 1,4-二氧六环中，升温至100℃反应。2小时后反应完毕，将得到的浑浊溶液直接抽滤，并用二氯甲烷洗的滤饼，得到灰白色固体(化合物1，95mg)。产率为58.0％。
化合物1的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)387.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),8.97(s,1H),8.20(d,J＝1.2Hz,1H),8.12(s,1H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.8Hz,1H),7.63(d,J＝9.2Hz,1H),7.57–7.48(m,2H),7.41(d,J＝7.6Hz,1H),4.28(s,3H),2.15-2.11(m,1H),0.50-0.47(m,2H),0.45–0.37(m,2H).
实施例2：
化合物2：N-环丙基-3-(3-(1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三氮唑-5)脲基)苯甲酰胺
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物2，产率为61。2％。
化合物2的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)351.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.89(s,1H),8.41(d,J＝3.6Hz,1H),8.20(s,1H),7.86(s,1H),7.77(d,J＝8.8Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.40(d,J＝7.6Hz,1H),7.35(t,J＝7.6Hz,1H),4.28(s,3H),2.91–2.79(m,1H),0.73–0.66(m,2H),0.58-0.57(m,2H).
实施例3：
化合物3：1-(1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三氮唑-5)-3-(3-(吗啉-4-羰基)苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物3，产率为68.3％。
化合物3的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)381.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.96(s,1H),8.90(s,1H),8.19(d,J＝1.2Hz,1H),7.77(d,J＝8.8Hz,1H),7.60(s,1H),7.54–7.43(m,2H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H),7.01(d,J＝7.6Hz,1H),4.27(s,3H),3.61(s,8H).
实施例4：
化合物4：1-(3-氟-5-硝基苯基)-3-(1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三氮唑-5)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物4，产率为70.5％。
化合物4的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)331.0[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),9.18(s,1H),8.29(s,1H),8.18(d,J＝1.2Hz,1H),7.83–7.75(m,2H),7.72–7.65(m,1H),7.56(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),4.28(s,3H).
实施例5：
化合物5：1-(苯并[d]噻唑-6-)-3-(3-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物5，产率为53.1％。
化合物5的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)315.0[M+H]+1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δAo9.33(s,1H),9.24(s,1H),9.15(s,1H),8.61(s,1H),8.41(s,1H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.0Hz,1H),7.73(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(t,J＝8.0Hz,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,1H).
实施例6：
化合物6：1-(苯并[d]噻唑-5-)-3-(3-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物6，产率为56.5％。
化合物6的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)315.0[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.37(s,1H),9.32(s,1H),9.11(s,1H),8.59(s,1H),8.34(d,J＝1.6Hz,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(t,J＝8.0Hz,1H),7.52(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H).
实施例7：
化合物7：1-(1H-吲哚-6-)-3-(3-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物7，产率为61.6％。
化合物7的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)297.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H),9.12(s,1H),8.59(d,J＝6.8Hz,2H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.71(d,J＝7.2Hz,2H),7.56(t,J＝8.0Hz,1H),7.33(s,1H),7.31(s,1H),7.10(d,J＝8.4Hz,1H),6.37(s,1H).
实施例8：
化合物8：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-硝基苯基)脲
合成路线如下：
具体合成步骤如下：
利用所合成的中间体6-氨基[1,2,3]苯并噻二唑(B)和3-硝基苯胺(A05b)，合成终产物1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-硝基苯基)脲(A08)。中间体B的合成方法为：将6-硝基苯并噻唑(A08a)(15g,83mmol)混悬于200ml无水乙醇中，加入20ml水合肼后加热回流反应。2h后，反应液从黄色浑浊状变为红棕色溶液，将反应液冷却至30℃时加入18ml30％过氧化氢，并用冰水浴使温度维持不变，反应液中形成黄色沉淀物，搅拌一小时后抽滤，用水和***洗涤后干燥，得到化合物(2-氨基-5-硝基苯基)二硫化物(A08b)。然后将化合物A08b(10g,29mmol)分散于70ml浓硫酸中，在0℃时，分次加入亚硝酸钠(5.1g,74mmol)，同时使反应温度保持在10℃以下。加完亚硝酸钠后，使反应温度升至室温，搅拌反应15个小时后反应完毕，将反应液倒入400ml冰水中，搅拌1小时候后，过滤得黄色固体，用水和***洗涤后得到化合物6-硝基[1,2,3]苯并噻二唑(A08c)。化合物A08c(9g,50mmol)和氯化铵(5.3g,99mmol)分散于EtOH:H2O＝2:1的溶剂体系里，在温度升至60℃时加入铁粉(11.1g,199mmol)，继续升温至80℃回流反应。2h后停止反应，反应液冷却至室温，抽滤并用无水乙醇洗涤，将所得滤液减压蒸馏除去溶剂后，用饱和碳酸氢钠溶液(200ml)和二氯甲烷(200ml×2)萃取，再用纯水(200ml)洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥后减压蒸馏除去溶剂得到中间体B(7.8g,产率86.7％)。后续具体步骤参照终产物A01的合成方法，制备得到化合物8，产率为57.8％.
化合物8的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)316.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),9.46(s,1H),8.66(s,1H),8.62(s,1H),8.59(s,1H),7.87(d,J＝7.2Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.4Hz,1H),7.61(t,J＝8.0Hz,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ153.79,152.24,148.10,142.16,140.76,140.54,130.10,124.55,123.57,119.74,116.72,112.41,106.80.
实施例9：
化合物9：1-(3-硝基苯基)-3-(喹啉-7-)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物9，产率为68.2％。
化合物9的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)309.1[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),9.90(s,1H),9.00(dd,J＝4.8,1.2Hz,1H),8.67(d,J＝8.0Hz,1H),8.61(t,J＝2.0Hz,1H),8.49(d,J＝1.2Hz,1H),8.11(d,J＝8.8Hz,1H),7.88(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.78(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.74(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.66-7.59(m,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ152.35,148.13,147.60,144.02,142.64,140.56,130.17,129.39,124.34,124.20,121.22,119.43,116.70,112.18,109.33。
实施例10：
化合物10：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-氯苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物10，产率为57.1％。
化合物10的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)305.1[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),9.10(s,1H),8.60(d,J＝1.8Hz,1H),8.58(d,J＝9.0Hz,1H),7.74(s,1H),7.68(dd,J＝9.0,1.8Hz,1H)7.35–7.30(m,2H),7.11–6.96(m,1H).MS(ESI)305.1[M+H]+.
实施例11：
化合物11：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-甲氧基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物11，产率为59.6％。
化合物11的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)301.0[M+H]+；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.32(s,1H),8.90(s,1H),8.61(d,J＝1.8Hz,1H),8.57(d,J＝9.0Hz,1H),7.66(dd,J＝9.0,1.8Hz,1H),7.23(dd,J＝4.2,2.4Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),6.97(d,J＝7.8Hz,1H),6.60(dd,J＝7.8,2.4Hz,1H),3.74(s,3H).
实施例12：
化合物12：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-氰基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物12，产率为62.3％。
化合物12的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)318.3[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),9.25(s,1H),8.60(d,J＝8.8Hz,2H),8.01(s,1H),7.72(t,J＝8.8Hz,2H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H).
实施例13：
化合物13：N-(3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)苯基)乙酰胺
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物13，产率为50.1％。
化合物13的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)350.2[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.94(s,1H),9.24(s,1H),8.94(s,1H),8.58(d,J＝2.4Hz,1H),8.57(s,1H),7.82(s,1H),7.67(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),7.19(s,1H),2.04(s,3H).
实施例14：
化合物14：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-(吗啉-4-羰基)苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物14，产率为70.1％。
化合物14的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)406.0[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),9.05(s,1H),8.60(s,1H),8.57(s,1H),7.69(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.61(s,1H),7.50(d,J＝9.2Hz,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.04(d,J＝7.6Hz,1H),3.61(s,8H).
实施例15：
化合物15：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-N-环丙基苯磺酰胺
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物15，产率为69.5％。
化合物15的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)412.2[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.41(s,1H),9.28(s,1H),8.63(d,J＝1.6Hz,1H),8.59(d,J＝8.8Hz,1H),8.15(s,1H),7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.70(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.63(d,J＝8.8Hz,1H),7.54(t,J＝8.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),2.13(td,J＝6.8,3.2Hz,1H),0.53–0.45(m,2H),0.45–0.37(m,2H).
实施例16：
化合物16：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-N-环丙基苯甲酰胺
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物16，产率为67.3％。
化合物16的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)376.2[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.37(s,1H),9.05(s,1H),8.62(d,J＝1.6Hz,1H),8.59(d,J＝9.2Hz,1H),8.43(d,J＝4.0Hz,1H),7.90(s,1H),7.69(dd,J＝9.2,1.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,1H),2.85(td,J＝7.2,4.0Hz,1H),0.74–0.64(m,2H),0.62–0.51(m,2H).
实施例17：
化合物17：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3,5-双(三氟甲基)苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物17，产率为47.8％。
化合物17的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)407.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),9.61(s,1H),8.67(s,1H),8.61(d,J＝9.2Hz,1H),8.19(s,2H),7.73(s,1H),7.71(s,1H).
实施例18：
化合物18：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物18，产率为57.6％。
化合物18的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)417.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.61(s,1H),9.41(s,1H),8.64(s,1H),8.60(d,J＝8.8Hz,1H),7.99(s,1H),7.94(s,1H),7.70(d,J＝9.2Hz,1H),7.57(s,1H).
实施例19：
化合物19：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-氟-5-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物19，产率为56.6％。
化合物19的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)356.1[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.64(s,1H),9.62(s,1H),8.64(d,J＝1.6Hz,1H),8.60(d,J＝8.8Hz,1H),8.33(s,1H),7.77(d,J＝10.8Hz,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,2H).
实施例20：
化合物20：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-5-硝基苯甲酸甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物20，产率为58.8％。
化合物20的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)396.2[M+Na]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.71(s,1H),9.60(s,1H),8.71(t,J＝2.0Hz,1H),8.67(d,J＝2.0Hz,1H),8.60(d,J＝8.8Hz,1H),8.46(s,1H),8.26(d,J＝1.2Hz,1H)7.72(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),3.94(s,3H).
实施例21：
化合物21：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-5-氟苯甲酸甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物21，产率为53.9％。
化合物21的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)369.1[M+Na]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),9.39(s,1H),8.63(d,J＝1.6Hz,1H),8.60(d,J＝9.2Hz,1H),7.97(s,1H),7.73–7.65(m,2H),7.33(d,J＝9.2Hz,1H),3.88(s,3H).
实施例22：
化合物22：5-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)间二苯甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物22，产率为51.3％。
化合物22的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)387.2[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(d,J＝3.2Hz,2H),8.67(s,1H),8.60(d,J＝9.2Hz,1H),8.39(s,2H),8.13(s,1H),7.71(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),3.91(s,6H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.55,159.02,157.52,147.40,146.07,146.02,145.61,135.93,128.75,128.16,125.04,112.15,112.06,57.75.
实施例23：
化合物23：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-5-溴苯甲酸甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物23，产率为59.4％。
化合物23的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)429.3[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(s,1H),9.35(s,1H),8.63(d,J＝1.6Hz,1H),8.59(d,J＝9.2Hz,1H),8.12(s,1H),8.01(t,J＝1.6Hz,1H),7.71(d,J＝2.0Hz,1H),7.70–7.67(m,1H),3.88(s,3H).
实施例24：
化合物24：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(2-溴-5-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物24，产率为57.7％。
化合物24的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)394.0[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.31(s,1H),9.11(d,J＝2.8Hz,1H),8.73(s,1H),8.71(d,J＝1.6Hz,1H),8.63(d,J＝8.8Hz,1H),7.97(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.69(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H).
实施例25：
化合物25：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(4-甲基-3-硝基苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物25，产率为67.7％。
化合物25的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)330.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(s,1H),9.29(s,1H),8.64(d,J＝2.0Hz,1H),8.60(d,J＝9.2Hz,1H),8.35(d,J＝2.4Hz,1H),7.70(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.60(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,1H),2.48(s,3H).
实施例26：
化合物26：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(5-(叔丁基)异恶唑-3-)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物26，产率为68.1％。
化合物26的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)340.1[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.73(s,1H),9.42(s,1H),8.60(s,1H),8.61(d,J＝8.8Hz,1H),7.69(d,J＝9.2Hz,1H),6.54(s,1H),1.31(s,9H).
实施例27：
化合物27：2-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)噻唑-4-甲酸乙酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物27，产率为48.2％。
化合物27的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)350.6[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.19(s,1H),9.61(s,1H),8.67(s,1H),8.63(d,J＝8.8Hz,1H),8.03(s,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,1H),4.28(q,J＝6.4Hz,2H),1.30(t,J＝6.4Hz,3H).
实施例28：
化合物28：2-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)噻吩-3-羧酸甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物28，产率为57.1％。
化合物28的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)335.7[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.90(s,1H),10.63(s,1H),8.71(d,J＝2.0Hz,1H),8.62(d,J＝9.2Hz,1H),7.69(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.17(d,J＝5.6Hz,1H),6.97(d,J＝6.0Hz,1H),3.87(s,3H).
实施例29：
化合物29：3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物29，产率为51.9％。
化合物29的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)371.1[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),8.75(s,1H),8.60(d,J＝2.8Hz,1H),8.58(s,1H),7.68(dd,J＝9.2,1.6Hz,1H),7.57(s,1H),3.80(s,3H),2.15(s,3H).
实施例30：
化合物30：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(6-氯吡啶-3-)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物30，产率为61.6％。
化合物30的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)306.3[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),9.23(s,1H),8.60(d,J＝2.4Hz,1H),8.59(s,1H),8.53(d,J＝2.8Hz,1H),8.02(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.70(dd,J＝9.2,1.6Hz,1H),7.47(d,J＝8.4Hz,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ153.79,152.25,142.70,142.16,140.80,139.83,135.64,129.24,124.11,123.60,119.70,106.74
实施例31：
化合物31：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(6-溴吡啶-3-)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物31，产率为60.1％。
化合物31的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)351.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),9.23(s,1H),8.60(d,J＝8.0Hz,2H),8.52(s,1H),7.93(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(d,J＝9.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H).
实施例32：
化合物32：1-(3-(5-乙酰基噻吩-2-)-5-三氟甲基苯基)-3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲
合成路线如下：
具体合成步骤如下：
将所合成的化合物1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲(B16)(85mg,0.20mmol)、5-乙酰基-2-噻吩硼酸(B31f)(52mg,0.30mmol)、K2CO3(84mg,0.60mmol)和Pd(PPh3)4(24mg,0.02mmol)混悬于3ml DMF和1ml H2O中，将反应体系用N2置换三次后置于80℃反应，5小时后反应液的颜色从黄色变为黑色，减压蒸馏除去反应液中的溶剂后，得到含大量盐的混合物，将所得混合物经柱层析法纯化(流动相梯度：二氯甲烷/甲醇＝50/1)再经乙酸乙酯和石油醚重结晶得乳白色终产物(化合物32，32mg)。产率为：34.7％。
化合物32的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)463.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(s,1H),9.42(s,1H),8.69(d,J＝1.6Hz,1H),8.60(d,J＝9.2Hz,1H),8.10(s,1H),8.01(d,J＝4.0Hz,1H),7.97(s,1H),7.82(d,J＝4.0Hz,1H),7.77(s,1H),7.71(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),2.58(s,3H).
实施例33：
化合物33：1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)-3-(3-(吡啶-3-)-5-(三氟甲基)苯基)脲
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物33，产率为42.2％。
化合物33的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)416.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(s,1H),9.93(s,1H),8.95(d,J＝13.2Hz,1H),8.70-8.58(m,2H),8.16-8.00(m,2H),8.01(s,1H),7.75–7.51(m,4H).
实施例34：
化合物34：3-丙烯酰胺基-5-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)苯甲酸甲酯
合成路线如下：
具体合成步骤如下：
将所合成的化合物3-(3-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-)脲基)-5-硝基苯甲酸甲酯(B18)(50mg,0.13mmol)和NH4Cl(14mg,0.26mmol)分散于EtOH:H2O＝2:1的溶剂体系里，在温度升至60℃时加入铁粉(30mg,0.52mmol)，继续升温至80℃回流反应。2h后停止反应，反应液冷却至室温，抽滤并用无水乙醇洗涤，将所得滤液减压蒸馏除去溶剂后，用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)和二氯甲烷(30ml×2)萃取，再用纯水(50ml)洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥后减压蒸馏除去溶剂得到对应的氨基中间体，将该中间体溶解于10ml四氢呋喃(THF)中，常温下加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA,33mg，0.26mmol)，溶解完全后加入丙烯酰氯(B07f)(12mg,0.13mmol)，常温反应1小时后，加入2ml饱和碳酸氢钠水溶液淬灭多余的丙烯酰氯，减压蒸馏除去反应液中的四氢呋喃，加入水(20ml)和二氯甲烷(2×20ml)萃取，有机层用无水硫酸镁干燥后减压蒸馏除去溶剂，得到褐色粗品，后经柱层析法纯化(流动相梯度：二氯甲烷/甲醇＝50/1)再经乙酸乙酯和石油醚重结晶得白色终产物(化合物34，18mg)。产率为：35.3％。
化合物34的MS(ESI)数据如下：
MS(ESI)420.5[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),9.31(s,1H),9.26(s,1H),8.63(s,1H),8.59(d,J＝9.2Hz,1H),8.15(s,1H),7.98(s,1H),7.95(s,1H),7.70(d,J＝8.8Hz,1H),6.45(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.30(d,J＝17.0Hz,1H),6.18(dd,J＝17.2,10.0Hz,1H),3.87(s,3H).
实施例35：
化合物35：5-(3-(喹啉-5-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤如下
将5-氨基间苯二甲酸二甲酯(D01a)(0.85mmol)与1滴三乙胺溶解于约30ml甲苯中，在-5℃条件下缓慢滴入由10ml溶解的三光气(0.85mmol)中，滴完之后，将反应液移至常温搅拌半个小时后升温至110℃回流反应，3小时后反应完全，将反应液减压蒸馏除去溶剂，所得固体混悬于乙酸乙酯中，抽滤后将滤液减压蒸馏除去溶剂得到中间体3,5-双(甲氧基羰基)异氰酸苯酯(D01b)，将该中间体与5-氨基喹啉(D01c)(0.42mmol)溶解于30ml 1,4-二氧六环中，升温至100℃反应。2小时后反应完毕，将得到的浑浊溶液直接抽滤，并用二氯甲烷洗的滤饼，得到灰白色固体(化合物35，81mg)。
制备得到化合物35，产率为52％。
化合物35的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.58(s,1H),9.33(s,1H),8.94(s,1H),8.60(d,J＝6.0Hz,1H),8.38(d,J＝1.4Hz,2H),8.23(d,J＝7.1Hz,1H),8.12(d,J＝1.4Hz,1H),7.94(d,J＝6.1Hz,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.68(t,J＝7.9Hz,1H),3.91(s,6H).
实施例36：
化合物36：5-(3-(喹喔啉-6-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物36，产率为55％。
化合物37的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.47(s,1H),9.38(s,1H),8.87(d,J＝1.8Hz,1H),8.79(d,J＝1.9Hz,1H),8.39(d,J＝1.5Hz,2H),8.33(d,J＝2.3Hz,1H),8.13(t,J＝1.5Hz,1H),8.03(d,J＝9.1Hz,1H),7.88(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),3.91(s,6H).
实施例37：
化合物37：5-(3-(喹啉-8-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物37，产率为57％。
化合物37的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.60(s,1H),9.53(s,1H),9.20(s,1H),8.54(d,J＝5.7Hz,1H),8.39(d,J＝1.4Hz,2H),8.12(d,J＝1.4Hz,1H),8.09(d,J＝7.0Hz,1H),7.84(d,J＝5.6Hz,1H),7.75(t,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),3.91(s,6H).
实施例38：
化合物38：5-(3-(2-氧代-2,3,3a,7a-四氢-1H-吲哚-6-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物38，产率为50％。
化合物38的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.25(s,1H),9.15(s,1H),8.54(s,1H),8.33(d,J＝1.4Hz,2H),8.07(t,J＝1.4Hz,1H),7.40(s,1H),7.21(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.3Hz,1H),3.90(d,J＝5.6Hz,6H),3.46(s,2H).
实施例39：
化合物39：5-(3-(2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物39，产率为58％。
化合物39的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.97(s,1H),9.16(s,1H),8.56(s,1H),8.33(d,J＝1.5Hz,2H),8.08(t,J＝1.5Hz,1H),7.34(d,J＝1.9Hz,1H),7.18(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.78(d,J＝8.5Hz,1H),3.89(s,6H),2.86(t,J＝7.5Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H).
实施例40：
化合物40：5-(3-(2-甲基-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物40，产率为56％。
化合物40的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.50(s,1H),9.48(s,1H),8.37(d,J＝1.5Hz,2H),8.13(t,J＝1.5Hz,1H),8.10(d,J＝1.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.72(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),3.90(s,6H),3.02(s,3H).
实施例41：
化合物41：5-(3-(异喹啉-7-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物41，产率为68％。
化合物41的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.43(s,1H),9.23(s,1H),9.21(s,1H),8.40(d,J＝1.5Hz,2H),8.38(d,J＝5.7Hz,1H),8.36(d,J＝1.7Hz,1H),8.12(t,J＝1.4Hz,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.75(dd,J＝11.7,3.9Hz,2H),3.91(s,6H)。
实施例42：
化合物42：5-(3-(喹啉-7-基)脲基)间苯二甲酸二甲酯(43)的合成
合成路线如下：
其他具体合成步骤同上述实施例，制备得到化合物42，产率为67％。
化合物42的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.40(s,1H),9.16(s,1H),8.76(d,J＝2.8Hz,1H),8.39(s,2H),8.29(d,J＝8.2Hz,1H),8.23(s,1H),8.12(s,1H),7.96(d,J＝9.0Hz,1H),7.73(d,J＝9.1Hz,1H),7.47(dd,J＝8.3,4.1Hz,1H),3.91(s,6H)。
实施例43：
本实施例以上述42个实施例提供的小分子化合物的具体化学结构为基础，采用同位素标记试验进行体外酶抑制活性测试。该实验中，[3H]-标记的AdoMet为产生放射性的底物，具有广谱甲基转移酶抑制活性的天然产物毛壳素为阳性对照。
测试方法如下：
(1)实验材料：
NSD2(Active Motif,Cat.No.31476)
SAM(Sigma,Cat.No.A7007-100MG)
Chaetocin(BPS,Cat No.27221)
GF/B Plate(Millipore,Cat.No.MSFBN6B50)
[3H]-SAM(PerkinElmer,Cat No.NET155V001MC)。
(2)实验方法：
配制1倍的缓冲溶液(Tris缓冲液)；将稀释好的化合物用Echo转移到实验板中；配制1倍的酶缓冲液；将底物加到1倍的缓冲液中，配成底物缓冲液；加[3H]-SAM到1倍的缓冲液中配成[3H]-SAM溶液；加入SAM到1倍的缓冲液中配制冰的SAM溶液；向实验板中转移10ul的酶溶液，对于无酶活对照孔，用10μl的1倍反应缓冲液替代酶溶液，在室温下孵育15分钟；向每个孔中加10ul的底物溶液；每个孔中加10ul的[3H]-SAM溶液开始反应。在室温下孵育240min；向每个孔加入15ul冰的SAM溶液终止反应；转移44ul的反应混合溶液到GF/B板中(用0.5％的PEI预处理15min)，然后用冰的双蒸水通过真空抽滤清洗3次；用Microbate读数；用excel通过以下公式计算抑制率：
Inh％＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100
用GraphPad通过以下公式计算IC50
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hill Slope))
(3)实验结果：
通过以上实验方法，测试了本发明化合物针对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制活性，具体如表一所示。
表一本发明化合物对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制活性(Inh％)
由表一可知本发明提供的42种具体的化合对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制活性，其中，化合物8其在50μM的时候显示了对NSD296％的抑制活性，进一步测得其IC50为4.8μM。化合物9，其在50μM的对NSD2有92％的抑制活性，IC50为11.5μM。化合物12，其在50μM时对NSD2的抑制活性为92％，IC50为7.5μM。化合物19在50μM时对NSD2的抑制活性为67％，IC50为17.0μM。化合物22在50μM时对NSD2的抑制率为95％，IC50为3.7μM。化合物34是在化合物在50μM时对NSD2的抑制率为92％，IC50为8.1μM。化合物30和31都对NSD2显示了抑制活性。其IC50分别为20.0μM和19.0μM。化合物32在50μM时对NSD2的抑制率为99％，IC50为7.3μM。化合物42其在50μM的对NSD2有93％的抑制活性。
除上述化合物其对NSD2显示出的抑制活性明显优于阳性对照组中的天然毛壳素外，其他化合物与阳性对照组相比相差不大，但均对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2具有一定抑制效果。由此可证明本发明提供的小分子化合物对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2具有明显抑制效果，部分化学结构远远优于阳性对照组的抑制活性，因此本发明中合成的小分子化合物在组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2抑制领域具有显著的进步。
实施例44：
根据上述实施例中各化合物对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制小姑，特别选择抑制活性最好的化合物22作为重点研究对象。根据现有技术可知，敲除组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2可以诱导***癌细胞的凋亡，因此利用22Rv-1细胞来检测化合物22的体外细胞生长抑制活性。结果如图1所示，化合物22能够抑制22Rv-1细胞的增殖，并且具有剂量和时间依赖性。药物作用12天后，该化合物10μM浓度下的细胞生长抑制率为66％。
实施例45：
本实施例使用Western blot分析来确认化合物22在22Rv-1细胞中对NSD2的抑制效果。组蛋白K36的甲基化过程需要NSD2的参与，因此以组蛋白赖氨酸H3K36的单甲基化和二甲基化(H3K36me和H3K36me2)水平变化来检测NSD2的活性，其结果如图2所示。化合物22作用于22Rv-1细胞时，可以剂量依赖性地降低H3K36的甲基化水平，同时对NSD2的蛋白表达水平未产生影响。表明化合物22可以在细胞内抑制NSD2的活性。
以上数据说明，化合物22可以在细胞内通过使NSD2失活来降低组蛋白赖氨酸残基的甲基化水平，从而抑制22Rv-1细胞的增殖。
实施例46：
本实施例针对化合物22进行甲基转移酶的抑制选择性的测试，测试其对MLL-1,PRMTs,SETDB1,SMYD3等六种甲基转移酶在10μM时的抑制率，结果如表2所示：
表二本发明中化合物22对其他组蛋白甲基转移酶的抑制活性
化合物22在10μM时对NSD2的抑制率为97％，对MLL-1和SETDB1有一定的抑制活性，而对PRDM9、PRMT5、PRMT7和SMYD3几乎没有抑制活性。说明化合物22对甲基转移酶的抑制具有显著的选择性。
实施例47：
本实施例以上述实施例提供的小分子化合物的具体化学结构为基础，对其分别对多种肿瘤细胞株增殖进行抑制实验，验证其对肿瘤细胞的抑制效果。
(1)实验材料：
主要试剂：RPMI-1640、胎牛血清、胰酶等购自GibcoBRL公司(InvitrogenCorporation，USA)，IMDM培养基购自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。人***癌细胞系(PC-3)，人肺癌细胞系(H2228)，人肺癌细胞系(NCI-H1975)，人肺癌细胞系(PC-9)，人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)，人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-435)，人卵巢癌细胞系(SK-OV-3)，人卵巢癌细胞系(OVCAR-3)，人卵巢癌细胞系(HO8910)，人卵巢癌细胞系(A2780S)，人卵巢癌细胞系(A2780/T)等均购于美国ATCC(Americantypeculturecollection)，由本实验室保存。
(2)实验方法：
用完全细胞培养液调整细胞浓度为1～2×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μl细胞悬液，培养过夜。次日，吸弃上清(悬浮细胞离心后吸取上清)，然后分别用梯度浓度的受试化合物处理细胞。同时设不含药物的阴性对照组和等体积的溶剂对照组，DMSO浓度为0.1％，每个剂量组设3个复孔，在37℃，5％CO2条件下培养。72小时后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT试剂20μl，再培养2-4h后，弃上清，每孔再加入DMSO150μL，振荡混匀15min，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率＝(阴性对照组A570-实验组A570)/阴性对照组A570×100％。实验至少重复3次。实验数据用均数表示，数据统计资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。以下各化合物对细胞增殖抑制作用均用IC50表示。
(3)实验结果：
采用以上方法，选取对组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2抑制效果相对显著的化合物22作为测试对象，对其分别进行了人***癌细胞系(PC-3)，人肺癌细胞系(H2228)，人肺癌细胞系(NCI-H1975)，人肺癌细胞系(PC-9)，人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)，人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-435)，人卵巢癌细胞系(SK-OV-3)，人卵巢癌细胞系(OVCAR-3)，人卵巢癌细胞系(HO8910)，人卵巢癌细胞系(A2780S)，人卵巢癌细胞系(A2780/T)等增殖抑制活性测试，具体抑制效果见表三：
表三本发明化合物对不同肿瘤细胞株的增殖抑制活性(IC50)
由表二内容可知，化合物22对各肿瘤细胞的IC50(μM)数量均小于10，其抑制效果显著，针对的肿瘤细胞较多元，未发生额外异变，具有很好的药用潜力。可以用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (17)
1.抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其通式如下：
其中，
A为独立的含有至多一个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环或含有至多一个氮原子的芳环或含有一个氧原子、一个氮原子的六元杂环；
B为独立的含有最多三个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环或含有至多两个氮原子的芳环或含有一个氮原子的六元杂环；
R1为独立的H、甲基、新丁基、硝基、醚键、肽键、酯键、卤素、-CF3、
R2为独立的H、甲基、新丁基、硝基、醚键、肽键、酯键、卤素、-CF3、
R3为独立的H、O、甲基或不存在；
R4为独立的H、O、甲基或不存在；
R5为独立的H、O、甲基或不存在。
2.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为含有至多一个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H、甲基、新丁基、酯键、
R2为独立的H、甲基、新丁基、酯键、
3.根据权利要求2所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A仅含有一个氮原子和一个氧原子时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H、新丁基；
R2为独立的H、新丁基。
4.根据权利要求2所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A仅含有一个氮原子和一个硫原子时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H、
R2为独立的H、
5.根据权利要求2所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A仅含有一个硫原子时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H、甲基、酯键；
R2为独立的H、甲基、酯键。
6.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为含有一个氧原子、一个氮原子的六元杂环时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H；
R2为独立的H。
7.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为含有一个氮原子的芳环时，
B为含有两个氮原子和一个硫原子的五元杂环；
R1为独立的H、卤素；
R2为独立的H、卤素。
8.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为芳环，B为含有最多三个氮原子、一个氧原子、一个硫原子的五元杂环时；
R1为独立的H、甲基、硝基、醚键、肽键、酯键、卤素、-CF3、
R2为独立的H、甲基、硝基、醚键、肽键、酯键、卤素、-CF3、
R3为独立的H、O、甲基或不存在；
R4为独立的H、O、甲基或不存在；
R5为独立的H、O、甲基或不存在。
9.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为芳环，B为含有至多两个氮原子的芳环时，
R1为独立的H、硝基、酯键；
R2为独立的H、硝基、酯键；
R3为独立的H；
R4为独立的H；
R5为独立的H。
10.根据权利要求9所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为芳环，B为含有两个氮原子的芳环时，
R1为独立的酯键；
R2为独立的酯键；
R3为独立的H；
R4为独立的H；
R5为独立的H。
11.根据权利要求9所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为芳环，B为含有一个氮原子的芳环时，
R1为独立的H、硝基、酯键；
R2为独立的H、硝基、酯键；
R3为独立的H；
R4为独立的H；
R5为独立的H。
12.根据权利要求1所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物，其特征在于，当A为芳环，B为含有一个氮原子的六元杂环时，
R1为独立的酯键；
R2为独立的酯键；
R3为独立的H、O；
R4为独立的H、O；
R5为独立的H、O。
13.根据权利要求1～12任一项所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物及其盐、水合物或药物组合物在制备抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的靶向药物的用途。
14.根据权利要求1～12任一项所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物及其盐、水合物或药物组合物在制备口服或静脉注射制剂中的用途，所述口服或静脉注射制剂包含至少一种权利要求1～12任一项所述的抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的小分子化合物及其盐、水合物或药物组合物以及任意的赋形剂和/或佐剂。
15.一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2的抑制剂，其特征在于，以权利要求1～12任一项所述丙烯酰胺类衍生物为主要活性成分的生物药学上可接受的盐、晶型、溶剂合物。
16.一种治疗癌症的药物，其特征在于，以权利要求15所述的组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2抑制剂为主要成分，添加生物药学上能够接受的辅助性成分制备而成。
17.根据权利要求16所述治疗癌症的药物，其特征在于，治疗的癌症包括***癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌。
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