CN109715825A - 用于检测样品中目标核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供探针、方法、试剂盒和装置，其提供样品中目标核酸的准确、快速和灵敏的多重检测、鉴定和量化。

Description

用于检测样品中目标核酸的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年5月16日递交的U.S.S.N.62 /337074和2017年5月1日递交的U.S.S.N. 62/492889的优先权和益处。每个申请的内容通过参照以其全部结合。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且特此通过参照以其全部结合。2017年5月16日创建的所述ASCII副本名为NATE-032001WO_ST25.txt，并且大小为22780字节。
发明背景
尽管目前存在多种用于检测生物样品中核酸的方法，但仍需要改进、准确、快速和灵敏的目标核酸的多路检测、鉴定和量化。本发明满足这种需要。
发明概述
本发明提供探针、方法、试剂盒和装置，其提供样品中目标核酸的准确、快速和灵敏的多重检测、鉴定和量化。
本发明的一个方面为用于检测样品中至少一种目标核酸的方法。方法包括使样品与至少一种能够识别和结合至少一种目标分子的第一特定区域的探针接触的第一步骤，其中至少一种探针包含靶结合域和条形码域，其中靶结合域包含至少4个核苷酸，优选地6个或更多个核苷酸，并且能够识别和结合目标核酸的第一特定区域，并且其中靶结合域包含已知的核苷酸序列；其中条形码域包含一种条形码域，所述条形码域包含第一附着区(其包含能够被第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子或第一杂交核酸分子结合的核酸序列)和至少第二附着区(其包含能够被至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子或至少第二杂交核酸分子结合的核酸序列)，其中第一附着区的序列不同于至少第二附着区的序列。方法进一步包括以下步骤：(2) 使包含可检测标记的第一互补核酸分子或包含可检测标记的第一报告复合物的第一互补核酸分子结合于第一附着区，从而使可检测标记与第一附着区缔合；(3) 检测与第一附着区缔合的可检测标记；(4) 去除第一可检测标记或第一互补核酸分子；(5) 使包含可检测标记的至少第二互补核酸分子或包含可检测标记的至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合于至少第二附着区，从而使可检测标记与至少第二附着区缔合；和(6) 检测与至少第二附着区缔合的可检测标记；其中与第一附着区缔合的可检测标记和与至少第二附着区缔合的可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。步骤(4)和(5)可依序或同时发生。
在实施方案中，步骤(4)的去除第一互补核酸包括使第一附着区与缺少可检测标记的第一杂交核酸分子接触，从而解除第一互补核酸分子的结合并使缺少可检测标记的第一杂交核酸分子结合于第一附着区，或者pH、盐浓度和/或温度的变化足以去除第一互补核酸分子。
在实施方案中，条形码域可包含至少第三附着区，其包含能够被至少第三互补核酸分子、至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子或至少第三杂交核酸分子结合的核酸序列，其中至少第三附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
在实施方案中，方法可进一步包括以下步骤：(7) 去除第二可检测标记或第二互补核酸分子；(8) 使包含可检测标记的至少第三互补核酸分子或包含可检测标记的至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合于至少第三附着区，从而使可检测标记与至少第三附着区缔合；和(9) 检测与至少第三附着区缔合的可检测标记；其中与第一附着区缔合的可检测标记、与至少第二附着区缔合的可检测标记和与至少第三附着区缔合的可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。步骤(7)和(8)可依序或同时发生。
在实施方案中，步骤(7)的去除第二互补核酸包括使第二附着区与缺少可检测标记的第二杂交核酸分子接触，从而解除第二互补核酸分子的结合并使缺少可检测标记的第二杂交核酸分子结合于第二附着区，或者pH、盐浓度和/或温度的变化足以去除第二互补核酸分子。
在实施方案中，条形码域可包含至少第四附着区，其包含能够被至少第四互补核酸分子、至少第四报告复合物或至少第四杂交核酸分子结合的核酸序列，其中至少第四附着区的序列不同于另一个附着区的序列。在实施方案中，条形码域可包含至少第五附着区，其包含能够被至少第五互补核酸分子、至少第五报告复合物或至少第五杂交核酸分子结合的核酸序列，其中至少第五附着区的序列不同于另一个附着区的序列。在实施方案中，条形码域可包含至少第六附着区，其包含能够被至少第六互补核酸分子、至少第六报告复合物或至少第六杂交核酸分子结合的核酸序列，其中至少第六附着区的序列不同于另一个附着区的序列。在实施方案中，条形码域可包含至少第七附着区，其包含能够被至少第七互补核酸分子、至少第七报告复合物或至少第七杂交核酸分子结合的核酸序列，其中至少第七附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
在实施方案中，重复以下步骤：去除相应的可检测标记或互补核酸分子、使包含可检测标记的互补核酸分子或包含可检测标记的报告复合物的互补核酸分子结合于相应的附着区，从而使可检测标记与相应的附着区缔合；并检测与附着区缔合的相应的可检测标记，直至条形码域中的每个附着区已被包含可检测标记的互补核酸分子依序结合，并且已经检测到依序结合的互补核酸分子的可检测标记，其中与每个附着区缔合的可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。
在实施方案中，缺少可检测标记的第一杂交核酸分子至少包含第一互补核酸分子的核酸序列。
在实施方案中，第一附着区可邻近至少一个侧翼单链多核苷酸或多核苷酸类似物。缺少可检测标记的第一杂交核酸分子可进一步包含与邻近所述第一附着区的至少一个侧翼单链多核苷酸部分互补的核酸序列。
在实施方案中，缺少可检测标记的至少第二杂交核酸分子至少包含至少第二互补核酸分子的核酸序列。
在实施方案中，至少第二附着区可邻近至少一个侧翼单链多核苷酸或多核苷酸类似物。缺少可检测标记的至少第二杂交核酸分子可包含与邻近至少第二附着区的至少一个侧翼单链多核苷酸部分互补的核酸序列。
在实施方案中，条形码域可包含合成骨架，其包括多糖、肽、肽核酸、多肽或选自单链DNA、单链RNA或单链PNA的多核苷酸。
在实施方案中，至少一种探针可包含在靶结合域和条形码域之间的单链或双链RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物或PEG间隔区。间隔区可为双链DNA。
在实施方案中，第一报告复合物的第一互补核酸分子、至少第二互补核酸分子和至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子独立地为RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物。
在实施方案中，至少第三互补核酸或第三报告复合物的至少第三互补核酸可为RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物。
在实施方案中，所述靶结合域中至少一个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。所述靶结合域中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。所述靶结合域中每个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。至少一个修饰的核苷酸或至少一个核酸类似物可为锁定核酸(LNA)。至少一个修饰的核苷酸或至少一个核酸类似物可包含通用碱基。
在实施方案中，目标核酸可首先通过至少使目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，第一捕获探针包含选择性结合于基底的第一亲和结合试剂。在实施方案中，目标核酸在结合于探针之后通过至少使目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，第一捕获探针包含选择性结合于基底的第一结合亲和试剂。在实施方案中，第一捕获探针在目标核酸上与至少一种探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。目标核酸可通过施加足以使在第一位置固定于基底的目标核酸延伸的力(例如重力、流体动力、电磁力、流动拉伸、后退弯月面技术或其组合)来延长。目标核酸可通过使目标核酸的至少第二位置与至少第二捕获探针结合而进一步固定于基底，第二捕获探针包含选择性结合于基底的亲和结合试剂。一般地，第二捕获探针在目标核酸上与至少一种探针和第一捕获探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。目标核酸可通过使探针的至少一部分或互补核酸分子或报告复合物的一部分与至少第三捕获探针结合而进一步固定于基底上，第三捕获探针包含选择性结合于基底的第三亲和结合试剂。目标核酸可通过使探针的一部分、至少一种互补核酸分子或至少一种报告复合物的一部分经第四亲和结合试剂结合于基底而进一步固定于基底上。典型的亲和结合试剂包括配体、抗原、碳水化合物、受体、凝集素、抗体、生物素、亲和素、半抗原和具有已知序列的核酸。目标核酸可以约3-至少10个位置固定于基底上。一旦目标核酸的第二位置固定于基底上，就可消除该力。在实施方案中，固定的目标核酸被延长。
在实施方案中，第一捕获探针可包含第二亲和试剂。
在实施方案中，第一捕获探针的第二亲和试剂不同于至少一种探针的第一亲和试剂。
在实施方案中，第一捕获探针可进一步包含不同于第二亲和试剂的第三亲和试剂。
在实施方案中，第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂不同。
在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目等于条形码域中不同附着区的数目。
在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目可比条形码域中不同附着区的数目多至少一个。
在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目为条形码域中附着区数目的至少两倍。
在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目为8，和条形码域中的附着区数目为3。
在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目可比条形码域中不同附着区的数目少至少一个。
在实施方案中，探针的靶结合域包含至少6个核苷酸或至少8个核苷酸。
在实施方案中，探针的靶结合域包含10-100、20-60或3550个核苷酸。
在实施方案中，至少第一附着区从条形码域上的第一位置分支出来。在实施方案中，至少第二附着区从条形码域上的至少第二位置分支出来。在实施方案中，每个附着区从条形码域上的位置分支出来。条形码域可包含含有至少两个第一附着区的第一位置，其中至少两个第一附着区包含能够被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的相同核酸序列。条形码域可包含含有两个至少第二附着区的至少第二位置，其中至少两个第二附着区包含能够被至少第二互补核酸分子或第二报告复合物的第二互补核酸分子结合的相同核酸序列。条形码域可包含含有两个至少第三附着区的至少第三位置，其中至少两个第三附着区包含能够被至少第三互补核酸分子或第三报告复合物的第三互补核酸分子结合的相同核酸序列。
在实施方案中，条形码域中的每个位置可包含相同数目的附着区。在实施方案中，条形码域中的至少一个位置可包含多于一个附着区。条形码域中的每个位置可包含多于一个附着区。
在实施方案中，条形码域中的至少一个位置可包含比另一个位置更大数目的附着区。
在实施方案中，条形码域上的至少一个位置可包含其附着区的1-50个拷贝，例如，条形码域上的每个位置可包含其附着区的1-50个拷贝。
在实施方案中，至少一种探针可包含可操作地连接于条形码域的靶结合域的多个拷贝。
在实施方案中，包含可检测标记的每种报告复合物可包含直接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
在实施方案中，包含可检测标记的每种报告复合物可包含经核酸间隔区间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
在实施方案中，包含可检测标记的每种报告复合物可包含经聚合物间隔区间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子，所述聚合物间隔区具有与核酸间隔区类似的机械性能。
在实施方案中，包含可检测标记的每种报告复合物包含经可切割接头间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
在实施方案中，可切割接头为可光切割的、可化学切割的或可酶促切割的。一般地，每个可切割接头可独立地从所有其他接头切割。
在实施方案中，可光切割的接头被光源比如弧光灯、激光、聚焦UV光源或发光二极管切割。
在实施方案中，每个互补核酸分子可包含约8个核苷酸-约20个核苷酸之间，例如约10个核苷酸、约12个核苷酸和约14个核苷酸。
在实施方案中，每个初级核酸分子可杂交于至少一个二级核酸分子，例如至少2个二级核酸分子、至少3个二级核酸分子、至少4个二级核酸分子、至少5个二级核酸分子和至少6个二级核酸分子。一个或多个二级核酸分子可包含至少一种可检测标记。
在实施方案中，二级核酸分子可包含可切割接头。例如，可切割接头为可光切割的、可化学切割的或可酶促切割的。在实施方案中，杂交于初级核酸分子的各种二级核酸分子可全部包含相同的可切割接头、没有可切割接头、各种可切割接头的组合或各种可切割接头和没有可切割接头的组合。
在实施方案中，每个二级核酸分子可杂交于至少一个包含至少一种可检测标记的三级核酸分子，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个包含至少一种可检测标记的三级核酸分子。
在实施方案中，至少一个二级核酸分子可包含不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域。在实施方案中，每个二级核酸分子可包含不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可包含直接连接于初级核酸分子的互补核酸分子的核苷酸序列。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可位于二级核酸分子的末端。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可包含约8个核苷酸-约20个核苷酸之间，例如约12个核苷酸。
在实施方案中，至少一种目标核酸可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多及其间任何数目的不同目标核酸。
在实施方案中，方法可进一步包括检测样品中的至少一种目标蛋白。
在实施方案中，至少一种目标蛋白可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多及其间任何数目的不同目标蛋白。
术语“一个或多个”、“至少一个”等被理解为包括(但不限于)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多及其间的任何数目。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或多个”、“至少第二”等被理解为包括(但不限于)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多及其间的任何数目。因此，“至少两个标记附着位置”包括(但不限于)2个标记附着位置、4个标记附着位置、6个标记附着位置、8个标记附着位置，10个标记附着位置或者更多。
本公开还提供用于检测样品中至少一种目标核酸的方法，方法包括：(1) 使样品与至少一种能够识别和结合至少一种目标分子的第一特定区域的探针接触，其中至少一种探针包含：靶结合域和条形码域，其中靶结合域包含至少4个核苷酸，并且能够识别和结合目标核酸的第一特定区域，并且其中靶结合域包含已知的核苷酸序列；其中条形码域包含一种条形码域，所述条形码域包含第一附着区(其包含被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列)和至少第二附着区(其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合)；其中第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子包含第一可检测标记，从而使可检测标记与第一附着区缔合；其中至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子包含第二可检测标记，从而使可检测标记与至少第二附着区缔合；其中第一附着区的序列不同于至少第二附着区的序列；(2) 检测与第一附着区缔合的第一可检测标记和与至少第二附着区缔合的第二可检测标记；(3) 去除第一可检测标记；(4) 检测与至少第二附着区缔合的第二可检测标记；其中与第一附着区缔合的第一可检测标记和与至少第二附着区缔合的第二可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。
步骤(4)的检测可包括减去来自步骤(4)中与至少第二附着区缔合的第二可检测标记的信号，形成来自步骤(2)中检测与第一附着区缔合的第一可检测标记和与至少第二附着区缔合的第二可检测标记的信号。
条形码域可包含第一附着区(其含有被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列)、至少第二附着区(其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合)和至少第三附着区(其被至少第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合)；其中第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子包含第一可检测标记，从而使可检测标记与第一附着区缔合；其中第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的第二互补核酸分子包含第二可检测标记，从而使可检测标记与至少第二附着区缔合；其中第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的第三互补核酸分子包含第三可检测标记，从而使可检测标记与至少第三附着区缔合；其中至少第三附着区、至少第二附着区和至少第三附着区的序列不同；(2) 检测与第一附着区缔合的第一可检测标记、与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记；(3) 去除第一可检测标记；(4) 检测与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记；(5) 去除第二可检测标记；(6) 检测与至少第三附着区缔合的第三可检测标记；其中与第一附着区缔合的第一可检测标记、与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。
步骤(4)的检测可包括减去来自步骤(4)中与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记的信号，形成来自步骤(2)中检测与第一附着区缔合的第一可检测标记、与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记的信号。
步骤(6)的检测可包括减去来自步骤(6)中与第三附着区缔合的至少第三可检测标记的信号，形成来自步骤(4)中检测与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与第三附着区缔合的至少第三可检测标记的信号。
本公开还提供用于检测样品中至少一种目标核酸的方法，方法包括：(1) 使样品与至少一种能够识别和结合至少一种目标分子的第一特定区域的探针接触，其中至少一种探针包含：靶结合域和条形码域，其中靶结合域包含至少4个核苷酸，并且能够识别和结合目标核酸的第一特定区域，并且其中靶结合域包含已知的核苷酸序列；其中条形码域包含第一附着区(其包含能够被第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子或第一杂交核酸分子结合的核酸序列)和至少第二附着区(其包含一种能够被至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子或至少第二杂交核酸分子结合的核酸序列)；其中第一附着区的序列不同于至少第二附着区的序列；(2) 使包含第一可检测标记的第一互补核酸分子或包含第一可检测标记的第一报告复合物的第一互补核酸分子结合于第一附着区，从而使可检测标记与第一附着区缔合；(3) 检测与第一附着区缔合的第一可检测标记；(4) 去除第一可检测标记或第一互补核酸分子；(5) 使包含第二可检测标记的至少第二互补核酸分子或包含第二可检测标记的至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合于至少第二附着区，从而使可检测标记与至少第二附着区缔合；和(6) 检测与至少第二附着区缔合的第二可检测标记；其中与第一附着区缔合的第一可检测标记和与至少第二附着区缔合的第二可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。步骤(4)和(5)可依序或同时发生。
条形码域可包含至少第三附着区，其包含能够被至少第三互补核酸分子、至少第三报告复合物或至少第三杂交核酸分子结合的核酸序列；其中至少第三附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
方法可进一步包括：(7) 去除第二可检测标记或第二互补核酸分子；(8) 使包含第三可检测标记的至少第三互补核酸分子或包含第三可检测标记的至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合于至少第三附着区，从而使可检测标记与至少第三附着区缔合；和(9) 检测与至少第三附着区缔合的第三可检测标记；其中与第一附着区缔合的第一可检测标记、与至少第二附着区缔合的第二可检测标记和与至少第三附着区缔合的第三可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。步骤(7)和(8)依序或同时发生。
步骤(4)的去除第一互补核酸可包括：(a) 使第一附着区与缺少可检测标记的第一杂交核酸分子接触，从而解除第一互补核酸分子的结合并使缺少可检测标记的第一杂交核酸分子结合于第一附着区，(b) pH、盐浓度和/或温度的变化足以去除第一互补核酸分子。
步骤(7)的去除第二互补核酸可包括：(a) 使第二附着区与缺少可检测标记的第二杂交核酸分子接触，从而解除第二互补核酸分子的结合并使缺少可检测标记的第二杂交核酸分子结合于第二附着区，(b) pH、盐浓度和/或温度的变化足以去除第二互补核酸分子。
条形码域可包含至少第四附着区，其包含能够被至少第四互补核酸分子、至少第四报告复合物或至少第四杂交核酸分子结合的核酸序列；其中至少第四附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
条形码域可包含至少第五附着区，其包含能够被至少第五互补核酸分子、至少第五报告复合物或至少第五杂交核酸分子结合的核酸序列；其中至少第五附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
条形码域可包含至少第六附着区，其包含能够被至少第六互补核酸分子、至少第六报告复合物或至少第六杂交核酸分子结合的核酸序列；其中至少第六附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
条形码域可包含至少第七附着区，其包含能够被至少第七互补核酸分子、至少第七报告复合物或至少第七杂交核酸分子结合的核酸序列；其中至少第七附着区的序列不同于另一个附着区的序列。
重复以下步骤：(a) 去除各自的可检测标记或互补核酸分子；(b) 使包含可检测标记的互补核酸分子或包含可检测标记的报告复合物的互补核酸分子结合于相应的附着区，从而使可检测标记与相应的附着区缔合；和(c) 检测与附着区缔合的相应的可检测标记，直至条形码域中的每个附着区已被包含可检测标记的互补核酸分子依序结合，并且已经检测到依序结合的互补核酸分子的可检测标记，其中与每个附着区缔合的可检测标记的线性或依序顺序识别至少一种目标分子的特定区域，从而检测样品中的至少一种目标核酸。
缺少可检测标记的第一杂交核酸分子可包含至少第一互补核酸分子的核酸序列。
第一附着区可邻近至少一个侧翼单链多核苷酸或多核苷酸类似物。
缺少可检测标记的第一杂交核酸分子可进一步包含与邻近所述第一附着区的至少一个侧翼单链多核苷酸部分互补的核酸序列。
缺少可检测标记的至少第二杂交核酸分子可包含至少第二互补核酸分子的至少核酸序列。
至少第二附着区可邻近至少一个侧翼单链多核苷酸或多核苷酸类似物。
缺少可检测标记的至少第二杂交核酸分子可包含与邻近至少第二附着区的至少一个侧翼单链多核苷酸部分互补的核酸序列。
步骤(3)的去除第一可检测标记可包括使第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子与对第一互补核酸分子位置的足以释放第一可检测标记的力接触。
步骤(5)的去除第二可检测标记可包括使第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的第二互补核酸分子与对第二互补核酸分子位置的足以释放第二可检测标记的力接触。
步骤(4)的去除第一可检测标记可包括使第一互补核酸分子或至少第一报告复合物的第一互补核酸分子与对第一互补核酸分子位置的足以释放第一可检测标记的力接触。
步骤(7)的去除第二可检测标记可包括使第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的第二互补核酸分子与对第二互补核酸分子位置的足以释放第二可检测标记的力接触。
第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子、至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子、至少第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子中的至少一种可包含至少一个可切割接头。
至少一个可切割接头可独立地选自可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的。每个可切割接头可独立地从所有其他接头切割。可光切割的接头可被选自弧光灯、激光、聚焦UV光源和发光二极管的光源切割。该力可为光。
本公开的方法可进一步包括从至少一种目标核酸洗涤探针。洗涤可包括足以从目标分子去除探针的pH、盐浓度和/或温度的变化。
本公开的方法可进一步包括：(i) 使样品与能够识别和结合至少一种目标分子的第二特定区域的至少第二探针接触，其中第二特定区域不同于至少一种目标分子的第一特定区域；(ii) 使样品与能够识别和结合至少一种目标分子的第一特定区域的第一探针的至少第二拷贝接触；或(iii) 使样品与能够识别和结合至少第二目标分子的第一特定区域的至少第三探针接触，其中至少第二目标分子不同于至少一种目标分子；其中探针包含：靶结合域和条形码域，其中靶结合域包含至少4个核苷酸；和其中条形码域包含一种条形码域，所述条形码域包含第一附着区(其包含被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列)和至少第二附着区(其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合)。
本公开的方法可进一步包括：(i) 使样品与能够识别和结合至少一种目标分子的第二特定区域的至少第二探针接触，其中第二特定区域不同于至少一种目标分子的第一特定区域；(ii) 使样品与能够识别和结合至少一种目标分子的第一特定区域的第一探针的至少第二拷贝接触；或(iii) 使样品与能够识别和结合至少第二目标分子的第一特定区域的至少第三探针接触，其中至少第二目标分子不同于至少一种目标分子；其中探针包含：靶结合域和条形码域，其中靶结合域包含至少4个核苷酸；和其中条形码域包含第一附着区(其包含能够被第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子或第一杂交核酸分子结合的核酸序列)和至少第二附着区(其包含能够被至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子或至少第二杂交核酸分子结合的核酸序列)。
方法可进一步包括用至少第二探针、第一探针的至少第二拷贝或至少第三探针重复权利要求3的步骤(1)-(6)。方法可进一步包括用至少第二探针、第一探针的至少第二拷贝或至少第三探针重复步骤(1)-(9)。在从至少一种目标核酸洗涤探针之后，步骤(1)-(6)或步骤(1)-(9)可重复多达约50次。
可检测标记可包含多个部分，每个部分能够通过其发射光谱鉴定。可检测标记可包括量子点、荧光部分、比色部分或其组合。优选地，可检测标记可包括荧光部分。每个部分的发射光谱可以相同或不同。至少一个部分的发射光谱可不同于其他部分。在优选方面，信号为发射光谱。在实施方案中，标记的发射光谱或光谱为可检测信号。
条形码域可包含合成骨架，其包括多糖、肽、肽核酸、多肽或选自单链DNA、单链RNA或单链PNA的多核苷酸。至少一种探针可包含在靶结合域和条形码域之间的单链或双链RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物或PEG间隔区。在一个优选方面，间隔区为双链DNA。
第一互补核酸、第一报告复合物的第一互补核酸分子、至少第二互补核酸分子和至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子可独立地为RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物。至少第三互补核酸或第三报告复合物的至少第三互补核酸可为RNA、DNA、PNA或其他多核苷酸类似物。
所述靶结合域中的至少一个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。所述靶结合域中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。所述靶结合域中的每个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。除了第一个和最后一个核苷酸之外，所述靶结合域中的每个核苷酸可为修饰的核苷酸或核酸类似物。
至少一个修饰的核苷酸或至少一个核酸类似物可为锁核酸(LNA)。至少一个修饰的核苷酸或至少一个核酸类似物可包含通用碱基。
目标核酸可首先在被探针接触之前通过至少使目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，第一捕获探针包含选择性结合于基底的第一亲和结合试剂，其中第一捕获探针在目标核酸上与至少一种探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。
目标核酸在结合于探针之后通过至少使目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，第一捕获探针包含选择性结合于基底的第一结合亲和试剂，其中第一捕获探针在目标核酸上与至少一种探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。
目标核酸可通过施加足以使在第一位置固定于基底的目标核酸延伸的力来延长。该力可为重力、流体动力、电磁力、流动拉伸、后退弯月面技术或其组合。
目标核酸可通过使目标核酸的至少第二位置与至少第二捕获探针结合而进一步固定于基底，至少第二捕获探针包含选择性结合于基底的第二亲和结合试剂，其中第二捕获探针在目标核酸上与至少一种探针和第一捕获探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。
目标核酸可通过使探针的至少一部分或互补核酸分子或报告复合物的一部分与至少第三捕获探针结合而进一步固定于基底上，至少第三捕获探针包含选择结合于基底的第三亲和结合试剂。
探针、至少一种互补核酸或至少一种报告复合物可包含第四亲和结合试剂。
目标核酸可通过使探针的一部分、至少一种互补核酸分子或至少一种报告复合物的一部分经第四亲和结合试剂结合于基底而进一步固定于基底上。
一旦目标核酸的第二位置固定于基底上，就可消除该力。
亲和结合试剂可独立地选自配体、抗原、碳水化合物、受体、凝集素、抗体、生物素、亲和素、半抗原和具有已知序列的核酸。
第一捕获探针可包含含有20-60个核苷酸的靶结合域，并且其中第一捕获探针在目标核酸上与至少一种探针结合于目标核酸的不同位置处结合目标核酸。第一捕获探针可包含含有35-50个核苷酸的靶结合域。
第一亲和结合试剂可不同于第二亲和结合试剂。
第一亲和结合试剂、第二亲和结合试剂、第三亲和结合试剂和第四亲和结合试剂中的至少一种可不同于其他亲和结合试剂。
靶结合域中的核苷酸数目可为条形码域中附着区数目的至少两倍。靶结合域中的核苷酸数目可为8，和条形码域中的附着区数目可为3。靶结合域可包含至少6个核苷酸。靶结合域可包含至少8个核苷酸。靶结合域可包含10-100个核苷酸。靶结合域可包含20-60个核苷酸。靶结合域可包含35-50个核苷酸。
每个互补核酸分子可包含约8个核苷酸-约20个核苷酸之间。每个互补核酸分子可包含约12个核苷酸。每个互补核酸分子可包含约14个核苷酸。
至少第一附着区可从条形码域上的第一位置分支出来。至少第二附着区可从条形码域上的至少第二位置分支出来。每个附着区可从条形码域上的位置分支出来。
条形码域可包含含有至少两个第一附着区的第一位置，其中至少两个第一附着区包含能够被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的相同核酸序列。
条形码域可包含含有至少两个第二附着区的至少第二位置，其中至少两个第二附着区包含能够被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合的相同核酸序列。
条形码域可包含含有至少两个第三附着区的至少第三位置，其中至少两个第三附着区包含能够被至少第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合的相同核酸序列。
条形码域中的每个位置可包含相同数目的附着区。条形码域中的至少一个位置可包含多于一个附着区。条形码域中的至少一个位置可包含比另一个位置更大数目的附着区。
至少一种探针可包含可操作地连接于条形码域的靶结合域的多个拷贝。
可包含可检测标记的每个报告复合物包含直接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。可包含可检测标记的每个报告复合物包含经核酸间隔区间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。可包含可检测标记的每个报告复合物包含经聚合物间隔区间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子，所述聚合物间隔区具有与核酸间隔区类似的机械性能。可包含可检测标记的每个报告复合物包含经可切割接头间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
可切割接头可独立地选自可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的。每个可切割接头可独立地从所有其他接头切割。可光切割的接头可被选自弧光灯、激光、聚焦UV光源和发光二极管的光源切割。
每个初级核酸分子可杂交于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个二级核酸分子。
一个或多个二级核酸分子可包含至少一种可检测标记。每个二级核酸分子可杂交于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个包含至少一种可检测标记的三级核酸分子。至少一个二级核酸分子可包含不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可包含直接连接于初级核酸分子的互补核酸分子的核苷酸序列。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可位于二级核酸分子的末端。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可包含约8个核苷酸-约20个核苷酸之间。不杂交于初级核酸分子和不杂交于三级核酸分子的区域可包含约12个核苷酸。
本公开还提供试剂盒，其包含用于实施本文公开的任何方法的试剂。
任何以上方面和实施方案可与任何其他方面或实施方案组合。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非上下文另外明确规定，否则本文使用的单词的单数形式还包括该单词的复数形式，作为实例，术语“a”、“an”和“the”应理解为单数或复数，并且术语“或”应理解为包括在内。举例来说，“元素”意指一种或多种元素。
在整个说明书中，单词“包含”或变化形式比如“包含”或“包含”应理解为意指包括所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤组。
约可理解为在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%范围内。除非从上下文另外明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献均通过参照以其全部结合。本文引用的参考文献不认为是所权利要求发明的现有技术。在发生冲突的情况下，本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而不打算为限制性的。根据以下详述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
该专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
以上和进一步特征从以下结合附图的详述中将更清楚地认识到。
图1显示本发明示例性探针的示意图。
图2显示本发明示例性探针的示意图。
图3显示本发明示例性探针的示意图。
图4显示本发明示例性探针的示意图。
图5A图解说明本发明的方法步骤。
图5B图解说明以图5A开始的本发明的方法步骤。
图5C图解说明以图5A开始的本发明的方法步骤。
图5D图解说明以图5A开始的本发明的方法步骤。
图6图解说明一步纯化的一个实例，其中探针和捕获探针一起加入到目标核酸中，从而形成三联复合物。三联复合物通过经捕获探针的亲和试剂固定于基底上进行纯化。
图7图解说明一步纯化的另一个实例，其中包含结合部分的捕获探针结合于目标核酸，然后捕获探针-目标核酸复合物经结合部分固定于基底上，并且然后探针结合于固定的复合物。
图8A图解说明多步纯化的一个实例。这里，使包含亲和试剂的探针结合于目标核酸，并且然后探针-目标核酸复合物经探针的亲和试剂进行纯化(未显示)。随后，包含结合部分的捕获探针结合于复合物以形成三联复合物。最后，三联复合物通过经捕获探针结合部分固定于基底上进行纯化。
图8B图解说明多步纯化的另一个实例。这里，使包含亲和试剂的探针结合于目标核酸，并且然后探针-目标核酸复合物经探针的亲和试剂进行纯化(未显示)。先前已经其结合部分固定于基底上的捕获探针捕获纯化的探针-目标核酸复合物，因此形成纯化和固定的三联复合物。
图8C图解说明多步纯化的另一个实例。这里，使包含亲和试剂的探针结合于目标核酸，并且然后探针-目标核酸复合物经探针的亲和试剂进行纯化(未显示)。随后，包含结合部分和亲和试剂(其不同于探针上的亲和试剂)的捕获探针结合于复合物以形成三联复合物。三联复合物经捕获探针上的亲和试剂进行纯化(未显示)。最后，纯化的三联复合物经捕获探针上的结合部分固定于基底上。
图8D图解说明多步纯化的另一个实例。这里，使包含结合部分和亲和试剂的捕获探针结合于目标核酸，并且然后捕获探针-目标核酸复合物经捕获探针的亲和试剂进行纯化(未显示)。随后，使探针结合于复合物以形成三联复合物。最后，三联复合物通过经捕获探针的结合部分固定于基底上进行纯化。
图8E图解说明多步纯化的另一个实例。这里，使包含结合部分和亲和试剂的捕获探针和结合部分结合于目标核酸，并且然后捕获探针-目标核酸复合物经捕获探针的亲和试剂进行纯化(未显示)。随后，使包含亲和试剂(其不同于捕获探针上的亲和试剂)的探针结合于复合物以形成三联复合物。三联复合物经探针上的亲和试剂进行纯化。最后，纯化的三联复合物经捕获探针上的结合部分固定于基底上。
图9A显示本发明方法的初始步骤。
图9B显示包含可检测标记的报告复合物的示意图。
图9C显示多个报告复合物，每个报告复合物包含可检测标记。
图9D显示以图9A开始的方法的进一步步骤。
图9E显示以图9A开始的方法的进一步步骤。
图9F显示以图9A开始的方法的进一步步骤。
图10显示图9D和图9E所示步骤的备选图示以及从中获得的示例性数据。所示探针的片段具有SEQ ID NO: 70序列。
图11图解说明图10所示方法的变化。所示探针的片段同样具有SEQ ID NO: 70序列。
图12A显示本发明报告复合物的各种设计。
图12B显示从图12A所示报告复合物获得的荧光计数。
图12C显示用于构建本发明报告复合物的示例性配方。
图13A显示包含“额外手柄”的报告复合物设计。
图13B显示从具有“额外手柄”的报告复合物获得的荧光计数。
图14A显示本发明报告复合物的两种示例性设计的杂交动力学。
图14B显示本发明报告复合物的两种示例性设计的杂交动力学。
图15A描述小条形码探针设计。
图15B显示当探针以较低浓度提供时用本发明方法获得的数据。
图15C显示当探针以较高浓度提供时用本发明方法获得的数据。
图16A显示用其中同时检测多种目标核酸的本发明方法获得的数据。
图16B比较了用本方法获得的数据和用包含可检测标记的探针获得的数据。
图17A证实具体DNA目标的Hyb＆Count捕获和检测。
图17B显示100plex捕获板中目标的检测。
图18显示多色报告子的强度分布。
图19显示14类模型(左)和10类模型的错误率。
图20显示双色报告探针的示意图。
图21显示用于核酸靶向捕获的探针杂交工作流程。
图22显示用于单倍型长程定相的核酸靶向捕获。
图23为图解说明使用具有可切割RPTR的预复合BC的测序循环的图示，RPTR也称为包含可检测标记和可切割接头的互补核酸分子。
图24为图解说明使用RPTR切割和图像相减来识别每个RPTR的方法的图示。
图25为可切割RPTR探针的构建图示，并且显示切割修饰的实例。
图26显示杂交的温育时间变化，并且每个视野的总计数用于确定BC/RPTR复合物与单独BC随后在第二步进行RPTR结合相比较的相对效率。使用的BC和RPTR如图27所示。BC/RPTR复合物具有比单独BC更慢的结合动力学，但是可用更长的温育时间实现类似的结合效率。
图27显示RPTR身份可使用图像相减方法确定。 BRAFex15-BC3条形码与可切割RPTR预复合并被处理一个全循环。从图像的一小部分突出显示4个特征，并且每个荧光通道的变化显示在条形图中。首先使用USER酶混合物(尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物)对结合于斑点3 (sp3)的RPTR实施切割，然后使用暴露于UV光对斑点1 (sp1)实施切割。结合于斑点2 (sp2)的RPTR不可切割。
图28显示切割后半色GY RPTR的检测和正确识别。使BC与一个UV可切割RPTR和两个不可切割RPTRS复合，并杂交于流动池表面上的固定DNA目标。在UV暴露以切割单个RPTR之前和之后确定RPTR的荧光强度，以确定在存在其他报告的情况下可检测到半色(即GY而不是GG，全色RPTR)的准确性/程度。
图29显示切割后全色GY RPTR的检测和正确识别，用于与图6进行比较。使BC与一个UV可切割RPTR和两个不可切割RPTRS复合，并杂交于流动池表面上的固定DNA目标。在UV暴露以切割单个RPTR之前和之后确定RPTR的荧光强度，以确定在存在其他报告的情况下可检测到全色(即GG)的准确性/程度。
发明详述
本发明提供探针、方法、试剂盒和装置，其提供样品中目标分子的准确、快速和灵敏的多重检测、鉴定和量化。
用于检测样品中一种或多种核酸的探针
本发明涉及包含靶结合域和条形码域的探针。靶结合域和条形码域可操作地连接，例如共价连接。探针任选地包含在靶结合域和条形码域之间的间隔区。间隔区可为具有适当机械性能的任何聚合物，例如单链或双链DNA间隔区(1-100个核苷酸，例如2-50个核苷酸)。双链DNA间隔区的非限制性实例包括SEQ ID NO: 25-SEQ ID NO: 29所涵盖的序列。可包含在条形码域中的另外示例性序列以SEQ ID NO: 30-SEQ ID NO: 69列出。
本发明探针的非限制性实例显示在图1-5中。
图1显示本发明探针的示意图。该示例性探针具有6个核苷酸的靶结合域。每个探针的靶结合域具有已知的核苷酸序列。条形码域包含一个或多个附着区；在图1中有六个附着区。第一附着区、第三附着区和第五附着区被注释。第五位置包含两个附着区。条形码域上的每个位置可具有多个附着区。例如，位置可具有1-50个附着区。条形码域中的某些位置可具有比其他位置更多的附着区(如此处所示，位置5相对于位置1-4和6)；或者，条形码域中的每个位置具有相同数目的附着区。尽管未示出，但每个附着区包含至少一个(即1-50个，例如10-30个)能够可逆性结合于互补核酸分子(RNA或DNA)的核酸序列的拷贝。在图1中，附着区对于构成线性多核苷酸分子整体是必需的，所述线性多核苷酸分子构成条形码域。附着位置的线性顺序和/或位置的线性顺序识别靶结合域结合的目标核酸的特定区域。
图2显示本发明探针的示意图。该示例性探针具有5个核苷酸的靶结合域。每个探针的靶结合域具有已知的核苷酸序列。第一附着区被注释；条形码域上的第一位置包含结合于条形码域(不是构成整体所必需)的两个第一附着区。条形码域上的第四位置被包围，其包含条形码域的一部分和两个第四附着区。两个第六附着区被注释。这里，每个位置均有两个附着区；然而，条形码域上的每个位置可具有一个附着区或多个附着区，例如2-50个附着区。尽管未示出，但每个附着区包含至少一个(即1-50个，例如10-30个)能够可逆性结合于互补核酸分子(RNA或DNA)的核酸序列的拷贝。在图2中，条形码域为附着区连接/分支的线性多核苷酸分子；附着区对于构成多核苷酸分子整体不是必需的。附着位置的线性顺序和/或位置的线性顺序识别靶结合域结合的目标核酸的特定区域。
图3显示本发明探针的另一个示意图。该示例性探针具有4个核苷酸的靶结合域。每个位置显示具有3个与该位置连接/从该位置分支的附着区。
图4显示一种本发明探针的仍然另一个示意图。该示例性探针具有10个核苷酸的靶结合域。然而，仅前6个核苷酸对目标核酸为特异性的。加入第7-第10个核苷酸(由“n1-n4”表示)以增加靶结合域的长度，从而影响探针杂交和保持杂交于目标核酸的可能性。“n”核苷酸可具有通用碱基(例如肌苷、2'-脱氧肌苷(次黄嘌呤脱氧核苷酸)衍生物、硝基吲哚、硝基吡咯(nitroazole)类似物和疏水性芳族非氢键碱基)，其可与4个规范碱基中的任何一个碱基配对。在实施方案中，“n”核苷酸可处于靶结合域的特定核苷酸前面的位置。在实施方案中，“n”核苷酸可接着靶结合域的特定核苷酸。在图4中显示4个“n”核苷酸；然而，靶结合域可包含多于或少于4个“n”核苷酸。靶结合域可能缺少“n”核苷酸。第二位置包含6个与条形码域的第二位置连接/从条形码域的第二位置分支的附着区。
靶结合域具有至少4个核苷酸，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸。靶结合域可包含10-100、20-160或35-50个核苷酸。靶结合域优选地为多核苷酸。靶结合域能够结合目标核酸。
探针可包含可操作地连接于合成骨架的靶结合域的多个拷贝。
可设计探针以控制杂交和/或去杂交的可能性以及它们的发生率。通常，探针的Tm越低，探针与/从目标核酸去杂交越快和越可能。因此，使用较低Tm探针将减少结合于目标核酸的探针数目。
靶结合域的长度部分地影响探针杂交和保持杂交于目标核酸的可能性。通常，靶结合域越长(核苷酸数目越大)，互补序列存在于靶核苷酸中的可能性越小。相反，靶结合域越短，互补序列存在于靶核苷酸中的可能性越大。例如，四聚体序列将位于目标核酸中的概率为1/256，而六聚体序列将位于目标核酸中的概率为1/4096。因此，与较长探针的集合相比较，较短探针的集合可能在更多位置结合给定的一段核酸。
术语“目标核酸”应意指一种核酸分子(DNA、RNA或PNA)，其在样品中的存在将通过本发明的探针、方法和装置确定。通常，术语“目标核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且旨在包括(但不限于)可具有各种长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)。核酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、基因间DNA (非限制性地包括异染色质DNA)、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、小干扰RNA (siRNA)、非编码RNA (ncRNA)、cDNA，重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、序列的分离DNA、序列的分离RNA、核酸探针和引物。
在某些具体实施方案中，目标分子不是染色体。在其他具体实施方案中，目标分子的大小不大于1000 kb (或1 mb)、大小不大于500 kb、大小不大于250 kb、大小不大于175kb、大小不大于100 kb、大小不大于50 kb、大小不大于20 kb或大小不大于10 kb。在仍然其他具体实施方案中，目标分子分离自其细胞环境。
本方法鉴定和量化得自样品(例如来自生物体的样品)的核酸分子，并且优选地没有转化(或扩增)步骤。作为实例，对于RNA鉴定方法，本方法不需要在可鉴定RNA之前将RNA分子转化为DNA分子(即经cDNA合成)。由于不需要扩增或转化，在大多数情况下，当核酸在样品中或当其得自样品时，本发明中的核酸将保留核酸中存在的任何独特碱基和/或表观遗传标记。这种独特碱基和/或表观遗传标记在本领域已知的许多方法中丢失。
目标核酸可得自任何核酸样品或来源，例如任何细胞、组织或生物体、体外、化学合成仪等。目标核酸可通过任何本领域公认的方法获得。在实施方案中，核酸得自临床受试者的血液样品。核酸可使用本领域熟知的方法和试剂盒从来源或样品提取、分离或纯化。
如本领域人员意识到的那样，样品可包含任何数目的物质，包括(但不限于)：几乎任何生物体的细胞(包括原代细胞和培养的细胞系两者)、细胞裂解物或提取物(包括(但不限于) RNA提取物、纯化的mRNA)、组织和组织提取物(包括(但不限于) RNA提取物、纯化的mRNA)、体液(包括(但不限于)血液、尿液、血清、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、水性或玻璃状液、初乳、痰液、羊水、唾液、***和***分泌物、汗液和***、渗出液、渗出物(例如得自脓肿或者任何其他感染或炎症部位的液体)或得自关节(例如正常关节或受疾病比如类风湿关节炎、骨关节炎、痛风或化脓性关节炎影响的关节)的液体，哺乳动物样品为优选的，并且人样品特别优选；环境样品(包括(但不限于)空气、农业、水和土壤样品)；生物战剂样品；研究样品，包括细胞外液、来自细胞培养物的细胞外上清液、细菌中的包涵体、细胞区室、细胞周质、线粒体区室。
生物分子样品可间接源自生物样本。例如，当感兴趣的目标分子为细胞转录物(例如信使RNA)时，本发明的生物分子样品可为含有通过信使RNA逆转录产生的cDNA的样品。在另一个实例中，本发明的生物分子样品通过使生物样本经受分级分离例如大小分级分离或膜分级分离而产生。
本发明的生物分子样品可为“天然的”，即不经受操作或处理，或为“处理的”，其可包括任何数目的处理，包括暴露于候选药物(包括药物)、基因工程改造(例如基因的添加或缺失)。
包含目标核酸的核酸分子可通过本领域已知的任何手段片段化。优选地，片段化通过酶促或机械手段实施。机械手段可为声处理或物理剪切。酶促手段可通过用核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶I (DNase I))或者一种或多种限制性内切核酸酶消化来实施。
当包含目标核酸的核酸分子为完整染色体时，应采取步骤以避免使染色体片段化。
目标核酸可包括天然或非天然核苷酸，包含如本领域熟知的修饰核苷酸。
本发明的探针可具有约20纳米-约50纳米的总长度 (包括靶结合域、条形码域和任何任选结构域)。探针的骨架可为包含约120个核苷酸的多核苷酸分子。
条形码域包含合成骨架。合成骨架和靶结合域可操作地进行连接，例如共价连接或经接头连接。合成骨架可包含任何材料，例如多糖、多核苷酸、聚合物、塑料、纤维、肽、肽核酸或多肽。优选地，合成骨架为刚性的。在实施方案中，骨架包含6个DNA双螺旋的“DNA折纸”(参见例如Lin et al, “Submicrometre geometrically encoded fluorescentbarcodes self-assembled from DNA.”Nature Chemistry; 2012 Oct; 4(10): 832-9)。条形码可由DNA折纸砖制成(Jungmann et al, “Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT”, Nature Methods, Vol.11, No. 3, 2014)。
条形码域包含多个位置，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位置。位置数可小于、等于或大于靶结合域中核苷酸的数目。在实施方案中，优选的是除骨架结构域中的位置数以外在靶结合域包含另外的核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。在实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目至少为条形码域中附着区数目的两倍。在另外的实施方案中，靶结合域中的核苷酸数目为8，和条形码域中的附着区数目为3。如上所述，条形码域的长度不受限制，只要有足够的空间用于至少4个位置即可。
条形码域中的每个位置包含至少一个附着区，例如1-50个或者更多附着区。条形码域中的某些位置可具有比其他位置更多的附着区(例如第一位置可具有3个附着区，而第二位置可具有2个附着位置)；或者，条形码域中的每个位置具有相同数目的附着区。每个附着区包含至少一个(即1-50个，例如10-30个)能够可逆性地被互补核酸分子(RNA或DNA)结合的核酸序列的拷贝。
每个附着区可连接于合成骨架中的修饰单体(例如修饰的核苷酸)，使得附着区从合成骨架分支。在实施方案中，附着区是构成多核苷酸骨架整体所必需的，也就是说，骨架为单个多核苷酸，并且附着区为单个多核苷酸序列的部分。在实施方案中，术语“条形码域”和“合成骨架”同义。
对于每个探针，位置中每个附着区的核苷酸序列相同。因此，在探针中，第一位置中每个第一附着区具有相同的核苷酸序列。同样，第九位置中每个第九附着区具有相同的核苷酸序列。
在探针中，位置内的每个附着区或多个附着区具有独特序列。而且，第一位置的附着区包含不同于第二位置附着区的核酸序列。因此，对于第一位置附着区的核酸序列，不存在对第二位置附着区特异性的互补核酸分子的结合。而且，对于第二位置的附着区，不存在对第三位置附着区特异性的互补核酸分子的结合。
条形码域上的每个位置可包含一个或多个(多达50个，优选地10-30个)附着区，因此，每个附着区可结合一个或多个(多达50个，优选地10-30个)互补核酸分子。在实施方案中，条形码域中至少一个位置包含多于一个附着区。在另一个实施方案中，条形码域中至少一个位置包含比另一个位置更大数目的附着区。作为实例，图1中的探针具有包含两个附着区的第五位置，和图4中的探针具有第二位置，其具有6个附着区。在实施方案中，一个位置上附着区的核酸序列相同，因此，结合那些附着区的互补核酸分子相同。
在备选实施方案中，位置上附着区的核酸序列不相同，因此，结合那些附着区的互补核酸分子不相同，例如每个包含不同的核酸序列和/或可检测标记。因此，在备选实施方案中，连接于附着区的非相同核酸分子(例如其可检测标记)的组合一起提供用于鉴定目标核酸中核苷酸的编码。
表1提供示例性序列，仅用于说明目的，用于在其条形码域中具有多达6个位置的探针的附着区和与其结合的互补核酸上的可检测标记。
表1：
如表1所示，第一附着区的核酸序列可为SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4中的一种，第二附着区的核酸序列可为SEQ ID NO: 5- SEQ ID NO: 8中的一种，和第三附着区的核酸序列可为SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 12中的一种。
表1显示给定的附着区可与包含可检测标记的4种可能互补核酸中的一种或包含可检测标记的报告复合物结合。因此，如果第一位置的附着区包含SEQ ID NO: 1，则第一位置可用GFP标记；或者，如果第一位置的附着区包含SEQ ID NO: 2，则第一位置可用RFP标记。可使用除GFP、RFP、CFP和YFP之外的可检测标记。另外，附着区的核苷酸序列可不同于表1中列出的那些。
当第一位置的附着区包含SEQ ID NO: 1，第二位置的第二附着区包含SEQ ID NO:5和第三位置的第二附着区包含SEQ ID NO: 9时，探针将具有用GFP标记的第一、第二和第三位置。该3个位置GFP编码(即可检测标记的线性顺序)识别被探针的靶结合位点(例如GATA3)结合的目标核酸。
然而，例如，当第一位置的附着区包含SEQ ID NO: 1，第二位置的第二附着区包含SEQ ID NO: 6和第三位置的第二附着区包含SEQ ID NO: 12时，探针将具有分别用GFP、RFP和YFP标记的第一、第二和第三位置。该3个位置的GFP-RFP-YFP编码(即可检测标记的线性顺序)识别被探针的靶结合位点(例如MafB)结合的目标核酸。同时，每个位置附着区的选择定义了探针骨架可产生的线性色码，该线性编码和与靶结合域的已知核苷酸序列互补的特定目标核酸缔合。
类似地，例如当第一位置的附着区包含SEQ ID NO: 1，第二位置的第二附着区包含SEQ ID NO: 6和第三位置的第二附着区包含SEQ ID NO: 11时，探针将具有分别用GFP、RFP和CFP标记的第一、第二和第三位置。该3个位置的GFP-RFP-CFP编码(即可检测标记的线性顺序)识别被探针的靶结合位点(例如Fat3)结合的目标核酸。
同时，分别结合于GATA3、MafB和Fat3的3种探针可同时应用于样品，并且由于其可检测标记的线性顺序不同，可以检测GATA3、MafB和Fat3各自的存在和数量。
在实施方案中，互补核酸分子可被可检测标记结合。在备选实施方案中，互补核酸与包含可检测标记的报告复合物缔合。
互补核酸的核苷酸序列不受限制；优选地其与已知核苷酸序列缺少基本同源性(例如50％-99.9％)，这助于避免互补核酸和目标核酸的不期望杂交。
可用于本发明的报告复合物的实例显示在图9B中。在该实例中，互补核酸连接于初级核酸分子(从其分支出来)，初级核酸分子又杂交于多个二级核酸分子，每个二级核酸分子又杂交于多个其上连接有一个或多个可检测标记的三级核酸分子。
在实施方案中，初级核酸分子可包含约90个核苷酸。二级核酸分子可包含约87个核苷酸。三级核酸分子可包含约15个核苷酸。
图9C显示一群示例性报告复合物。包含在图9C左上图中的为4种杂交于探针附着区1的复合物。存在一种类型的报告复合物用于每种可能的核苷酸，其可存在于探针靶结合域的核苷酸位置1。
报告复合物可具有各种设计。例如，初级核酸分子可杂交于至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)二级核酸分子。每个二级核酸分子可杂交于至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)三级核酸分子。示例性的报告复合物显示在图12A中。这里，“4x3”报告复合物具有一个杂交于4个二级核酸分子的初级核酸分子(其连接于互补核酸分子/从互补核酸分子分支出来)，每个二级核酸分子杂交于3个三级核酸分子(每个包含可检测标记)。在该图中，复合物的每个互补核酸长12个核苷酸(“12个碱基”)；然而，互补核酸的长度不受限制，并且可少于12或多于12个核苷酸。右下复合物包含其互补核酸与其初级核酸分子之间的间隔区。间隔区被鉴定为长20-40个核苷酸；然而，间隔区的长度为非限制性的，并且其可短于20个核苷酸或长于40个核苷酸。
图12B显示得自图12A所示的4种示例性报告复合物的可变平均(荧光)计数。在图12B中，使10 pM生物素化的目标模板附着至链霉亲和素包被的流动池表面，使10 nM报告复合物流至流动池上；温育1分钟之后，洗涤流动池，对流动池成像，并计数荧光特征。
在实施方案中，报告复合物为“预构建的”。也就是说，在使复合物与探针接触之前，复合物中的每个多核苷酸均为杂交的。用于预构建5种示例性报告复合物的示例性配方显示在图12C中。
图13A显示备选的报告复合物，其中二级核酸分子具有“额外手柄”，其不杂交于三级核酸分子并且在初级核酸分子的远端。在该图中，每个“额外手柄”长12个核苷酸(“12聚体”)；然而，其长度不受限制，并且可少于12或多于12个核苷酸。在实施方案中，“额外手柄”每个包含互补核酸的核苷酸序列；因此，当报告复合物包含“额外手柄”时，报告复合物可经报告复合物的互补核酸或经“额外手柄”杂交于探针。因此，报告复合物结合于探针的可能性增加。“额外手柄”设计还可改善杂交动力学。不受理论的束缚，“额外手柄”基本上增加报告复合物互补核酸的有效浓度。
图13B显示使用图12B所述的方法，得自具有“额外手柄”的5种示例性报告复合物的可变平均(荧光)计数。
图14A和14B显示两种示例性报告复合物的杂交动力学和荧光强度。 到约5分钟时，总计数开始平稳，表明添加的大多数报告复合物已找到可用目标。
可检测部分、标记或报告子可以多种方式结合于互补核酸或三级核酸分子，包括可检测部分(比如荧光部分、比色部分等)的直接或间接连接。可检测标记可包含多个可检测部分，每个具有可相同或不同的单个发射光谱。例如，可检测标记可包含多个荧光团，每个具有可相同或不同的发射光谱。本领域技术人员可参考涉及标记核酸的参考文献。荧光部分的实例包括(但不限于)黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、青色素、丹磺酰氯、藻青蛋白、藻红蛋白等。荧光标记及其连接于核苷酸和/或寡核苷酸描述于许多综述中，包括Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller andManak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein,editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press,Oxford, 1991); 和Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology, 26:227-259 (1991)。适用于本发明的特定方法学公开于以下参考文献样本中：美国专利第4757141、5151507和5091519。在一个方面，一种或多种荧光染料用作标记的靶序列的标记，例如，如美国专利第5188934 (4,7-二氯荧光素染料)、5366860 (可光谱分辨的罗丹明染料)、 5847162 (4,7-二氯罗丹明染料)、4318846 (醚取代的荧光素染料)、5800996 (能量转移染料)、Lee等5066580 (黄嘌呤染料)、5688648号(能量转移染料)等所公开的荧光染料。标记也可用量子点实施，如在以下专利和专利公开中所公开的量子点：美国专利第6322901、6576291、6423551、6251303、6319426、6426513、6444143、5990479、6207392、2002/0045045和2003/0017264号。本文使用的术语“荧光标记”包含通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射性质传递信息的信号传导部分。这种荧光性质包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特性、能量转移等。本文使用的荧光标记可包含多个可检测部分，每个具有可相同或不同的单个荧光吸收和/或发射性质。例如，荧光标记可包含多个荧光团，每个荧光团具有可相同或不同的发射光谱。在进一步非限制性实例中，荧光标记可包含荧光团ALEXA FLUOR™ 350、ALEXA FLUOR™ 405、ALEXA FLUOR™ 430、ALEXA FLUOR™ 532、ALEXA FLUOR™ 546、ALEXA FLUOR™ 568、ALEXA FLUOR™ 594和ALEXA FLUOR™ 647的任何组合。
易于掺入到核苷酸和/或寡核苷酸序列的市售荧光核苷酸类似物包括(但不限于)Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS RED™-5-dUTP、CASCADE BLUE™-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREEN™-5-dUTP、OREGON GREENR™ 488-5-dUTP、TEXAS RED™-12-dUTP、BODIPY TM 630/650-14-dUTP、BODIPY TM 650/665-14-dUTP、ALEXA FLUOR™ 488-5-dUTP、ALEXA FLUOR™ 532-5-dUTP、ALEXA FLUOR™ 568-5-dUTP、ALEXA FLUOR™ 594-5-dUTP、ALEXA FLUOR™ 546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS RED™-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUE™-7-UTP、BODIPY TM FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPY TM TR-14-UTP、RHODAMINEGREEN™-5-UTP、ALEXA FLUOR™ 488-5-UTP、LEXA FLUOR™ 546-14-UTP (MolecularProbes, Inc. Eugene, OR)等。或者，以上荧光团和本文提及的那些可在寡核苷酸合成期间使用例如亚磷酰胺或NHS化学添加。本领域已知用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方案(参见Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345)。2-氨基嘌呤为可在其合成期间直接掺入寡核苷酸序列的荧光碱基。核酸也可先验地用嵌入染料比如DAPI、YOYO-1、溴化乙锭、花青染料(例如SYBR Green)等染色。
可用于合成后连接的其他荧光团包括(但不限于) ALEXA FLUOR™ 350、ALEXAFLUOR™ 405、ALEXA FLUOR™ 430、ALEXA FLUOR™ 532、ALEXA FLUOR™ 546、ALEXA FLUOR™ 568、ALEXA FLUOR™ 594、ALEXA FLUOR™ 647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPYR6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、级联蓝、级联黄、丹酰、丽丝胺罗丹明B、船坞蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、太平洋蓝、太平洋橙、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红(可得自Molecular Probes,Inc., Eugene, OR)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Biosciences,Piscataway, NJ)等。也可使用FRET串联荧光团，包括(但不限于)PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)、APC-Alexa染料等。
金属银或金颗粒可用于增强来自荧光标记的核苷酸和/或寡核苷酸序列的信号(Lakowicz et al. (2003) BioTechniques 34:62)。
用于寡核苷酸序列的其他合适标记可包括荧光素(FAM, FITC)、异羟基洋地黄毒苷、二硝基苯酚(DNP)、丹酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6xHis)、磷-氨基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)等。在一个实施方案中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体用可检测标记衍生化：生物素/α-生物素、异羟基洋地黄毒苷/α-异羟基洋地黄毒苷、二硝基苯酚(DNP)/α-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/a-FAM。
本文所述可检测标记为可光谱分辨的。关于多种荧光标记“可光谱分辨的”意指标记的荧光发射带足够清晰，即足够不重叠，使得各标记连接的分子标签可通过标准光电探测***(例如采用带通滤波器和光电倍增管***等)，基于由相应标记产生的荧光信号区分，以美国专利第4230558、4811218号等或者在Wheeless et al., pgs. 21-76, in FlowCytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985)中所述***为例。在一个方面，可光谱分辨的有机染料(比如荧光素、罗丹明等)意指波长发射最大值间隔至少20 nm，并且另一方面间隔至少40 nm。另一方面，可光谱分辨的螯合镧系元素化合物、量子点等意指波长发射最大值间隔至少10 nm，并且另一方面间隔至少15 nm。
用于检测核酸的方法
本发明涉及用于使用本发明探针检测核酸的方法。方法的实例显示在图6-11中。
方法包括使至少一种本发明探针可逆性地杂交于固定于 (例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位置)基底的目标核酸。
基底可为本领域已知的任何固体支持物，例如包被的载玻片和微流体装置，其能够固定目标核酸。在某些实施方案中，基底为表面、膜、珠粒、多孔材料、电极或阵列。目标核酸可固定至本领域技术人员显而易见的任何基底上。
在实施方案中，目标核酸被捕获探针结合，捕获探针包含与目标核酸的一部分互补的结构域。该部分可为目标核酸的末端或不朝向末端。
示例性的有用基底包括包含选自配体、抗原、碳水化合物、核酸、受体、凝集素和抗体的结合部分的那些基底。捕获探针包含能够与基底的结合部分结合的结合部分。包含反应性部分的示例性有用基底包括(但不限于)包含环氧、醛、金、酰肼、巯基、NHS-酯、胺、硫醇、羧酸酯、马来酰亚胺、羟甲基膦、亚氨酸酯、异氰酸酯、羟基、五氟苯基酯、补骨脂素、吡啶基二硫化物或乙烯基砜、聚乙二醇(PEG)、水凝胶或其混合物的表面。这种表面可得自商业来源或根据标准技术制备。包含反应性部分的示例性有用基底包括(但不限于)OptArray-DNA NHS基团(Accler8)、Nexterion Slide AL (Schott)和Nexterion Slide E (Schott)。
在实施方案中，捕获探针的结合部分为生物素，并且基底包含亲和素(例如链霉亲和素)。包含亲和素的有用基底可市售得到，包括TB0200 (Accelr8)、SAD6、SAD20、SAD100、SAD500、SAD2000 (Xantec)、SuperAvidin (Array-It)、链霉亲和素载玻片(目录号#MPC000, Xenopore)和STREPTAVIDINn载玻片(目录号#439003, Greiner Bio-one)。
在实施方案中，捕获探针的结合部分为亲和素(例如链霉亲和素)并且基底包含生物素。包含可市售得到的生物素的有用基底包括(但不限于)Optiarray-生物素(Accler8)、BD6、BD20、BD100、BD500和BD2000 (Xantec)。
在实施方案中，捕获探针的结合部分可包含能够通过光活化结合于基底的反应性部分。基底可包含光反应性部分，或者纳米报告子的第一部分可包含光反应性部分。光反应性部分的一些实例包括芳基叠氮化物比如N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮基水杨酰胺、氟化芳基叠氮化物比如4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸、基于二苯甲酮的试剂比如4-苯甲酰基苯甲酸的琥珀酰亚胺酯和5-溴-脱氧尿苷。
在实施方案中，捕获探针的结合部分可经本领域技术人员显而易见的其他结合对固定于基底上。
在结合于基底之后，目标核酸可通过施加足以使目标核酸延伸的力(例如重力、流体动力、电磁力“电拉伸”、流动拉伸、后退弯月面技术及其组合)来延长。
目标核酸可被第二捕获探针结合，第二捕获探针包含与目标核酸的第二部分互补的结构域。该部分可为目标核酸的末端或不朝向末端。第二捕获探针的结合可发生在目标核酸延长之后或期间，或者发生于尚未延长的目标核酸。第二捕获探针可具有如上所述的结合。
捕获探针可包含可检测标记或与可检测标记缔合，即基准点。
捕获探针能够从样品分离目标核酸。这里，将捕获探针加入到包含目标核酸的样品中。捕获探针经与目标核酸的区域互补的捕获探针区域结合目标核酸。当目标核酸接触包含结合捕获探针结合部分的部分的基底时，核酸变为固定至基底上。
为了确保使用者从高度片段化样品中“捕获”尽可能多的目标核酸分子，包含多个捕获探针，每个捕获探针与目标核酸的不同区域互补是有帮助的。例如，可存在3个捕获探针池，第一池与目标核酸靠近其5'末端的区域互补，第二池与目标核酸中间区域互补，和第三池靠近其3'末端。这可概括为每个目标核酸“n个感兴趣区”。在该实例中，片段化目标核酸的每个单个池与包含或结合于生物素标签的捕获探针结合。对于每个池室分离输入样品的1/n (其中n =目标核酸中不同区域的数目)。捕获探针结合感兴趣的目标核酸。然后目标核酸经捕获探针的生物素固定于粘附于基底的亲和素分子上。任选地，目标核酸例如经流动或静电力被拉伸。所有n个池可同时拉伸和结合，或者为了最大化完全拉伸的分子数目，池1 (其捕获最5'区域)可被首先拉伸和结合；然后池2 (其捕获目标中间区域)然后可被拉伸和结合；最后池3可被拉伸和结合。
所需不同捕获探针的数目与目标核酸片段的大小反相关。换句话说，高度片段化的目标核酸将需要更多的捕获探针。对于具有高度片段化和降解的目标核酸的样品类型(例如***固定石蜡包埋组织)，包含多个捕获探针池可能是有用的。另一方面，对于具有长目标核酸片段的样品，例如体外获得的分离核酸，5'末端的单个捕获探针可能就足够了。
本发明的探针或捕获探针可包含一种或多种亲和试剂，每种亲和试剂选自配体、抗原、碳水化合物、核酸、受体、凝集素、半抗原和抗体。亲和试剂使得能够纯化由探针或捕获探针和目标核酸形成的复合物。这种纯化富集待检测目标核酸的浓度。
在实施方案中，亲和试剂为生物素和纯化手段(例如附着于固体支持物)包含亲和素(例如链霉亲和素)。
在实施方案中，亲和试剂为亲和素(例如链霉亲和素)和纯化手段(例如附着于固体支持物)包含生物素。
在实施方案中，亲和试剂包含具有已知序列的核酸。因此，包含亲和试剂的探针或捕获探针可使用包含与亲和试剂互补的核酸的纯化探针从样品中纯化。同样地，包含含有亲和试剂的探针或捕获探针的复合物可使用包含与亲和试剂互补的核酸的纯化探针从样品中纯化。用于相同目标核酸的探针和捕获探针的亲和部分可具有不同核酸序列。或者，用于探针的亲和试剂和用于捕获探针的亲和试剂(各自用于相同的目标核酸)可具有相同核酸序列。用于探针群中每种探针的每种亲和试剂可具有相同核酸序列。用于捕获探针群中每种捕获探针的每种亲和试剂可具有相同核酸序列。用于探针群中每种探针的每种亲和试剂可具有不同核酸序列。用于捕获探针群中每种捕获探针的每种亲和试剂可具有不同核酸序列。
在实施方案中，亲和试剂为半抗原和纯化手段(例如附着于固体支持物)包含蛋白质结合域(例如抗体)。
图5A显示结合于目标核酸的探针示意图。这里，目标核酸包含TCAGTG序列。探针的条形码域被设计具有附着区，其特异性识别具有特定线性色码或“可检测标记的线性顺序”的结合的TCAGTG。在上图显示包含可检测标记或报告复合物的第一互补核酸池，该池的每个成员具有不同的核苷酸序列和相关的可检测标记(例如绿色标记和青色标记)。作为实例，第一池的核酸具有与表1的SEQ ID NO: 1-4互补的序列。在图5A中，探针的第一附着区包含一个或多个核苷酸序列，其指定第一位置应标记有青色标记(例如附着区包含表1的SEQ ID NO: 3)。因此，只有对第一附着位置特异性并且携带青色标记的互补核酸可结合所示探针条形码域的第一位置。青色标记为线性色码的第一种颜色，其识别结合的目标核酸。
与第一位置相关的颜色被成像并记录在本发明***中。
互补核酸或报告复合物池的数目与条形码域的位置数相同。因此，对于具有6个位置的条形码域，将在探针上循环6个池。
当将捕获探针加入到包含目标核酸的样品时，探针可被最初提供给目标核酸(参见图6)。这种探针可以不同浓度、不同缓冲条件(比如盐)和不同温度提供以提高对目标核酸的灵敏度和特异性。
捕获探针和探针可具有用于多阶段纯化的亲和试剂(参见图7和8A-8E)。其中您可单独使用任何一种纯化方法，也可从两端纯化。纯化将提高目标捕获的特异性和纯度。
探针可被提供给目标核酸并且最初结合于目标核酸，其完全缺少包含可检测标记的互补核酸或包含可检测标记的报告复合物。这种探针将小于包含可检测互补核酸的探针。这种探针可以比包含可检测标记的探针更高的浓度提供。这种小探针将更快速和更有效地结合于目标核酸。因此，以使用包含可检测标记的探针所需的一小部分时间提供数据。
或者，在使目标核酸与探针接触之前，探针可在其第一位置杂交于包含可检测标记或报告复合物的互补核酸。因此，当与其目标核酸接触时，探针能够从其第一位置发射可检测信号，并且不必提供针对条形码域上第一位置的第一互补核酸或报告复合物池。
图5B继续图5A所示的方法。这里，结合于条形码域第一位置附着区的第一互补核酸(或报告复合物)已用缺少可检测标记的第一杂交核酸置换。第一杂交核酸和缺少可检测标记取代先前结合的包含可检测标记的互补核酸或先前结合的报告复合物。从而，条形码域的第一位置不再发出可检测信号。
杂交核酸和缺少可检测标记可包含与先前结合的包含可检测标记的互补核酸或先前结合的报告复合物相同的序列(例如SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 24)。优选地，杂交核酸和缺少可检测标记将比先前结合的包含可检测标记的互补核酸或先前结合的报告复合物更长。为此，杂交核酸进一步包含与邻近附着区的单链多核苷酸或多核苷酸类似物区域互补的序列。不受理论的束缚，长于其包含可检测标记的相关互补核酸的杂交核酸将对条形码域具有更大的亲和力并且易于置换包含可检测标记的互补核酸。这种长于其相关互补核酸的杂交核酸显示在图10和11中。
在实施方案中，包含可检测标记的互补核酸或报告复合物可从附着区去除，但不用缺少可检测标记的杂交核酸置换。这可例如通过加入离液剂、升高温度、改变盐浓度、调节pH和/或施加流体动力来发生。在这些实施方案中，需要较少的试剂(即缺少可检测标记的杂交核酸)。
图5C继续要求保护的发明的方法。第二互补核酸或报告复合物池显示在上图(例如具有与表1的SEQ ID NO: 5-8互补的序列)，池的每个成员具有不同可检测标记和不同核苷酸序列。此外，第一池的互补核酸或报告复合物的互补核酸的核苷酸序列不同于第二池那些的核苷酸序列。这里，仅来自第二池并包含黄色可检测标记的互补核酸结合条形码域的第二位置(例如互补核酸具有与表1的SEQ ID NO: 8互补的序列)。
与第二位置相关的颜色被成像并记录在本发明***中。
在实施方案中，图5C所示的步骤继图5B所示的步骤之后。这里，一旦第一池互补核酸或报告复合物(图5A)已被缺少可检测标记的第一杂交核酸置换(图5B中)，则提供第二池互补核酸或报告复合物(如图5C所示)。或者，图5C所示的步骤与图5B所示的步骤同时进行。这里，缺少可检测标记的第一杂交核酸(图5B中)与第二池互补核酸或报告复合物同时提供(如图5C所示)。
图5D继续图5C所示的方法。这里，条形码域上的第一至第五位置被包含可检测标记的互补核酸或报告复合物结合，与其位置相关的颜色被成像和记录，并且互补核酸已被缺少可检测标记的杂交核酸置换。条形码域的第六位置目前被包含可检测标记的互补核酸或报告复合物结合，将靶结合域中的第六位置鉴定为结合于鸟嘌呤(G)。
与第六位置相关的颜色被成像并记录在本发明***中。
此时，已检测到探针骨架的全部线性色码(即可检测标记的线性顺序)；然后，该线性编码与同靶结合域的已知核苷酸序列互补的特定目标核酸相关联。作为实例，可发出绿色、青色、红色、黄色、黄色、红色线性色码的探针能够结合于Fat2。因此，如果本发明***记录绿色、青色、红色、黄色、黄色、红色线性色码，则使用者将知道样品中存在Fat2。
由于与探针骨架结构域相关的每种颜色被依序检测，因此探针骨架可能不必延长以区分和分辨每种颜色标记。这是优于前几代核酸检测探针的有利条件。
如上所述，包含可检测标记的互补核酸或报告复合物可从附着区去除，但不用缺少可检测标记的杂交核酸置换。
如果需要，可检测标记交换率可通过掺入加速可检测标记交换率的小单链寡核苷酸来加速(例如“Toe-Hold” Probes; 参见例如Seeling et al., “Catalyzed Relaxationof a Metastable DNA Fuel”; J. Am. Chem. Soc. 2006, 128(37), pp12211-12220)。
与图5A-5D类似，图9A和9D-9F显示本发明的方法步骤；然而，图9A和9D-9F清楚地显示报告复合物(包含可检测标记)结合于探针的附着区。图9D和9E显示从杂交于报告复合物的探针依序发出的荧光信号。
图10概述图9D和9E所示的步骤。在图的上图显示示例性探针的核苷酸序列并鉴定探针的重要结构域。探针在其靶结合域和其条形码域之间包含任选的双链DNA间隔区。条形码域依次包含“侧翼1”部分、“AR-1”部分、“AR-1 /侧翼2”部分、“AR-2”部分和“AR-2/侧翼3”部分。在步骤1中，“AR-1检测”杂交于探针的“AR-1”和“AR-1/侧翼2”部分。“AR-1检测”对应于包含可检测标记的报告复合物或互补核酸，其编码第一位置胸苷。因此，步骤1对应于图9D。在步骤2中，“缺少1”杂交于探针的“侧翼1”和“AR-1”部分。“缺少1”对应于缺少对探针第一附着区特异性的可检测标记的杂交核酸(如图9E所示，作为覆盖第一附着区的黑条)。通过杂交于报告复合物或互补核酸5'的“侧翼1”位置，杂交核酸更有效地从探针中置换报告复合物/互补核酸。“侧翼”部分也称为“立足点”。在步骤3中，“AR-2检测”杂交于探针的“AR-2”和“AR-2 /侧翼3”部分。“AR-2检测”对应于包含可检测标记的报告复合物或互补核酸，其编码第二位置鸟嘌呤。 因此，步骤3对应于图9E。在该实施方案中，依序提供缺少可检测标记的杂交核酸和包含可检测标记的互补核酸/报告复合物。
或者，同时提供缺少可检测标记的杂交核酸和包含可检测标记的互补核酸/报告复合物。该备选实施方案显示于图11中。在步骤2中，提供“缺少1”(缺少可检测标记的杂交核酸)以及“AR-2检测”(编码第二位置鸟嘌呤的报告复合物)。该备选实施方案可比图10所示的实施方案更加时间有效，因为其将两个步骤合二为一。
本公开的可检测标记可通过本领域已知的任何手段检测。例如，可检测标记可通过包括显微镜、摄像机、微处理器和/或计算机***中一种或多种的***检测。在一个方面，摄像机为CCD摄像机。在一个方面，显微镜、摄像机和计算机***可包含互补金属氧化物半导体(CMOS芯片)。
多种核酸的多重检测
在实施方案中，同时检测多种核酸，即多重检测。为此，向固定的核酸目标样品提供一组或一群不同探针。一组或一群探针优选地包含至少两种，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种探针。
一组探针可基于待靶向细胞类型或组织类型预定义。例如，如果组织为乳腺癌，则该组探针将包括针对与乳腺癌细胞相关的表达核酸(例如Her2、EGFR和PR)的探针和/或针对在正常乳腺组织表达核酸的探针。另外，该组探针可基于待靶向细胞或组织的发育状态来预定义。
NanoString Technologies® nCounter®***和方法使得能够同时多重鉴定多种(800或更多种)不同目标蛋白和/或目标核酸。
定义：
在某些示例性的实施方案中，本文使用的术语“退火”和“杂交”可互换使用以意指形成稳定的双链体。在一个方面，稳定的双链体意指双链结构在比如比双链的Tm低约5℃或高约5℃的温度和低单价盐浓度(例如小于0.2 M或小于0.1 M或本领域技术人员已知的盐浓度)的条件下不会被严格洗涤破坏。当用于指涉双链体时，术语“完美匹配”意指构成双链体的多核苷酸和/或寡核苷酸链彼此形成双链结构，使得每条链中的每个核苷酸进行与另一条链中核苷酸的Watson-Crick碱基配对。术语“双链体”包括(但不限于)可采用的核苷类似物(比如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷、PNA等)的配对。两个寡核苷酸之间的双链体“错配”意指双链体中的一对核苷酸未能进行Watson-Crick键合。
本文使用的术语“杂交条件”一般地包括小于约1 M，更通常小于约500 mM和甚至更通常小于约200 mM的盐浓度。杂交温度可低至5℃，但一般地高于22℃，更一般地高于约30℃，并且通常超过约37℃。杂交通常在严格条件下，例如在探针特异性杂交于其目标子序列的条件下实施。严格条件为序列依赖性的，并且在不同情况下不同。较长片段可能需要较高的杂交温度以进行特异性杂交。由于其他因素可能影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，参数的组合比单独任何一种的绝对测量更重要。
通常，严格条件选择为在特定离子强度和pH下比特定序列的Tm低约5℃。示例性的严格条件包括在pH 7.0-8.3和至少25℃的温度下盐浓度为至少0.01 M至不超过1 M Na离子浓度(或其他盐)。例如，5X SSPE (750 mM NaCl, 50 mM磷酸钠, 5 mM EDTA, pH 7.4)的条件和25-30℃的温度适合于等位基因特异性探针杂交。对于严格条件，参见例如Sambrook, Fritsche and Maniatis,“Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ndEd.”Cold Spring Harbor Press (1989)和Anderson Nucleic Acid Hybridization, 1stEd., BIOS Scientific Publishers Limited (1999)。本文使用的术语“特异性杂交于”或“特异性杂交于”或类似术语是指分子在严格条件下与一个或多个特定核苷酸序列基本上结合、形成双链体或杂交。
与探针的特定位置缔合的可检测标记可“读出”(例如检测其荧光)一次或多次，“读出”可与术语“碱基响应”同义。多次读取提高准确性。
本文使用的“杂交和测序循环”是指检测特定探针或探针群上每个附着区所需的所有步骤。例如，对于能够检测目标核酸上6个位置的探针，一个“杂交和测序循环”将至少包括使探针杂交于目标核酸、使互补核酸/报告复合物杂交于探针条形码域上6个位置中的每个附着区，并检测与6个位置中的每个缔合的可检测标记。
术语“k聚体探针”与本发明的探针同义。
可使用能够实施方法和/或记录结果的任何设备来实施本文所述方法和/或记录结果。可使用设备的实例包括(但不限于)电子计算设备，包括所有类型的计算机。当以计算机实施和/或记录本文所述方法时，可用于配置计算机以实施方法步骤的计算机程序可包含在能够包含计算机程序的任何计算机可读介质中。可使用的计算机可读介质的实例包括(但不限于)磁盘、CD-ROM、DVD、ROM、RAM、非暂时性计算机可读介质及其他存储器和计算机存储设备。可用于配置计算机以实施方法步骤、识别所结合目标核酸和/或记录结果的计算机程序也可经电子网络例如经互联网、内联网或其他网络提供。
“消耗卡”可结合到本领域已知的荧光成像设备中。具有许多不同特征的任何荧光显微镜均能够实施该种读出。例如：宽视场灯、激光、LED、多光子、共焦或全内反射照明可用于激发和/或检测。可在荧光显微镜的发射检测通道上使用具有基于滤光器或基于光栅的光谱分辨率(一种或多种光谱分辨发射波长)的摄像机(单个或多个)和/或光电倍增管(单个或多个)。标准计算机可控制消耗卡、流经卡的试剂和经荧光显微镜的检测。
探针可使用市售可得到的针筒、软件、***(例如使用nCounter®针筒的nCounter®***)来检测和量化。
与本发明相关的另外讲授描述于以下中的一个或多个中：U.S. 8148512、U.S.7473767、U.S. 7919237、U.S. 7941279、U.S. 8415102、U.S. 8492094、U.S. 8519115、U.S.2009/0220978、U.S. 2009/0299640、U.S. 2010/0015607、U.S. 2010/0261026、U.S. 2011/0086774、U.S. 2011/0145176、U.S. 2011/0201515、U.S. 2011/0229888、U.S. 2013/0004482、U.S. 2013/0017971、U.S. 2013/0178372、U.S. 2013/0230851、U.S. 2013/0337444、U.S. 2013/0345161、U.S. 2014/0005067、U.S. 2014/0017688、U.S. 2014/0037620、U.S. 2014/0087959、U.S. 2014/0154681、U.S. 2014/0162251和U.S. 14/946386，其每一个本文通过参照以其全部结合
任何以上方面和实施法案可与这里概述和/或详述部分中公开的任何其他方面或实施方案组合。
实施例
实施例1：本发明提供目标核酸的快速和高效检测
在图15A中，“小条形码”探针含有30-50聚体范围内的条形码序列和目标检测序列。“探针B”具有特异性序列(30-50聚体)和带有生物素用于沉积到表面的通用标签。
可提供高浓度的探针并应用于包含目标核酸的样品。可以比包含可检测标记的探针高10倍-1000倍的浓度提供本发明探针。这种高浓度探针部分地提供目标核酸的快速检测。
在图15B中探针以250 pM提供和在图15C中探针以2.5 nM提供。在利用标准nCounter工作流程的其他实验中，包含可检测标记的探针以25 pM提供。在图15A中捕获探针以100 pM提供和在图15B中捕获探针以2.5 nM提供。在利用标准nCounter工作流程的其他实验中，包含可检测标记的捕获探针以100 pM提供。图15A和15B显示目标核酸可在10分钟之后检测到。这些实验中的重要目标检测用较低浓度的探针在约2小时内和用较高浓度的探针在约30分钟内实现(图16A)。在利用标准nCounter工作流程的其他实验中，包含可检测标记的探针需要约16个半小时来检测目标核酸。
图16A显示当使用本发明的探针和方法同时检测4种目标核酸时的平均计数。这里，4种目标核酸为Myc (绿色)、Oaz1 (蓝色)、RPL13A (橙色)和TubB (红色)。探针和捕获探针以2.5 nM提供，目标核酸为100 ng人参考RNA。图16B显示本方法是其中探针提供有可检测标记(在图中标识为“Sprint”)的方法效率的约9倍。与标准nCounter工作流程相比较，这些结果显示效率在短得多的时间内显著提高。
实施例2：用于处理用于Hyb＆Count的FFPE组织的样品制备
首先，以一步法从***固定石蜡包埋(FFPE)的组织提取待测序的核酸。在水基核酸提取缓冲液中加热一个或多个10 μm厚的FFPE卷，以同时熔化石蜡、分解组织并从细胞中释放核酸。合适的提取缓冲液为本领域已知的，并且一般地包含蛋白酶、洗涤剂比如Triton-100、螯合剂比如EDTA和铵离子。将FFPE卷和提取缓冲液在56℃下温育30分钟以使石蜡与组织分离并使得蛋白酶K能够消化组织结构并使包埋的细胞暴露于洗涤剂以使得细胞裂解。将溶液以8分钟间隔倒置3次，以助于在组织脱蜡和消化过程期间混合试剂。在该步骤之后，将溶液加热至98℃以促进甲醛交联的逆转，以进一步助于提取核酸。
一旦核酸已从FFPE组织提取，使用具有2.7 μm孔径的玻璃纤维过滤器(Whatman)过滤溶液以去除组织碎片和凝固的石蜡。生成的溶液为均匀的半透明溶液，其含有由于***固定过程和储存条件而高度片段化的核酸。如果需要进一步片段化，可使用Covaris聚焦超声发生器对DNA进行机械剪切。由于缓冲条件，需要延长声处理来剪切核酸。使用50W峰值入射功率、20％占空因数、200次循环/突发脉冲的标准设置进行声处理600秒，以实现捕获目标的最大增加(如图所示)。为了实现更短的片段长度，通过在21000 g和4℃下离心15分钟，可使乳化的石蜡从滤液中沉淀出来。这使得能够将DNA剪切至约225 bp。
接下来，通过在快速杂交步骤期间使捕获探针对与目标结合来实施目标捕获。5'捕获探针含有3'生物素部分，使得目标能够在目标沉积过程期间结合于链霉亲和素包被的流动池表面。3'捕获探针含有5'标签序列(G序列)，使得在纯化过程期间结合于珠粒。反应速率被捕获探针浓度驱动，其以低纳摩尔范围加入以使反应速率最大化。捕获探针以侧翼于感兴趣区域的方式杂交于目标以产生窗口。对于每个DNA目标，捕获探针组还包括由与窗口相同的序列组成的寡核苷酸(oligo)，以杂交于目标的反义链并防止再退火。将含有捕获探针的溶液加热至98℃持续3分钟以使基因组DNA变性，随后在65℃下温育15分钟。在400mM-600 mM范围内的NaCl浓度用于该杂交反应。已被实验验证的超过100个目标组列于表2中，详述了被靶向DNA区域的基因和外显子。
表2
在被靶向的DNA区域与捕获探针结合之后，从基因组DNA的其余部分纯化它们以产生富集的目标溶液。将用反义寡核苷酸(反义G序列)包被到3'捕获探针结合序列的珠粒与捕获反应混合物在室温下一起温育15分钟。在结合步骤之后，珠粒用0.1 x SSPE洗涤3次以去除非目标DNA和含有生物素的5'捕获探针。洗涤后，将珠粒重新悬浮于14 μL的0.1 x SSPE中，然后在45℃下加热10分钟以从珠粒洗脱纯化的DNA目标。洗脱之后，加入1 μL的5 M NaCl以确保捕获探针保持结合于DNA目标。
样品制备过程的最后步骤为将DNA目标沉积至流动池表面，其中可使用本文公开的本发明探针分析它们。利用注射泵来控制目标被加载到流动池流体通道中的速率，使得所有目标具有跨越通道高度扩散并结合于链霉亲和素表面的时间。该加载方法产生目标的密度梯度，其中每单位面积的最高分子数目在流体通道入口处最大，并且沿着通道长度在朝向出口的流体流动方向上减小。对于1.6 mm的通道宽度和40 μm的高度，0.35 μL/秒的流速在约10 mm通道长度内实现定量捕获。一旦目标通过生物素化的5'捕获探针结合于表面，就注入生物素化的寡核苷酸(G-钩)溶液，其为3'捕获探针结合序列的反向互补序列，以固定目标的游离端，目的是创建桥接结构，其中中间的ssDNA区域为感兴趣的窗口。接下来，加入G-序列寡核苷酸的溶液以杂交于表面的过量G-钩，减少表面的ssDNA量。
为了鉴定已被富集的目标，设计15聚体探针，使得其可特异性地与组中的单个目标结合。这些探针在3'末端用衔接子序列合成，可使其连接于独特的条形码寡核苷酸上。每个条形码寡核苷酸含有3个独特的报告结合域，其能够结合报告探针以进行目标识别，使得使用四色报告化学进行64-plex读出。将这些鉴定探针注入到流体通道中并温育1分钟以使得能够杂交于目标。随后，使用0.1 x SSPE的严格洗涤来去除未结合和非特异性结合的寡核苷酸。基于目标的独特条形码，使用3轮报告探针杂交来鉴定目标。使用目标特异性鉴定探针捕获基因组选定区域的双捕获探针***的组合提供用于目标富集和检测的高度特异性***。图17A描绘了特异性，其中一组40个目标被捕获并从3 μg纯化的剪切gDNA计数。泳道1显示与其中没有gDNA存在的泳道2相比较，当所有捕获探针一起使用时的通常目标检测的计数。通过仅包含捕获探针来验证***的特异性，所述捕获探针富集在泳道3用蓝色和黄色报告子或在泳道4用绿色和红色检测的目标。
这种DNA提取、捕获和检测的工作流程应用于3种FFPE组织类型：扁桃体、肺和黑素瘤。对于所有组织类型，捕获和检测100plex癌症目标组导致在1-log均匀性内识别了>95％的目标。3种组织类型中这些目标的计数显示在图17B中。
实施例3：Hyb＆Seq的多色报告图像处理
图像处理流水线包括以下步骤：背景减法、配准、特征检测和分类。在背景减法中，任何给定通道的平均背景为散粒噪声和曝光的函数。在我们的***中，蓝色通道具有最高背景水平和更大方差。具有半径为7像素的圆形结构元素的简单顶帽滤光器用于实施局部背景减法。
对于配准，必须将感兴趣的特征完美地对准多色和多循环特征分析。该***需要两种配准形式。对于第一种形式，将局部仿射变换应用于单个采集栈内的所有图像通道。该变换为光学***的函数，并因此对于给定仪器为一致的。该函数针对每次运行预先计算，并应用于获取的每个图像。对于第二种形式，使用归一化互相关联来计算刚性移位形式的全局变换，以捕获运行期间机械机架的漂移。
下一步为特征检测。一旦所有图像均被配准，就使用匹配滤光器即LoG (Laplaceof Gaussian)滤光器来检测特征。滤光器应用固定的内核尺寸(与特征的衍射极限相匹配)和不同的标准偏差(与相应通道的波长相匹配)以匹配光斑响应增强。局部最大值用于识别潜在的报告子位置。检索每个被识别特征的相关强度值以进行分类。
最后步骤为分类。使用Gaussian naïve-Bayes模型对多色报告子强度进行分类。模型假设报告子强度为独立的并且遵循正态分布。然后，模型使用最大后验或MAP规则计算具体特征 (由所有通道的强度指定)属于某类的概率：
报告的双色编码的强度分布显示在图18中。该图图解说明使用2种染料蓝色和红色的编码方案。在双色编码场景中可有6个类别(包括背景)。在实施的***中，选择4种颜色导致14种潜在类别。请注意，在单个半染料对比全染料分布之间存在一些重叠。因此，这些类别之间的分类呈现出更高错误率，如图19所示，“xG”和“GG”之间的最大错误分类率为11.8％。10类模型的错误分类率低于0.2％。由于每种报告子需要最多8个类别，因此很简单选择分类错误最少的类别。
实施例4：双色报告探针的功能、设计、制备和测试
双色报告探针依序结合于探针条形码域的3个区域(R1、R2、R3)。每个区域编码由双色荧光组合定义的8种“颜色”，比如“蓝-蓝”或“绿-黄”。报告每种探针的3种依序“颜色”，其又对应于构成六聚体序列的3种二核苷酸读数。双色报告探针设计如下：双色报告探针为37种DNA寡聚体分支结构，被设计对于每种颜色容纳15种荧光染料，每种报告探针总共30种染料。37种寡聚体分为3种大小：(1) 一种96 nt的主要分支由两部分组成，后来用于报告六聚体的12聚体单链DNA序列和6种杂交于6种子分支的14聚体，(2) 6种89 nt子分支中的每种由两部分组成，1种杂交于主要分支的14聚体和5种杂交于5种染料寡核苷酸的15聚体重复序列，(3) 5种15 nt染料寡核苷酸中的每种在寡核苷酸的5'末端具有一种荧光染料修饰。
双色报告探针的关键设计特征之一为4种不同荧光染料之间的不同子分支和染料寡核苷酸序列。这防止不同荧光染料之间的“颜色交换”或交叉杂交。例如，Alexa 488荧光团或蓝色的每个15聚体染料寡核苷酸对应于仅与蓝色子分支互补的序列。蓝色子分支进一步具有不同的14聚体序列，其仅与主要分支上的蓝色14聚体序列互补，但不与黄色、红色或绿色互补。因此，特定的主要分支将具有特定的双色序列，这指示了其将容纳哪些15加15染料组合。
双色报告探针的另一个重要设计特征为主要分支上的12具体序列必须满足以下要求：(1) R1、R2和R3之间的不同12聚体序列，(2) 每个区域编码8种不同颜色，具有高度特异性，(3) 8种不同颜色之间的高结合效率和均匀性，和(4) 通过竞争性的立足点序列有效去除所有12聚体。
如下所述制备双色报告探针。4种荧光染料(B =蓝色，G =绿色，Y =黄色，R =红色)产生10种可能的双色组合(BB、BG、BR、BY、GG、GR、GY、RR、YR、YY)。10种双色组合中只有8种用于探针的3个条形码区中的每一个，产生24种不同报告探针(8+8+8=24)。
双色报告探针的制备以两个依序杂交步骤发生：(1) 染料寡核苷酸与子分支和然后(2) 染料+子分支与主要分支。通过使100 μM子分支和600 μM染料寡核苷酸在室温下于4.2X SSPE缓冲液中混合30分钟来制备4种单独的染料-子分支反应。然后使用在4.8X SSPE中的2 μM主要分支、7.2 μM子分支+ Dye1和7.2 μM子分支+ Dye2分别制备24种报告探针。将这些反应在45℃下加热5分钟，并且然后在室温下冷却30分钟。然后将24种 Dye +子分支-主要分支反应合并成对应于条形码域的3个不同池(即R1、R2、R3)中。例如，将结合于R1条形码域的8种不同双色报告探针(每种2 μM)合并在一起，稀释10倍至每种报告探针的最终工作浓度为200 nM。
以下报告探针制备为用于质量保证的标准测试。在3个单独流动池测试3个报告探针池中的每一个与其相应条形码域(R1、R2、R3)的结合。对修饰的探针构建体(仅存在条形码域并固定于流动池上)实施测试。代表每种颜色的所有8种12聚体均为多重的，并且预期所有8种双色报告探针均鉴定为具有高颜色计数。
双色报告探针的示意图显示在图20中。这些探针用于靶向捕获核酸的直接探针杂交工作流程中(如图21所示)。图22显示这些探针关于其鉴定感兴趣单倍型的用途的另外能力。
实施例5：3种双色报告探针和图像相减
本实施例证实在结合于表面被固定目标之前，3种报告复合物在溶液中与测序探针的预杂交。溶液杂交显示比表面杂交有效得多，并且可在测序实验之前实施，以显著减少总的样品应答运行时间。通过从测序探针依序切割(经化学或光学方法)报告子并测量荧光强度损失来确定3种报告子的身份。
本公开需要一组4096种条形码分子(BC)中的一种杂交于已固定于流动池表面的目标分子，本文也将其描述为探针，其中条形码域的区域可被包含可检测标记的互补核酸分子或包含可检测标记的报告复合物的互补核酸分子结合，每个可能的六聚体序列一个。条形码的身份以及靶标内相关的六聚体序列需要结合和读出3种双色荧光报告探针(RPTR)，本文也描述为包含可检测标记的互补核酸分子或包含可检测标记的报告复合物的互补核酸分子。RPTR流入流动池以杂交于BC、成像并通过以依序方式保持立足点来去除，每个BC读出需要3个RPTR流动循环。
图23显示在流入流动池之前所有3种RPTR探针杂交于BC。该BC/RPTR复合物可在使用之前纯化，以确保适当形成接近100％的BC/RPTR复合物。BC/RPTR复合物杂交于表面的目标，并拍摄含有来自所有6种颜色(3种双色RPTR)的荧光信号的图像。然后切割报告子中的一个，从复合物去除荧光染料。切割机制在本文得到更详细讨论。然后拍摄仅含有来自4种颜色(2种双色RPTR)的荧光信号的第二张图像。
如图24所示，可通过比较6色和4色图像来获得损失的RPTR身份。接下来，使用不同切割机制去除第二RPTR，并且拍摄含有来自2种颜色(1种双色RPTR)的荧光信号的第三张图像。同样，通过比较2色和4色图像来确定切割的RPTR的身份。剩余的荧光信号识别第三RPTR以明确地识别BC并因此识别目标中存在的六聚体序列。
用于测序循环最先两个读出的可切割RPTR与不可切割版本类似地构建，其由杂交于6种“子分支”寡核苷酸的30种染色寡核苷酸组成(本文也描述为三级核酸分子)，其最终杂交于“主要分支”寡核苷酸(本文也描述为二级核酸分子)，如图25所示。通过用置于结合BC的“主要分支”部分和结合“子分支”和染料的部分之间的几种可切割修饰(比如可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的)中的一种或多种合成“主要分支”寡核苷酸，将这些RPTR制成可切割的。可化学切割修饰的实例包括二硫化物部分。可酶促切割修饰的实例包括含有脱氧尿嘧啶(dU)的部分(使用来自New England Biolabs的'USER'酶混合物可切割)。在一个测序循环内用于两个RPTR的可切割修饰必须不同以使得能够依序切割。
该方法的关键属性和优点为：(1) BC/RPTR复合物可在测序运行之前制备，这允许更好地控制杂交(即溶液杂交而不是表面杂交和长得多的杂交时间)；(2) 该方法有可能显著增加明确鉴定的BC数目，因为(a) BC/RPTR复合物可进行HPLC纯化，以确保每个BC具有所有3种RPTR和(b) 切割效率显著高于RPTR杂交和立足点效率；和(3) 在测序运行时间方面，该方法要快得多，因为(a) 其不需要每个RPTR结合于BC的杂交时间，(b) 用于去除RPTR信号的切割动力学显著快于也是基于杂交的立足保持，和(c) 其需要少得多的试剂流动步骤(8对比14(目前方法)，尽管如果使用UV可切割接头，仅需要6个流动步骤)。其还需要拍摄更少的图像(4对比7个图像，或者如果省略最后的水洗暗像，则为3对比6个图像)。
使用单个BC、可UV切割RPTR、含有脱氧尿嘧啶(dU)的RPTR (使用来自New EnglandBiolabs的'USER'酶混合物可切割)和标准RPTR实施原理实验证明。将这些组分杂交成BC /RPTR复合物，并杂交于固定于流动池上的合成的50聚体BRAF外显子15目标序列。通过首先对完整BC/RPTR复合物成像，随后用USER酶处理以去除含有dU的RPTR并再次成像来确定斑点身份。接下来，使用UV光曝光切割可光切割的RPTR，并如图27所示拍摄第三张图像。处理图像的4个聚类特征以确定其荧光强度，并且简单减法正确地识别3种RPTR身份。
该方法的主要潜在风险为BC/RPTR复合物的大小以及与表面被固定的目标相关的杂交动力学减慢。BC/RPTR复合物相对于单独BC的大小增加确实减慢结合动力学；然而，如图26所示，这可通过更长的温育时间来克服。杂交时间的损失这里可通过其他步骤的效率和速度降低(即消除RPTR杂交、减少成像、减少流动步骤等)来抵消。
我们还测试了是否可使用这种图像相减方法检测半染料RPTR。由于这些染料具有较小的信号，因此它们可能更难以可靠地识别。为了测试这一点，制备了一组具有许多类似颜色RPTR (主要是绿色和黄色)的条形码，其中只有斑点1 RPTR为可切割的，如图28和图29所示。在UV曝光之前和之后拍摄图像以切割斑点1 RPTR。PC-GY和PC-GG两者均为可检测的，并且产生与根据失去的染料数目所预期类似的强度变化(例如切割成__YYGY的GYYYGYRPTR将失去其绿色的50%和其黄色的25%)。一系列染料颜色和类别及相关序列如下表所示。

Claims (47)

1.用于检测样品中至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：
(1) 使所述样品与至少一种能够识别和结合所述至少一种目标分子的第一特定区域的探针接触，其中所述至少一种探针包含：
靶结合域和条形码域
其中所述靶结合域包含至少4个核苷酸，并且能够识别和结合所述目标核酸的所述第一特定区域，并且其中所述靶结合域包含已知的核苷酸序列；
其中所述条形码域包含条形码域，所述条形码域包含第一附着区，其包含被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列；和至少第二附着区，其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合；
其中所述第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子包含第一可检测标记，从而使可检测标记与所述第一附着区缔合；
其中所述至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子包含第二可检测标记，从而使可检测标记与所述至少第二附着区缔合；
其中所述第一附着区的所述序列不同于所述至少第二附着区的所述序列；
(2) 检测与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记和与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记；
(3) 去除所述第一可检测标记；
(4) 检测与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记；
其中与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记和与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记的所述线性或依序顺序识别所述至少一种目标分子的所述特定区域，从而检测所述样品中的所述至少一种目标核酸。
2.权利要求1的方法，其中步骤(4)的检测包括减去来自步骤(4)中与所述至少第二附着区缔合的第二可检测标记的信号，形成来自步骤(2)中检测与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记和与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记的信号。
3.权利要求1的方法，其中所述条形码域包含一种条形码域，所述条形码域包含：第一附着区，其包含被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列；至少第二附着区，其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合；和至少第三附着区，其被至少第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合；
其中所述第一互补核酸分子或第一报告复合物的所述第一互补核酸分子包含第一可检测标记，从而使可检测标记与所述第一附着区缔合；
其中所述第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的所述第二互补核酸分子包含第二可检测标记，从而使可检测标记与所述至少第二附着区缔合；
其中所述第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的所述第三互补核酸分子包含第三可检测标记，从而使可检测标记与所述至少第三附着区缔合；
其中所述至少第三附着区、至少第二附着区和至少第三附着区的所述序列不同；
(2) 检测与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记、与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记；
(3) 去除所述第一可检测标记；
(4) 检测与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记；
(5) 去除所述第二可检测标记；
(6) 检测与所述至少第三附着区缔合的所述第三可检测标记；
其中与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记、与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记的所述线性或依序顺序识别所述至少一种目标分子的所述特定区域，从而检测所述样品中的所述至少一种目标核酸。
4.权利要求3的方法，其中步骤(4)的检测包括减去来自步骤(4)中与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记的信号，形成来自步骤(2)中检测与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记、与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记的信号。
5.权利要求3的方法，其中步骤(6)的检测包括减去来自步骤(6)中与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记的信号，形成来自步骤(4)中检测与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述第三附着区缔合的所述至少第三可检测标记的信号。
6.一种用于检测样品中至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：
(1) 使所述样品与至少一种能够识别和结合所述至少一种目标分子的第一特定区域的探针接触，其中所述至少一种探针包含：
靶结合域和条形码域
其中所述靶结合域包含至少4个核苷酸，并且能够识别和结合所述目标核酸的所述第一特定区域，并且其中所述靶结合域包含已知的核苷酸序列；
其中所述条形码域包含第一附着区，其包含能够被第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子或第一杂交核酸分子结合的核酸序列；和至少第二附着区，其包含能够被至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子或至少第二杂交核酸分子结合的核酸序列；
其中所述第一附着区的所述序列不同于所述至少第二附着区的所述序列；
(2) 使包含第一可检测标记的第一互补核酸分子或包含第一可检测标记的第一报告复合物的第一互补核酸分子结合于所述第一附着区，从而使可检测标记与所述第一附着区缔合；
(3) 检测与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记；
(4) 去除所述第一可检测标记或第一互补核酸分子；
(5) 使包含第二可检测标记的至少第二互补核酸分子或包含第二可检测标记的至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合于所述至少第二附着区，从而使可检测标记与所述至少第二附着区缔合；和
(6) 检测与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记；
其中与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记和与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记的所述线性或依序顺序识别所述至少一种目标分子的所述特定区域，从而检测所述样品中的所述至少一种目标核酸。
7.权利要求6的方法，其中所述条形码域包含至少第三附着区，其包含能够被至少第三互补核酸分子、至少第三报告复合物或至少第三杂交核酸分子结合的核酸序列；
其中所述至少第三附着区的所述序列不同于另一个附着区的所述序列。
8.权利要求6的方法，所述方法进一步包括：
(7) 去除所述第二可检测标记或第二互补核酸分子；
(8) 使包含第三可检测标记的至少第三互补核酸分子或包含第三可检测标记的至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子结合于所述至少第三附着区，从而使可检测标记与所述至少第三附着区缔合；和
(9) 检测与所述至少第三附着区缔合的所述第三可检测标记；
其中与所述第一附着区缔合的所述第一可检测标记、与所述至少第二附着区缔合的所述第二可检测标记和与所述至少第三附着区缔合的所述第三可检测标记的所述线性或依序顺序识别所述至少一种目标分子的所述特定区域，从而检测所述样品中的所述至少一种目标核酸。
9. 权利要求6或8的方法，其中步骤(4)的去除所述第一互补核酸或步骤(7)的去除所述第二互补核酸包括：
(a) 使所述第一附着区与缺少可检测标记的第一杂交核酸分子接触，从而解除所述第一互补核酸分子的结合并使缺少可检测标记的所述第一杂交核酸分子结合于所述第一附着区；或
(b) 足以去除所述第一互补核酸分子的pH、盐浓度和/或温度变化。
10.权利要求7的方法，其中所述条形码域包含至少第四、至少第五、至少第六或至少第七附着区，其包含能够被至少第四互补核酸分子、至少第四报告复合物或至少第四杂交核酸分子结合的核酸序列；
其中所述至少第四附着区的所述序列不同于另一个附着区的所述序列。
11.权利要求10的方法，其中重复以下步骤：
(a) 去除相应的可检测标记或互补核酸分子；
(b) 使包含可检测标记的互补核酸分子或包含可检测标记的报告复合物的互补核酸分子结合于所述相应的附着区，从而使可检测标记与所述相应的附着区缔合；和
(c) 检测与所述附着区缔合的所述相应的可检测标记，
直至所述条形码域中每个附着区已被包含可检测标记的互补核酸分子依序结合，并且已经检测到所述依序结合的互补核酸分子的所述可检测标记，
其中与每个附着区缔合的所述可检测标记的所述线性或依序顺序识别所述至少一种目标分子的所述特定区域，从而检测所述样品中的所述至少一种目标核酸。
12.权利要求6的方法，其中缺少可检测标记的所述第一杂交核酸分子包含至少所述第一互补核酸分子的所述核酸序列。
13.权利要求1或3中任何一项的方法，其中步骤(3)的去除所述第一可检测标记或步骤(5)的去除所述第二可检测标记包括使所述第一互补核酸分子或第一报告复合物的所述第一互补核酸分子与对所述第一互补核酸分子位置的足以释放所述第一可检测标记的力接触。
14.权利要求6或8的方法，其中步骤(4)的去除所述第一可检测标记或步骤(7)的去除所述第二可检测标记包括使所述第一互补核酸分子或至少第一报告复合物的所述第一互补核酸分子与对所述第一互补核酸分子位置的足以释放所述第一可检测标记的力接触。
15.权利要求1-8中任何一项的方法，其中所述第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子、至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子、至少第三互补核酸分子或至少第三报告复合物的至少第三互补核酸分子中的至少一种包含至少一个可切割接头。
16.权利要求15的方法，其中所述至少一个可切割接头独立地选自可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的。
17.权利要求13或14的方法，其中所述力为光。
18.权利要求1-8中任何一项的方法，所述方法进一步包括从所述至少一种目标核酸洗涤所述探针。
19.权利要求18的方法，其中所述洗涤包括足以从所述目标分子去除所述探针的pH、盐浓度和/或温度变化。
20.权利要求19的方法，所述方法进一步包括：
(i) 使所述样品与能够识别和结合所述至少一种目标分子的第二特定区域的至少第二探针接触，其中所述第二特定区域不同于所述至少一种目标分子的所述第一特定区域；
(ii) 使所述样品与能够识别和结合所述至少一种目标分子的所述第一特定区域的所述第一探针的至少第二拷贝接触；或
(iii) 使所述样品与能够识别和结合至少第二目标分子的第一特定区域的至少第三探针接触，其中所述至少第二目标分子不同于所述至少一种目标分子；
其中所述探针包含：
靶结合域和条形码域
其中所述靶结合域包含至少4个核苷酸；和
其中所述条形码域包含一种条形码域，所述条形码域包含第一附着区，其包含被第一互补核酸分子或第一报告复合物的第一互补核酸分子结合的核酸序列；和至少第二附着区，其被至少第二互补核酸分子或至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子结合。
21.权利要求19的方法，所述方法进一步包括：
(i) 使所述样品与能够识别和结合所述至少一种目标分子的第二特定区域的至少第二探针接触，其中所述第二特定区域不同于所述至少一种目标分子的所述第一特定区域；
(ii) 使所述样品与能够识别和结合所述至少一种目标分子的所述第一特定区域的所述第一探针的至少第二拷贝接触；或
(iii) 使所述样品与能够识别和结合至少第二目标分子的第一特定区域的至少第三探针接触，其中所述至少第二目标分子不同于所述至少一种目标分子；
其中所述探针包含：
靶结合域和条形码域
其中所述靶结合域包含至少4个核苷酸；和
其中所述条形码域包含第一附着区，其包含能够被第一互补核酸分子、第一报告复合物的第一互补核酸分子或第一杂交核酸分子结合的核酸序列；和至少第二附着区，其包含能够被至少第二互补核酸分子、至少第二报告复合物的至少第二互补核酸分子或至少第二杂交核酸分子结合的核酸序列。
22.权利要求20的方法，所述方法进一步包括用所述至少第二探针、所述第一探针的所述至少第二拷贝或所述至少第三探针重复权利要求3的步骤(1)-(6)。
23.权利要求21的方法，所述方法进一步包括用所述至少第二探针、所述第一探针的所述至少第二拷贝或所述至少第三探针重复步骤(1)-(9)。
24.权利要求1-8中任何一项的方法，其中所述可检测标记包含多个部分，每个部分能够通过其发射光谱鉴定。
25.权利要求24的方法，其中所述可检测标记包含量子点、荧光部分、比色部分或其组合。
26.权利要求24的方法，其中所述可检测标记包含荧光部分。
27.权利要求24的方法，其中每个部分的所述发射光谱相同或不同。
28.权利要求24的方法，其中至少一个部分的所述发射光谱不同于其他部分。
29.权利要求4或5的方法，其中所述信号为发射光谱。
30.权利要求1或6的方法，其中所述靶结合域中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸或核酸类似物。
31.权利要求30的方法，其中所述至少一个修饰的核苷酸或所述至少一个核酸类似物为锁核酸(LNA)。
32.权利要求1或6的方法，其中所述目标核酸首先在被探针接触之前通过至少使所述目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，所述第一捕获探针包含选择性结合于所述基底的第一亲和结合试剂，其中所述第一捕获探针在所述目标核酸上与所述至少一种探针结合于所述目标核酸的不同位置处结合所述目标核酸。
33.权利要求1或6的方法，其中所述目标核酸在结合于所述探针之后通过至少使所述目标核酸的第一位置与第一捕获探针结合而固定于基底上，所述第一捕获探针包含选择性结合于所述基底的第一结合亲和试剂，其中所述第一捕获探针在所述目标核酸上与所述至少一种探针结合于所述目标核酸的不同位置处结合所述目标核酸。
34.权利要求32的方法，其中所述目标核酸通过施加足以使在第一位置固定于所述基底的所述目标核酸延伸的力来延长。
35.权利要求33的方法，其中所述目标核酸通过施加足以使在第一位置固定于所述基底的所述目标核酸延伸的力来延长。
36.权利要求34的方法，其中所述力为重力、流体动力、电磁力、流动拉伸、后退弯月面技术或其组合。
37.权利要求36的方法，其中所述目标核酸通过使所述目标核酸的至少第二位置与至少第二捕获探针结合而进一步固定于所述基底，所述至少第二捕获探针包含选择性结合于所述基底的第二亲和结合试剂，其中所述第二捕获探针在所述目标核酸上与所述至少一种探针和第一捕获探针结合于所述目标核酸的不同位置处结合所述目标核酸。
38.权利要求1-8中任何一项的方法，其中包含可检测标记的每种报告复合物包含直接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
39.权利要求1-8中任何一项的方法，其中包含可检测标记的每种报告复合物包含经核酸间隔区间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
40.权利要求1-8中任何一项的方法，其中包含可检测标记的每种报告复合物包含经可切割接头间接连接于初级核酸分子的互补核酸分子。
41.权利要求40的方法，其中所述可切割接头独立地选自可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的。
42.权利要求38的方法，其中每个初级核酸分子杂交于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个二级核酸分子。
43.权利要求42的方法，其中所述每个二级核酸分子独立地包含一种可切割接头。
44.权利要求43的方法，其中所述可切割接头独立地选自可光切割的、可化学切割的和可酶促切割的。
45.权利要求42的方法，其中所述一个或多个二级核酸分子包含至少一种可检测标记。
46.权利要求42的方法，其中每个二级核酸分子杂交于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个包含至少一种可检测标记的三级核酸分子。
47.一种包含用于实施权利要求1-8中任何一项的方法的试剂的试剂盒。
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