CN109730966B - 一种壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送***及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送***及其制备方法。包括具有神经保护作用的疏水性小分子药物、聚乙二醇衍生物，以及壳寡糖。本发明还提供了上述鼻腔纳米制剂脑靶向递送***的制备方法。第一步，制备纳米颗粒冻干粉，第二步，临用前，将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水搅拌，成为透膜性良好的鼻腔制剂。本发明***制备方法简单，可改善小分子药物疏水性、降低毒性、增强神经保护作用；无载体、无生物降解问题和蓄积毒性，载药率高达25％以上，经壳寡糖修饰后透膜吸收良好，药物高靶向性递送入脑。该剂型给药方式为滴鼻、喷雾等，操作简单，便于长期服药的患者用药，在神经***疾病的治疗方面具有良好的应用前景。

Description

一种壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送系 统及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种鼻腔纳米制剂脑靶向递送***及其制备方法。具体 来说是一种壳寡糖修饰的、自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送***及其制备方法。

背景技术

近年来，神经***疾病发病率逐年升高，而治疗药物严重紧缺。药物研发筛选出的具有 神经保护活性的小分子，大多数是疏水性有机小分子，其本身难溶于水、在体内的生物利用 度低、血液循环时间短和不稳定性等问题极大阻碍了其在临床上的应用。

例如，姜黄素被报道有显著的体外神经保护药理活性，但因其水溶性差等问题限制了其 体内应用。且常规口服方式下，药物在通过肠粘膜及肝脏而经受灭活代谢后，进入体循环的 药量减少、药效降低。且由于血脑屏障的存在，药物能够进入脑内的含量极低，限制了其在 神经***疾病中的应用。

随着纳米技术的快速发展，纳米制剂因具有保护药物不被破坏、延长有效药物维持时间、 控制药物的释放、降低药物的毒副作用等优点，在医学和生物学领域得到了广泛的应用，并 逐渐开始应用于神经***疾病中。报道较多的纳米制剂为脂质体、聚酯类共聚物等载体包载 药物的纳米颗粒(专利CN107029247A、CN101897669B、CN 102283812B等)。但该类纳米颗粒 有三大缺点：一、随着长期服用，该聚合物等载体在脑部的富集可能带来潜在的毒副作用； 二、药物被包裹于载体中，可能失去其原有的自身靶向性识别功能；三、目前基于聚合物的 纳米载药体系，通常载药量低于10％，成为阻碍纳米颗粒进一步应用于临床的棘手问题。因 此，亟需开发一种高载药量、安全无毒、简单易行、普适于现有大量疏水性药物的纳米递送 ***，应用于其神经***疾病的治疗。

近年来，在不使用任何载体的情况下开发可替代的自携式纳米药物递送策略是非常可取 的。在2012，KasaI等通过将两个药物分子连接成二聚体后经再沉淀法形成粒径30-50nm的 自携式无载体纯纳米药物，是该策略的首次成功应用。但迄今为止，未能成功应用于脑部疾 病治疗药物，主要原因是常规制剂条件下，该类纳米药物仅能长效在血液中循环，却无法通 过血脑屏障(脑毛细血管内皮细胞孔径仅为14-18nm)进入脑部，故而无法实现脑部治疗药 物的递送。

鼻腔给药是当今一种安全、非侵入性的新颖给药方法，药物可通过嗅区黏膜沿着包绕在 嗅神经束周围的连接组织或嗅神经元的轴突到达脑脊液或脑部，包括大分子蛋白及纳米颗粒 等均可通过此途径绕过血脑屏障，直接进入中枢神经***发挥作用，而实现脑部治疗药物的 递送。此外，鼻腔给药后不经胃肠道代谢和肝脏降解，很少量的药物即达较高的脑部药物浓 度,故而可降低给药剂量、频次和减少剂量依赖的副作用。相较于静脉注射，鼻腔给药仅需 滴鼻、喷雾的方式，操作更简单安全，尤其是对于长期服药的神经退行性疾病患者，可以减 轻病人的痛苦、易于被患者接受，便于自己用药，并降低长期用药带来的风险。

然而鼻腔因其独特的环境而对制剂有许多细致要求。首先要求药物的透膜吸收性能。鼻 腔内的腺体分泌的浆液和黏液含有丰富的蛋白水解酶，是影响药物鼻腔吸收的因素之一。鼻 腔黏液的pH值为5.5～6.5，是蛋白水解酶的最适pH值，此外还有鼻黏膜纤毛的清除作用。 上述种种对鼻腔制剂的研发提出了挑战。吸收促进剂的使用，可在一定程度上增强药物的鼻 粘膜吸收。目前常用的吸收促进剂是阴离子表面活性剂如硬脂酸、月桂酸、月桂醇硫酸钠、 磺酸化物等，和非离子表面活性剂如聚山梨酯、苄泽等。然而，胆酸盐类对鼻粘膜有一定的 不良反应，如灼烧感、疼痛等，在较低浓度(2％)时就会产生强烈的鼻粘膜刺激，高浓度(5％) 可破坏鼻粘膜上皮结构，更高的浓度可使鼻纤毛或上皮细胞完全脱落。因此，有效而无毒的 吸收促进剂是鼻腔制剂的关键。

专利CN105617395A、CN105582545A及CN105617396A分别涉及一种经鼻给药脑靶向纳米 载药体系的制备方法、力可拉敏经鼻给药纳米脑靶向药物及其制备方法、加兰他敏经鼻给药 纳米脑靶向药物及其制备方法。三项专利针对于亲水性小分子药物，利用其亲水基团与羧基 化壳聚糖进行酯化反应而得靶向药物；而本发明为特异性地针对疏水性小分子药物，开发其 鼻腔纳米制剂脑靶向递送***的制备及应用。

有实验表明，葛根素经鼻给药后，嗅球部位的药物峰浓度和生物利用度为静脉注射的1.72 倍和3.05倍，脑靶向指数高达14％，是静脉注射的7.5倍，故而鼻腔途径对于葛根素提高疗 效具有非常广阔的前景。专利“CN107184554”公布了一种葛根素液晶纳米粒的制备方法，然 而薄膜法制备纳米药物装载率一般不超过10％，限制其药效发挥，且所用到的泊洛沙姆407 辅料是不能被生物降解的聚合物，在制剂中比例为药物的四倍，因长期给药蓄积可能导致潜 在的毒副作用。此外，有通过聚合物载体将丹参素纳米颗粒鼻腔递送入脑的报道(专利 CN107029247A)，但聚合物载体仍存在如前所述的三大固有缺陷，限制了其临床转化应用。如 果此类疏水性小分子，通过一种更为优化的纳米制剂脑靶向递送***，克服以上缺陷，有望 进一步提高药物治疗效果，对促进其在神经***疾病中的治疗应用有非常重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于针对于具有神经保护作用的疏水性有机小分子，其成药性差导致 生物利用度低的缺点，及常规给药途径药物难以跨越血脑屏障等问题，提供一种鼻腔纳米制 剂脑靶向递送***。具体来说是一种壳寡糖修饰的、自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送 ***。

本发明的技术方案如下：

一种壳寡糖修饰的、自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送***，包括壳寡糖、具有神 经保护作用的疏水性小分子药物以及聚乙二醇衍生物；首先配置聚乙二醇衍生物 1-10mg/mL以及0.5-5mg/mL疏水性小分子药物的良溶剂溶液，然后将所述良溶剂溶液向 去离子水中滴加，所述良溶剂溶液与去离子水的体积比为(0.5-5)：50，滴加的同时辅以 氮气吹，辅助良溶剂挥发；通过再沉淀法制备成粒径为50-200nm的自携式无载体纳米颗 粒悬乳液，冷冻干燥制备成冻干粉；临用前，将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水中利用物 理吸附作用反应0.5-2小时，其中，壳寡糖在等渗生理盐水溶液浓度为0.01-0.2％(w/v)， 除去反应物，将产物纯化即得壳寡糖修饰的自携式无载体纳米药物鼻腔制剂。

本发明中，壳寡糖用于鼻腔粘膜促透性能和神经保护协同作用。

优选地，自携式无载体纳米颗粒的表面电势为-10～-60mV。

优选地，所述具有神经保护作用的疏水性小分子药物为姜黄素或姜黄素类似物的一种或 多种。

进一步优选，所述的疏水性小分子是以下结构式的姜黄素类似物、其顺式异构体的混合 物：

进一步优选，混合物中的顺式异构体的重量比占总混合物量的25-35％。

进一步优选，所述的顺式异构体的重量比占总混合物量的25-35％的混合物，由如下方法 制得，将姜黄素类似物的甲醇溶液，加以紫外照射1.5-2.5h。

优选地，在紫外照射时，姜黄素类似物的甲醇溶液浓度为0.5-5mg/ml，进一步优选为 0.5-1.5mg/ml。紫外照射的时间如果短于1.5h，则不能生成足够量的顺式异构体，如果多余 2.5h，则会开始产生副产物，特别优选为紫外照射2h。

作为优选，聚乙二醇衍生物分子量范围为低于5000，进一步优选为低于2000。

进一步优选，为羧基聚乙二醇或聚马来酸酐18碳烯-聚乙二醇。

作为优选，所述的气体为氮气或惰性气体，优选为氮气。辅助良溶剂挥干，以保证纳米 颗粒的形成，同时防止溶剂残留造成的安全性隐患。

优选地，所述再沉淀法为，所述良溶剂溶液往去离子水中滴加，在温度为20-30℃下， 搅拌2-10min，静置3-30min，获得纳米颗粒悬乳液。

本发明的鼻腔纳米制剂脑靶向递送***，无载体、无生物降解问题和蓄积毒性，载药量 高达25％以上，可pH响应性地缓释小分子药物，高度保留小分子与靶向受体的结合能力；聚 乙二醇衍生物可增强颗粒水分散性和稳定性；壳寡糖为吸收促进剂，通过正负电荷吸附作用 修饰带负电的纳米药物颗粒，具有鼻腔粘膜促透性能和兼具神经保护协同作用。

壳聚糖是甲壳素经过脱乙酰作用得到的大分子，分子量在几十万至几百万Da，不溶于水。 将壳聚糖经特殊的生物酶技术等降解，可得到一种聚合度在2～20之间的寡糖产品，为壳寡糖， 又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，分子量≤3200Da，具有壳聚糖所没有的较高溶解度、可全溶于 水、容易被生物体吸收利用等诸多独特功能。壳寡糖是一种无毒的功能性低分子量氨基糖， 为多聚阳离子结构,本发明将其修饰在纳米颗粒外，可防止药物对鼻腔内环境的刺激；易与粘 膜细胞表面带负电荷的基团作用,用以改变细胞膜的流动性和通透性，增加纳米颗粒的吸收， 此外，壳寡糖自身还具有一定的免疫调节和神经保护作用，其效果是壳聚糖的14倍。

本发明所用的壳寡糖，聚合度为2-20，或分子量≤3200Da。

本发明壳寡糖在等渗生理盐水溶液浓度为0.01-0.2％(w/v)，如果少于0.01％，则难以起 到在增加吸收，防止刺激等方面中的作用，如果大于0.2％，则容易导致带负电的纳米颗粒聚 集。

将冻干粉在等渗生理盐水中复悬，其冻干粉浓度可根据需要配置。优选为3-7mg/ml。

优选地，所述疏水性药物纳米颗粒的平均粒径为50-150nm、更优选50-120nm。

优选地，所述疏水性药物纳米颗粒的表面电势为-30～-60mV。

优选地，所述疏水性药物纳米颗粒的载药率为25％以上。

自组装纳米颗粒的形成，受到疏水性小分子的分子结构影响，分子间为非共价结合力， 因分子构型不同可导致纳米结构有差异。为增强纳米颗粒的稳定性，本发明在溶剂交换前， 加入聚乙二醇衍生物，与疏水性小分子以一定比例在有机溶剂中混匀后，再进行溶剂交换， 通过再沉淀法得到无载体包裹的纳米颗粒。

本发明的疏水性药物纳米颗粒无其它载体成分，因此其载药量高、低毒、安全性好，其 粒径小且均匀，并且稳定性高、在体内循环时间长。

优选地，所述疏水性药物分子是具有神经保护作用的天然产物及其修饰物。

更优选地，所述具有神经保护作用的天然产物及其修饰物为姜黄素或其类似物中的一种 或多种。

进一步，发明的鼻腔纳米制剂脑靶向递送***,还可加入其它药剂学上有效的辅料，如抑 菌剂、等渗调节剂等，其用量为药剂学上所规定的常规用量。

本发明还可以加入抗氧剂，所述的抗氧剂可以是焦亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、 硫代硫酸钠、半胱氨酸盐酸盐、维生素C、维生素E、硫脲中的一种或多种，其用量为药剂学 上所规定的常规用量。

本发明还可以加入防腐剂，所述的防腐剂可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯扎溴铵、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、苯乙醇、硫柳 汞、硝酸苯汞、山梨酸、洗必泰中的一种或多种，其用量为药剂学上所规定的常规用量。

本发明还可以加入渗透压调节剂，所述的渗透压调节剂可以是氯化钠、葡萄糖、乳糖、 甘露醇中的一种或多种，其用量为药剂学上所规定的常规用量。

在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制 剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)首先配置聚乙二醇衍生物1-10mg/mL以及0.5-5mg/mL疏水性小分子药物的良溶剂溶 液，然后将所述良溶剂溶液往去离子水中逐滴滴加：所述良溶剂溶液与去离子水的体积比 为(0.5-5)：50，滴加的同时辅以气体吹，辅助良溶剂挥发，2)通过再沉淀法制备成粒径为50-200nm的自携式无载体纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥制备成冻干粉；

3)临用前，将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水中利用物理吸附作用反应0.5-2小时，除 去反应物，将产物纯化即得壳寡糖修饰的自携式无载体纳米药物鼻腔制剂。

本发明制备纳米颗粒的方法，通过再沉淀法进行，良溶剂转换进入水(不良溶剂)中的 时候，将疏水性药物分子析出形成纳米颗粒，且在加入聚乙二醇衍生物，可进一步增强其稳 定性和水分散性。本方法简单易行，不需要复杂的操作和条件，室温下即可进行。

需要强调的是，本发明中，聚乙二醇衍生物的加入时间，应在纳米颗粒形成以前，即与 小分子一同溶解于良溶剂中，混合均匀后，再逐滴滴加入水相，制备纳米颗粒。滴加时，辅 以气体(优选为氮气)吹，用以除净有机溶剂。此方法不同于先形成纳米颗粒、后加两亲性 表面活性剂作表面修饰的方法，产物亦不相同。

本发明在临使用前，才将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水混合，避免了放置久之后产生 聚集沉淀，保证使用时鼻腔的吸收。

本发明制备疏水性药物纳米颗粒的方法中，所述良溶剂与水互溶。根据Flory-Krigboum 稀溶液理论，良溶剂是指与溶质相互作用参数小于0.5的溶剂。优选地，所述良溶剂为丙酮、 甲醇、乙醇和四氢呋喃中一种或多种的混合，更优选为四氢呋喃。

本发明制备疏水性药物纳米颗粒的方法中，所述水可以是去离子水、蒸馏水或双蒸水等， 优选去离子水。

本发明制备疏水性药物纳米颗粒的方法中，所述步骤(1)中疏水性药物分子溶于良溶剂 中的浓度为0.5-5mg/mL,优选为1mg/mL。

本发明制备疏水性药物纳米颗粒的方法中，所述步骤(1)中良溶剂与水的体积比优选为 (1-3)：50，优选为2：50。优选地，所述步骤(1)中反应温度为20-30℃，更优选为25℃。

本发明制备疏水性药物纳米颗粒的方法中，所述步骤(2)中加入的聚乙二醇衍生物在良 溶剂的浓度可以为1-10mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、 7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL，优选为2mg/mL。

优选地，所述步骤(2)中超声分散的时间为3-30min，更优选为5min。优选地，所述步骤(3)中壳寡糖等渗生理盐水溶液浓度为0.05-0.2w/v，例如0.05％w/v，0.1％w/v或0.2％w/v， 优选为0.1％w/v。优选地，所述步骤(3)中搅拌时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.5h或2h， 优选为1h。优选地，所述步骤(3)中离心条件为转速10000-150000*g，优选为150000*g， 离心30min。

自组装纳米颗粒于水溶液中长期储存可能发生聚集，将其冷冻干燥，可明显提高其稳定 性，冷冻温度低于纳米颗粒与水共存的低共熔点10-20℃、10Pa压力下冷冻干燥24-90h，优 选为48h。

为避免冻干后纳米颗粒聚集和粒径变化，先加入冷冻保护剂，如葡萄糖、甘露醇、乳糖、 NaCl等，在冷冻时促进大量微小冰晶形成，或使冻干品呈疏松状态，以利于纳米颗粒保持原 形态并易于在水中再分散。

在第三方面，本发明提供如第一方面所述的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂脑 靶向性递送***的应用。其用于脑靶向性递送。可以制成鼻腔喷雾剂或是滴鼻剂。在一实施 例中，壳寡糖修饰的姜黄素类似物M1自携式无载体鼻腔纳米制剂***经鼻给药后，对MPTP 诱导的帕金森模型小鼠探索运动活性、焦虑、步态等行为具有改善作用。

本发明所述的脑靶向性递送***采用喷雾或滴鼻形式通过鼻腔途径给药。

本发明的有益效果为：

本发明涉及的一种纳米制剂脑靶向递送药物***，针对具有神经保护作用的疏水性小分 子，将其制备成壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂脑靶向递送***，可应用于一系列 神经***疾病的治疗。制成鼻腔制剂之后，可避免胃肠道降解和肝脏首过效应，具有生物利 用度高、起效快、患者顺应性好等特点。与常规剂型相比，鼻腔制剂通过鼻脑通路，将药物 沿嗅神经等途径绕过血脑屏障直接递送入脑，可显著增强脑靶向性，降低外周循环***脏器 富集，降低长期服用的潜在副作用。与注射剂相比，鼻腔制剂可降低肝脏等外周循环器官的 药物累积；与口服药相比，鼻腔制剂无首过效应，降低药物损耗。使用方便无创、患者依从 性提高。相较于静脉注射，鼻腔给药仅需滴鼻、喷雾等方式，操作更简单安全，尤其是对于 长期服药的神经退行性疾病患者，可以减轻病人的痛苦、患者顺应性好，便于自己用药，并 降低长期用药带来的风险，具有良好应用前景。此外，与静脉注射相比，滴鼻、喷雾等方式 操作简单安全，尤其对于长期服药的神经退行性疾病患者，便于自己用药，在神经***疾病 的治疗方面具有良好的应用前景。

本发明中的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂操作简单、适用范围广且普适性强。 相比于疏水性有机小分子药物前体，更具有显著提升水分散性及成药性、增强生物利用度、 降低给药频次、降低毒副作用等优势,长期服用更安全。相比于传统的聚合物纳米载药***， 本发明纳米***无载体、无生物降解问题和蓄积毒性，载药率高达25％以上，且壳寡糖修饰 后透膜吸收良好，作为鼻腔制剂可极高靶向性通过嗅神经进入大脑。聚乙二醇衍生物除了增 强稳定性，还减少粘膜刺激，延长体内循环时间。

该纳米制剂高度保留原分子的靶向受体结合能力，具有pH响应性的药物释放特性，经细 胞摄取后于溶酶体特定pH(5.5)下降解，释放小分子至细胞质中从而发挥药效。同时，本 发明药物在递送过程中是稳定的。图7说明，本发明能够使药物小分子在脑髓液和血液中长 效循环和缓慢释放(超过64h)，从而能够减少给药频次，以及减少给药剂量。

从而，本发明具有安全性高、载药率高、脑靶向性高；给药剂量少、给药频次少(缓释 长效)、全身副作用少(肝肾含量低)；无创式给药等优点。

与原疏水性小分子药物相比,本发明递送***具有良好的水分散性,大大增强了小分子成 药性,且降低小分子药物毒性、增强神经保护作用；与其它纳米制剂相比，本发明递送***无 载体、无生物降解问题和蓄积毒性，载药率高达25％以上，高度保留原分子的靶向受体结合 能力，且壳寡糖修饰后透膜吸收良好，作为鼻腔制剂可极高靶向性通过嗅神经进入大脑。有 pH响应性能,可于细胞内缓慢释放、长效维持有效浓度。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1.疏水性小分子药物自携式无载体纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图:其中a为姜黄素 纳米颗粒；b为M1纳米颗粒；c为载有TPAAQ探针的M1纳米颗粒。

图2.疏水性小分子药物自携式无载体纳米颗粒的粒径分布图:其中a为姜黄素纳米颗 粒；b为M1纳米颗粒；c为载有TPAAQ探针的M1纳米颗粒。

图3.疏水性小分子药物自携式无载体纳米颗粒的电位分布图:其中a为姜黄素纳米颗 粒；b为M1纳米颗粒。

图4.疏水性小分子药物自携式无载体纳米颗粒的丁达尔效应光学表征图:其中a为姜黄 素纳米颗粒；b为M1纳米颗粒。

图5.疏水性小分子药物自携式无载体纳米颗粒的装载率测试图：其中a为姜黄素纳米 颗粒；b为M1纳米颗粒，c为载有TPAAQ探针的M1纳米颗粒。

图6.姜黄素纳米颗粒经壳寡糖修饰后细胞摄取效果；其中a为未经壳寡糖修饰的M1 NPs 细胞摄取图；b为壳寡糖修饰后的M1 NPs细胞摄取图。

图7.M1纳米颗粒pH响应性药物释放曲线图。

图8.M1纳米颗粒与小分子M1药物的细胞毒性图。

图9.M1纳米颗粒的体外神经保护作用图。

图10.M1纳米颗粒与靶蛋白结合效果验证图。

图11.载有TPAAQ荧光探针的M1纳米颗粒细胞摄取图。

图12.姜黄素纳米颗粒经鼻给药后的小鼠的脑切片透射电镜图。

图13.M1纳米颗粒经鼻脑给药后小鼠脑和血浆中M1药物含量图。

图14.载有TPAAQ荧光探针的M1纳米颗粒经鼻给药后的小鼠的脑及脏器荧光生物图。

图15.帕金森模型小鼠经鼻给药实施例2的M1鼻腔纳米制剂后的旷场行为图。

图16.帕金森模型小鼠经鼻给药实施例2的M1鼻腔纳米制剂后的步态行为图。

图17实施例2中质谱图中分子量为294.34的化合物图谱

图18为实施例2中不同条件下的姜黄素类似物的转化率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，一下 实施例仅为发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化 试剂厂商购买得到的。

实施例1：姜黄素鼻腔纳米制剂的制备

本实施里所用的姜黄素结构如下：

配置含有1.5mM浓度的姜黄素药物分子及2mg/mL的聚马来酸酐18碳烯-聚乙二醇的- 四氢呋喃溶液10mL，取200μL所述姜黄素溶液往4mL去离子水中滴加，滴加的同时辅以氮 吹，同时剧烈搅拌水溶液，以除净有机溶剂，搅拌10min后静置，获取自携式无载体姜黄素 纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥形成冻干粉。临用前，将冻干粉重新分散于等渗的生理盐水中， 逐滴加入至壳寡糖(0.1w/v)生理盐水溶液里，搅拌0.5h，利用物理吸附作用反应1小时， 以10000*g的转速离心10min，弃置上清液，除去反应物，将产物纯化即得壳寡糖修饰的自 携式无载体姜黄素鼻腔纳米制剂。

结果

(1)姜黄素纳米颗粒形态、粒径及电位分布的测定

使用扫描电镜(FEI Quanta200，荷兰)按照其说明书中的方法，观察实施例1中制备的 姜黄素纳米颗粒，其扫描电镜图如图1a所示。使用激光粒度仪(马尔文，英国)按照其说明 书中的方法，对实施例1中制备的姜黄素纳米颗粒进行动态光散射测定，测得实施例1中制 备的姜黄素纳米颗粒的平均粒径为64.57nm，粒径分布图如图2a所示。使用激光粒度仪按 照其说明书中的方法，对实施例1中制备的姜黄素纳米颗粒进行Zeta-电位分析，测得实施 例1中制备姜黄素纳米颗粒平均电荷为-10.5mV，表明其带有微弱的负电荷，其分布如图3a 所示。

(2)姜黄素纳米颗粒光学表征的测定

将姜黄素分子及实施例1中制备的姜黄素纳米颗粒分别溶解于水和有机溶剂中，如图4a 所示，可见姜黄素小分子难以溶解于水，可溶于四氢呋喃中，而姜黄素纳米颗粒可分散于水 中，在激光下具有丁达尔效应。

姜黄素纳米颗粒载药率的测定

将姜黄素分子溶解于乙腈中，梯度配置系列浓度的姜黄素乙腈溶液(6.25，12.5，25， 50及100ug/mL)，应用超高效液相色谱(UPLC)于428nm测定吸光度，做出标准曲线。取三批次100ug/mL的姜黄素纳米颗粒，分别溶解于乙腈中，超声5min，同法测定，利用标准曲 线计算纳米颗粒中的姜黄素含量。如图5a所示，姜黄素纳米颗粒的载药率为(25.12±2.50)％

(3)姜黄素纳米颗粒的壳寡糖修饰效果测定

将荧光FITC探针与未经壳寡糖修饰的姜黄素纳米颗粒、壳寡糖修饰后的姜黄素纳米颗 粒分别修饰后，各自与N2a细胞共孵育培养6h，细胞用PBS清洗三次，于激光共聚焦显微镜 下用488nm波长激发，190-540nm发射波长，测定荧光强度，并做比较分析。如图5所示，壳寡糖修饰后，姜黄素纳米颗粒的细胞摄取显著增强。

实施例2：姜黄素类似物M1鼻腔纳米制剂的制备

本实施例所用的姜黄素类似物M1，为以下结构式的姜黄素类似物的异构体混合物：

根据申请人的计算机模拟结果，在混合物中，顺式同分异构体的比例越高，产物的生物 活性越强。但实际中，产物越高，副产物的产率也越高。

在本实施例中，提供了一种可获得30％转化率的异构体产物，制备方法简单，且无副产 物生成的方法。

根据姜黄素类似物的疏水性质，其溶解于良溶剂中，给予不同辐射条件，可发生不同程 度的异构体转化，获得不同比例的顺反异构体混合物。其中，日光照射的转化率最高，但有 副产物生成；转化率其次为紫外照射、放射性碘辐射，而避光条件下，温度对姜黄素类似物 的结构无影响。

进一步地，良溶剂优选为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃。

进一步地，UV照射2h可获得30％转化率的异构体产物，制备方法简单，无副产物生成。

姜黄素类似物的顺反异构体混合物M1(Mixture 1)制备方法

配置含有1mg/mL的姜黄素类似物的甲醇溶液，用铝箔纸密封后，分别于4℃、25℃及50℃ 的环境下放置8h，得到反应产物1-3；另配置同样同浓度的姜黄素类似物的甲醇溶液，室温 下，分别加以日光照射2h、日光照射24h、紫外照射2h、放射性碘131辐射2h，得到反应产 物4-7，以获得各种比例的姜黄素类似物顺反异构体混合物。

结果

(1)转化产物的分子量鉴定

应用高效液相联用飞行时间质谱仪测定产物的分子量，由图17可知，姜黄素类似物及其 转化产物的分子量均为294.34，确认二者为同分异构体，进一步由结构可知，为顺反异构体。

(2)顺反异构体转化率的测定：

应用高效液相色谱法(HPLC)，于384nm最大吸收波长下，测定样品溶液1-7中，姜黄素 类似物的顺反异构体转化率。结果如图2所示，反应产物1-3中均无有新物质产生，说明未 发生姜黄素类似物异构体转化(图18a-c)。反应产物4,日光照射2h后，姜黄素类似物含量 有73.91％转化为其异构体(图18d)；而日光照射24h，反应产物5除姜黄素类似物异构体之 外，还有许多复杂产物生成(图18e)。反应产物6，紫外照射2h，姜黄素类似物异构体转化率为29.59％(图18f)。反应产物7，放射性碘131辐射条件2h下，姜黄素类似物异构体转 化率为27.91％(图18/g)。

以反应产物6作为以下的M1：

配置含有1mg/mL的M1及2mg/mL的羧基聚乙二醇的四氢呋喃溶液5mL，混匀，取200μL所述M1分子溶液，逐滴往5mL去离子水中滴加，滴加的同时辅以氮吹，以除净有机溶剂。25℃下磁力搅拌10分钟后静置，获取M1自携式无载体纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥形成冻干粉。临用前，将冻干粉逐滴加入至含壳寡糖(0.1w/v)的等渗生理盐水溶液里，搅拌0.5-2h，利用物理吸附作用反应1小时，以10000-150000*g的转速离心5-30min，弃置上清液，除去反应物，将产物纯化即得壳寡糖修饰的自携式无载体M1鼻腔纳米制剂。

结果

(1)M1纳米颗粒形态、粒径及电位分布的测定

使用扫描电镜(FEI Quanta200，荷兰)按照其说明书中的方法，观察实施例2中制备的 M1纳米颗粒，其扫描电镜如图1b所示。使用激光粒度仪(马尔文，英国)按照其说明书中 的方法，对实施例2中制备的M1纳米颗粒进行动态光散射测定，测得实施例2中制备的M1纳米颗粒的平均粒径为62.73nm，粒径分布图如图2b所示。使用激光粒度仪按照其说明书中的方法，对实施例2中制备的M1纳米颗粒进行Zeta-电位分析，测得实施例2中制备的 M1纳米颗粒平均电荷为-56.5mV，表明其带有微弱的负电荷，其分布如图3b所示。

(2)M1颗粒光学表征的测定

将M1小分子及实施例2中制备的M1纳米颗粒分别溶解于水和有机溶剂中，如图4b所示， 可见M1小分子难以溶解于水，可溶于四氢呋喃中，而M1纳米颗粒可分散于水中，在激光下 具有丁达尔效应。

3)M1纳米颗粒载药率的测定

将M1分子溶解于乙腈中，梯度配置系列浓度的M1的乙腈溶液(6.25，12.5，25，50及100ug/mL)，应用超高效液相色谱(UPLC)于428nm测定吸光度，做出标准曲线，。取三批次100ug/mL的M1纳米颗粒，分别溶解于乙腈中，超声5min，同法测定，利用标准曲线计算纳 米颗粒中的M1含量。如图5b所示，M1纳米颗粒的载药率为(31.49±2.03)％

(4)M1纳米颗粒药物释放曲线测定

将实施例2制备的M1纳米颗粒等分为六份，3份加入人工鼻液中，3份加入5％血浆，分 别装入透析袋中，分散并稀释，分别加入透析袋(3500分子量，

美国)中，接着浸泡在200毫升的相同pH的缓冲液里，37℃不断搅拌，于一定的时间点从溶液中收集2ml溶液。在透析过程中，每次取样后补充2ml PBS，使溶液体积保持恒定。采用UV-VIS法 测定吸光度，计算药物释放量。每个样本进行3次测试，取平均值，统计分析，结果如图7 所示。可见，实施例2制备的M1纳米颗粒具有缓慢释放的性质，没有显示初始爆发性药物释 放，而是缓慢而稳定地释放，这对于M1纳米颗粒在体内的应用是至关重要的，可降低药物毒 性，减少药物泄漏等。

(5)细胞毒性试验

按照文献(《细胞培养》，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法培养神经瘤母细胞N2a细胞，然后加入实施例2制备的M1纳米颗粒继续培养，加药24小时后按照文 献(《细胞培养》，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法(MTT法)检测细胞存 活率，此为M1纳米颗粒组。用与M1纳米颗粒组含相同浓度的游离M1按相同方法处理N2a细 胞的组为阳性对照组；不含疏水性药物的空白培养基培养的N2a细胞作为阴性对照组，其中 以阴性对照组中细胞的存活率按100％计算。结果如图8所示，随着浓度的升高，游离M1可 体现出剂量依赖性的细胞毒性，而实施例2中的M1纳米颗粒在相同浓度下，对N2a细胞无毒 性作用，可能由于M1纳米颗粒的缓释作用，在较高浓度时抑制了M1小分子药物的蓄积毒性。

(6)M1纳米颗粒的神经保护作用测定

利用MPP+神经毒素处理神经细胞株PC12细胞，造成神经毒性细胞模型。在造模前6h， 加入实施例2中制备的M1纳米颗粒预处理，为M1纳米颗粒组；不加药物处理的为模型对照 组，未加MPP+神经毒素的为正常对照组。造模后继续培养48h，依照文献方法测吸光度，结 果如图9所示，M1纳米颗粒组的细胞存活率比MPP+模型组显著升高，实施例2中制备的M1纳米颗粒可剂量依赖性保护PC12神经细胞，降低MPP+神经毒素对其诱导的细胞损伤。

(7)M1纳米颗粒与靶蛋白的结合效应测定

游离M1分子神经保护作用的靶蛋白是细胞浆内的TFEB蛋白，M1通过促进TFEB蛋白去 磷酸化进入细胞核中，而上调自噬相关基因的表达，从而起到神经保护的作用。本实验中， 在过表达荧光标记TFEB蛋白的MF7细胞中加入实施例2中制备的M1纳米颗粒，处理24h后 观测TFEB入核情况，结果如图9所示，实施例2中制备的M1纳米颗粒可剂量依赖性地促进TFEB入核，证实M1纳米颗粒保留了原分子的靶向特性。

实施例3：载荧光探针TPAAQ的M1鼻腔纳米制剂脑靶向性递送***

TPAAQ是一种473nm波长激发、650nm波长发射的疏水性小分子荧光探针，可用于纳米材 料的体内荧光分布监测。因其亦是疏水性小分子，故与实施例2的M1纳米颗粒制备过程相似， 可同法获得载有TPAAQ的M1鼻腔纳米制剂。

配置含有1mg/mL的M1和2mg/mL的TPAAQ的四氢呋喃溶液5mL，混匀，取200μL所述M1分子溶液，逐滴加入到5mL去离子水中，同时辅以氮吹，以除净有机溶剂。25℃下磁力搅拌10分钟后静置，获取载荧光探针TPAAQ的M1自携式无载体纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥形成冻干粉。临用前，将冻干粉重新分散于等渗的生理盐水中，逐滴加入至壳寡糖(0.1w/v)生理盐水溶液里，搅拌0.5-2h，利用物理吸附作用反应1小时，以10000-150000*g的转速 离心5-30min，弃置上清液，除去反应物，将产物纯化即得壳寡糖修饰载有TPAAQ探针的自 携式无载体M1鼻腔纳米制剂。

实施例3结果

(1)载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒形态、粒径分布的测定

使用扫描电镜(FEI Quanta200，荷兰)按照其说明书中的方法，观察实施例3中制备的 载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒，其扫描电镜图如图1c所示。使用激光粒度仪(马尔文， 英国)按照其说明书中的方法，对实施例3中制备的载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒进行动 态光散射测定，测得实施例3中制备的载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒的平均粒径为178.2 nm，粒径分布图如图2c所示。

(2)载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒载药率的测定

利用实施例2的测试(3)所做M1乙腈溶液标准曲线，，取三批次100ug/mL的载荧光探 针TPAAQ的M1纳米颗粒，分别溶解于乙腈中，超声5min，同法测定，利用标准曲线计算纳米颗粒中的姜黄素含量。如图5c所示，载荧光探针TPAAQ的M1纳米颗粒的载药率为(26.95±1.50)％。

(2)细胞摄取实验

神经细胞正常培养，加入实施例3中制备的载荧光探针TPAAQ的M1鼻腔纳米制剂，培养 3h后，用激光共聚焦扫描显微镜于特定波长下观测细胞摄取情况，如图11所示，从荧光信 号可见，实施例3中制备的载荧光探针TPAAQ的M1鼻腔纳米制剂可被细胞大量摄取。

实施例4：姜黄素纳米颗粒经鼻脑靶向递送***的应用

取体重为25g的雄性C57BL/6J品系小鼠6只,适应性饲养3天。将实施例1中制备的姜 黄素鼻腔纳米制剂分散于等渗生理盐水中，浓度5mg/ml，给予小鼠鼻腔15ul，24h后解剖取 出脑组织，固定切片，于透射电镜下观察纳米颗粒的脑分布。如图12所示，可明显看到姜黄 素纳米颗粒在脑嗅球、皮层部位的分布。

实施例5：M1纳米颗粒经鼻脑靶向递送***的应用

取体重为25g的雄性C57BL/6J品系小鼠6只，适应性饲养3天。将实施例2中制备的M1鼻腔纳米制剂分散于等渗生理盐水中，浓度5mg/ml，给予小鼠鼻腔15ul，24h后解剖取出脑组织、脑脊液和血浆，并将脑组织分为嗅球部分和大脑其余部分，所有样品分别加甲醇除蛋白后，应用三重四极杆液质联用色谱，分析样品内M1药物含量。结果如图13所示，M1鼻 腔纳米制剂脑靶向递送***极高靶向性地将M1药物递送入嗅球，并在脑脊液中有高于血浆内含量三倍的分布，且在大脑其它部位有血浆两倍量的药物分布。证实其吸收途径为经过嗅球 而到达大脑，并可传递到大脑其它部位。其传递可能为时间依赖性，24h后会继续经由脑脊 液向后传递。

实施例6：载有TPAAQ荧光探针的M1纳米颗粒经鼻脑靶向递送***的应用

取体重为25g的雄性C57BL/6J品系小鼠9只，适应性饲养3天。将实施例3中制备的载 荧光探针TPAAQ的M1鼻腔纳米制剂分散于生理盐水中，浓度5mg/ml，给予小鼠鼻腔15ul，分别于24h、48h后应用小动物荧光成像***，检测小鼠脑部在体荧光，及离体脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器和血液中的荧光信号，结果如图14所示，脑部信号显著强于身体其它部位和组织，提示实施例3脑靶向性递送***可成功将M1鼻腔纳米制剂高靶向性递送入脑，降低药物在外周组织的分布。

实施例7：自携式无载体M1鼻腔纳米制剂在帕金森模型小鼠的治疗应用

取体重为25g的雄性C57BL/6J品系小鼠30只，分三组，第一组野生型组(WT组),第二 组模型组(MPTP组)，第三组模型给药组(M1 NPs)，每组10只小鼠。按照文献方法，将第二、三组小鼠持续腹腔注射20mg/kg剂量MPTP神经毒素五天，造成帕金森疾病模型。造模同期做给药处理，WT组、MPTP组小鼠鼻腔给予生理盐水，M1 NPs组鼻腔给予自携式无载体M1鼻腔纳米制剂，即，将实施例2中制备的M1鼻腔纳米制剂分散于等渗生理盐水中，临用新制，浓度1mg/ml，鼻腔给予小鼠15ul。间隔一天给药，共给药四次，造模结束两周后观测效果。

实施例7结果

(1)旷场试验检测帕金森模型小鼠行为学表现

MPTP帕金森小鼠模型有探索运动障碍和显著焦虑等症状，可由旷场试验检测。根据文献 方法，检测实施例7中帕金森模型小鼠的行为学表现。结果如图图15a所示，与对照组野生 型小鼠相比，模型小鼠运动轨迹显著改变，而经M1鼻腔纳米制剂治疗后，轨迹趋于正常。统 计数据显示，对比野生型小鼠，模型小鼠在矿场内的运动时间、平均速度(图15b)和区域 穿梭次数(图15c)等均显著减少，而经过自携式无载体M1鼻腔纳米制剂治疗后，上述病变 情况均显著改善，证实M1鼻腔纳米制剂可有效缓解帕金森疾病模型的行为学症状。

步态试验检测帕金森模型小鼠行为学表现

帕金森病的临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍等。在动 物上采用DigiGait成像***，通过在透明跑带下方对动物成像，软件量化步态力学和姿势指 数等特征，可检测帕金森模型小鼠的行为学特征。结果如图16所示，对比野生型小鼠，帕金 森模型小鼠的步态信号紊乱、协调性降低、脚掌着地面积显著减小，而经过自携式无载体M1 鼻腔纳米制剂治疗后，上述病变情况均显著改善，证实M1鼻腔纳米制剂可有效改善帕金森疾 病的行为学症状。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明 并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细 方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组 分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围 之内。

Claims (6)

1.一种脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂，其特征在于：

包括壳寡糖、具有神经保护作用的疏水性小分子药物以及带负电的聚乙二醇衍生物，所述的带负电的聚乙二醇衍生物为羧基聚乙二醇或聚马来酸酐18碳烯-聚乙二醇；首先配置羧基聚乙二醇或聚马来酸酐18碳烯-聚乙二醇1-10mg/mL以及0.5-5 mg/mL具有神经保护作用的疏水性小分子药物的良溶剂溶液，然后将所述良溶剂溶液向去离子水中滴加，所述良溶剂溶液与去离子水的体积比为（0.5-5）：50，滴加的同时辅以气体吹，辅助良溶剂挥发；通过再沉淀法制备成粒径为50-200nm的自携式无载体纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥制备成冻干粉；

临用前，将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水中利用物理吸附作用搅拌反应0.5-2小时，其中，壳寡糖在等渗生理盐水溶液浓度为0.01-0.2%（w/v），除去反应物，将产物纯化即得所述脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂；

所述具有神经保护作用的疏水性小分子药物为以下结构式的姜黄素类似物及其光转化异构体的混合物，异构体占混合物总量的25-35%：

所述的混合物由如下方法制得，将所述姜黄素类似物的甲醇溶液，加以紫外照射1.5-2.5h。

2.根据权利要求1所述的一种脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂，其特征在于：所述壳寡糖聚合度为2-20，或分子量≤3200Da。

3.如权利要求1所述的一种脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

1）首先配置羧基聚乙二醇或聚马来酸酐18碳烯-聚乙二醇1-10mg/mL以及0.5-5 mg/mL具有神经保护作用的疏水性小分子药物的良溶剂溶液，然后将所述良溶剂溶液向去离子水中滴加：所述良溶剂溶液与去离子水的体积比为（0.5-5）：50，滴加的同时辅以气体吹，辅助良溶剂挥发；

2）通过再沉淀法制备成粒径为50-200nm的自携式无载体纳米颗粒悬乳液，冷冻干燥制备成冻干粉；

3）临用前，将冻干粉与壳寡糖在等渗生理盐水中利用物理吸附作用反应0.5-2小时，除去反应物，将产物纯化即得所述脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂。

4.如权利要求1或2任一项所述的一种脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂在制备鼻腔喷雾剂或滴鼻剂中的应用。

5.如权利要求1或2任一项所述的一种脑靶向的壳寡糖修饰的自携式无载体鼻腔纳米制剂在制备预防及治疗神经***疾病药物的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述神经***疾病为帕金森病。

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