CN109725046B - 一种基于建模-预测策略的靶标脂质组学方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种靶标脂质组学方法，更确切地说是一种应用“建模‑预测”的策略对血浆中溶血磷脂胆碱(LPC)进行高效灵敏地定性定量分析。本发明以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型，总结LPC(13:0)，LPC(14:0)，LPC(15:0)，LPC(17:0)LPC(18:1)LPC(19:0)LPC(20:0)对照品的液相质谱参数规律，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数。使用预测出来的液相质谱参数对血浆中的LPC进行定量分析，并通过独立样本T检验、PLS‑DA、单因素ROC曲线筛选不同癌症的生物标志物，通过多因素ROC曲线评价其诊断能力。

Description

一种基于建模-预测策略的靶标脂质组学方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种靶标脂质组学方法，更确切地说是一种应用“建模-预测”的策略对血浆中溶血磷脂胆碱（LPC）进行高效灵敏地定性定量分析。背景技术
脂质是生物膜的骨架成分，是参与生物的生命活动、为生物提供能量的重要物质。脂质组学属于代谢组学的重要分支，是对生物体内的脂类物质进行***的分析，研究其相互作用以及与其他生物分子的作用，进而揭示脂质代谢与生物体的生理、病理过程之间关系的一门新兴学科。由于脂质骨架、基团和碳链的多样性，体内存在着大量具有不同理化性质和动态范围的脂类化合物，一个方法是不可能全面准确地定性定量所有脂类的。因此，我们可以根据脂类的骨架将其分为几个子类，然后利用优化的内标、前处理方法和LC-MS/MS条件去更准确地定量一个或几个特定的脂质亚类，从而提供更准确的生物学解释。
由于脂质的多样性和不稳定性，脂质的对照品很难获得，这使得脂质的准确定量成为一个重大难题。因此，亟需提出一种策略和方法来解决这个难题。
发明内容
本发明的第一个目的是克服现有技术的缺陷，采用“建模-预测”的策略，建立血浆中溶血磷脂胆碱的分析方法。
本发明的第二个目的是通过建立的分析方法测定溶血磷脂胆碱的浓度。
本发明的第三个目的是通过建立的分析方法测定健康人和癌症患者血浆中的60种溶血磷脂胆碱的浓度，并通过独立样本t-检验、PLS-DA、单因素和多因素ROC分析筛选出了不同癌症的生物标记物。
本发明是这样实现的：
（1）“建模-预测”策略：
首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型，总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，得到回归模型方程，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数。
（2）血浆样品预处理：
取血浆样品，加入甲醇、内标溶液，涡旋，超声离心，取上清液进行LC -MS 分析。
其中，所述的内标溶液是LPC (13:0)；
所述的血浆与甲醇的体积比为：1:3-1:5。
（3）液相分离：
色谱柱: Kinetex XB-C18（4.6×100 mm, 2.6 µm）；
流动相: A相: 0.1-0.3%甲酸水， B相: 0.1-0.3%甲酸甲醇；
流速: 0.4 ml·min-1；
进样量: 2 µl；
柱温: 25oC；
梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（4）MS 测定：电喷雾离子源，正离子扫描，其他参数与待测物离子通道见表2。
表2 LPC质谱参数
Figure 246592DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 383175DEST_PATH_IMAGE004
Figure 786475DEST_PATH_IMAGE005
*定性离子
（5）数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素ROC曲线筛
选不同癌症的生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力。
附图说明
图1为“建模-预测”策略的具体流程图。
图2A为肺癌的LPC类生物标志物的诊断能力ROC曲线图。
图2B为乳腺癌的LPC类生物标志物的诊断能力ROC曲线图。
图2C为结直肠癌的LPC类生物标志物的诊断能力ROC曲线图。
图2D为胃癌的LPC类生物标志物的诊断能力ROC曲线图。
具体实施方式
实施例1
（1）首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型（表3），总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数，具体流程见图1。
表3 液相质谱参数的多重现性回归方程
Figure 435631DEST_PATH_IMAGE006
（2）血浆样品预处理：取血浆样品100 μl于EP管中，加入甲醇10 μl，内标溶液 50μl，涡旋混合 30 s，加入乙腈400 μl，涡旋混合 3 min，冰浴超声10 min, 于 4°C 离心(12000 r /min) 5 min，取上清液进行 LC -MS 分析。
（3）液相分离：色谱柱: Kinetex XB-C18（4.6×100 mm, 2.6 µm）；流动相: A相:0.1%甲酸水 B相: 0.1%甲酸甲醇；流速: 0.4 ml·min-1；进样量: 2 µl；柱温: 25oC；梯度洗脱程序见表1。
（4）MS 测定：电喷雾离子源，正离子扫描，其他参数与待测物离子通道见表2。
（5）数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素ROC曲线筛选肺癌的生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力，最终确定肺癌的生物标志物为LPC18:1(sn-1)，LPC18:2(sn-1)，LPC18:2(sn-2)，LPC19:2(sn-2)，联合预测能力见图2A。
实施例2
（1）首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型（表3），总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数，具体流程见图1。
（2）血浆样品预处理：取血浆样品100 μl于EP管中，加入甲醇10 μl，内标溶液 50μl，涡旋混合 30 s，加入乙腈400 μl，涡旋混合 3 min，冰浴超声10 min, 于 4°C 离心(12000 r /min) 5 min，取上清液进行 LC -MS 分析。
（3）液相分离：色谱柱: Kinetex XB-C18（4.6×100 mm, 2.6 µm）；流动相: A相:0.1%甲酸水 B相: 0.1%甲酸甲醇；流速: 0.4 ml·min-1；进样量: 2 µl；柱温: 25oC；梯度洗脱程序见表1。
（4）MS 测定：电喷雾离子源，正离子扫描，其他参数与待测物离子通道见表2。
（5）数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素ROC曲线筛选乳腺癌的生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力，最终确定乳腺癌的生物标志物为LPC18:2 (sn-1)，LPC 18:2 (sn-2)，LPC 22:4 (sn-1)，联合预测能力见图2B。
实施例3
（1）首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型（表3），总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数，具体流程见图1。
（2）血浆样品预处理：取血浆样品100 μl于EP管中，加入甲醇10 μl，内标溶液 50μl，涡旋混合 30 s，加入乙腈400 μl，涡旋混合 3 min，冰浴超声10 min, 于 4°C 离心(12000 r /min) 5 min，取上清液进行 LC -MS 分析。
（3）液相分离：色谱柱: Kinetex XB-C18（4.6×100 mm, 2.6 µm）；流动相: A相:0.1%甲酸水 B相: 0.1%甲酸甲醇；流速: 0.4 ml·min-1；进样量: 2 µl；柱温: 25oC；梯度洗脱程序见表1。
（4）MS 测定：电喷雾离子源，正离子扫描，其他参数与待测物离子通道见表2。
（5）数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素ROC曲线筛选结直肠癌的生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力，最终确定结直肠癌的生物标志物为LPC 17:0 (sn-1)，LPC 19:0 (sn-2)，LPC 19:1 (sn-2)，LPC 19:2 (sn-2)，联合预测能力见图2C。
实施例4
（1）首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型（表3），总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数，具体流程见图1。
（2）血浆样品预处理：取血浆样品100 μl于EP管中，加入甲醇10 μl，内标溶液 50μl，涡旋混合 30 s，加入乙腈400 μl，涡旋混合 3 min，冰浴超声10 min, 于 4°C 离心(12000 r /min) 5 min，取上清液进行 LC -MS 分析。
（3）液相分离：色谱柱: Kinetex XB-C18（4.6×100 mm, 2.6 µm）；流动相: A相:0.1%甲酸水 B相: 0.1%甲酸甲醇；流速: 0.4 ml·min-1；进样量: 2 µl；柱温: 25oC；梯度洗脱程序见表1。
（4）MS 测定：电喷雾离子源，正离子扫描，其他参数与待测物离子通道见表2。
(5) 数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素ROC曲线筛选胃癌的生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力，最终确定胃癌的生物标志物为LPC 18:0(sn-1)，LPC 19:0 (sn-2)，LPC 20:0 (sn-1)，LPC 20:0 (sn-2)，联合预测能力见图2D。

Claims (10)

1.一种基于“建模-预测”策略的靶标脂质组学方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）“建模-预测”策略：
首先以碳链长度(x1)和双键个数(x2)为自变量，去簇电压(DP)，碰撞能(CE)，保留时间(RT)，响应因子(RF)为因变量建立多元线性回归模型，总结LPC（13:0），LPC（14:0），LPC（15:0），LPC（17:0），LPC（18:1），LPC（19:0），LPC（20:0）对照品的液相质谱参数规律，得到回归模型方程，然后用该方程预测无法获得对照品的LPC的相应参数；
（2）血浆样品预处理；
（3）液相分离；
（4）MS 测定；
（5）数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA、单因素和多因素ROC曲线筛选不同癌症的生物标志物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤（2）中取血浆样品，加入甲醇、内标溶液，涡旋，超声离心，取上清液进行LC -MS 分析；其中，所述的内标溶液是LPC (13:0) ，所述的血浆与甲醇的体积比为：1:3-1:5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤（3）中液相分离的条件是：
色谱柱: Kinetex XB-C18，4.6×100 mm, 2.6 µm；
流动相: A相: 0.1-0.3%甲酸水 ，B相: 0.1-0.3%甲酸甲醇；
流速: 0.4 ml·min-1；
进样量: 2 µl；
柱温: 25oC；
梯度洗脱程序见表1：
表1 梯度洗脱程序
时间min 流动相A（%） 流动相B（%） 0.01 70 30 0.5 10 90 13 0 100 13.1 70 30 15 70 30
。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症为肺癌、乳腺癌、结直肠癌或胃癌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，肺癌的生物标志物为LPC 18:1(sn-1)，LPC18:2(sn-1)，LPC 18:2(sn-2)，LPC 19:2(sn-2)。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，乳腺癌的生物标志物为LPC 18:2 (sn-1)，LPC 18:2 (sn-2)，LPC 22:4 (sn-1)。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，结直肠癌的生物标志物为LPC 17:0 (sn-1)，LPC 19:0 (sn-2)，LPC 19:1 (sn-2)，LPC 19:2 (sn-2)。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，胃癌的生物标志物为LPC 18:0 (sn-1)，LPC19:0 (sn-2)，LPC 20:0 (sn-1)，LPC 20:0 (sn-2)。
9.权利要求1所述的方法在测定溶血磷脂胆碱的浓度中的应用。
10.权利要求1所述的方法在筛选癌症生物标记物中的应用。
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