KR20240013728A - 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭 - Google Patents
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Abstract
신호 증폭을 위해 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 조성물이 본원에 개시된다. 또한, 신호 증폭을 위해 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 키트가 본원에 개시된다. 또한, 신호 증폭을 위해 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 방법이 본원에 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001]
본 출원은 2021년 5월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/192,554의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 진술
[0002]
본 발명은 국립보건원이 부여한 보조금 번호 HD075605 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
[0003]
본 개시는 생물학적 샘플을 프로파일링하기 위해 다중화된 영상화에 적용될 수 있는 앰플리콘의 확장 가능한 신호 증폭을 위한 방법, 조성물, 키트를 제공한다.
배경
[0004]
세포의 전사 프로파일링은 많은 목적에 유용하다. 단일 세포에서 다중 mRNA를 분해하는 현미경 영상화는 전사체 풍부도 및 국소화에 관한 정보를 제공할 수 있으며, 이는 세포 식별의 분자 기반을 이해하고 질병에 대한 치료를 개발하는데 중요하다. 생물학적 샘플의 전사체 프로파일링과 같은 분자 프로파일링은 다양한 목적에 유용하다. 예를 들어, 이는 암과 같은 비정상적인 성장 상태를 검출하고 식별하기 위해 유전자 발현 수준을 평가하는 것을 가능하게 할 수 있다.
[0005]
qPCR 및 마이크로어레이와 같은 기술이 유용했지만, 이들은 단일 분자 감도에 도달하지 못했다. 한편, 차세대 시퀀싱은 정량화에서 편향 및 부정확성을 도입할 수 있는 샘플의 증폭 및 mRNA의 역전사를 포함한다. 또한, 샘플 제조 및 시퀀싱은 시간 소모적이고 비용이 많이 들 수 있다. 영상화가 mRNA 전사체 정량화에 사용되었다는 사실에도 불구하고, 이는 수백 개의 유전자로 제한된다. 수천 개의 유전자 또는 심지어 전체 전사체를 정량화할 수 있다면 많은 과학적 질문에 접근할 수 있다.
[0006]
시간 효율적인 방식으로 높은 정확도로 단일 분자 감도에서 영상화 기반 전사체 프로파일링을 수행하기 위한 더 나은 방법 및 시스템이 필요하다.
개요
[0007]
본 개시는 정확하고 결정론적인 신호 증폭의 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭(LANTERN)을 위한 방법, 조성물, 키트를 제공한다. LANTERN은 생물학적 샘플을 프로파일링하기 위해 다중화된 영상화에 적용될 수 있는 앰플리콘의 확장 가능한 신호 증폭을 가능하게 한다. 본 개시는 조성물 및 키트, 이를 제조하고 사용하는 것 이외에 관련 분야의 문제에 대한 다른 해결책을 제시한다.
[0008]
일부 구체예에서, 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 증폭용 조성물이 제공되고, 여기서 조성물은 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 하나 이상의 일차 프로브를 포함하고, 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브를 포함하고, 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브 상의 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함한다.
[0009]
일부 구체예에서, 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 키트가 제공되고, 여기서 조성물은 다음을 포함하는데, 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브를 포함하고, 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 사차 프로브 상의 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함한다.
[0010]
일부 구체예에서, 라이게이션-증폭 형광 인 시튜(in situ) 하이브리드화를 위한 방법을 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 샘플을 하나 이상의 표적에 결합하는 하나 이상의 일차 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 일차 프로브는 표적에 하이브리드화된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 이차 프로브를 일차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고; 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 삼차 프로브를 적어도 하나의 이차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 선택적으로 포함하고; 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 사차 프로브를 적어도 하나의 삼차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (i)-(iv) 동안 또는 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 검출할 수 있는 판독 프로브를 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위에 하이브리드화시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 단계 (vi) 후에 세포를 영상화하여 핵산에 대한 일차 프로브의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 매번 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 판독 프로브로 접촉 및 영상화 단계를 선택적으로 반복하는 단계를 포함하며, 여기서 하나의 표적에 대한 적어도 하나의 판독 프로브는 검출 가능한 모이어티 내의 동일한 표적에 대한 적어도 하나의 다른 판독 프로브와 상이하여, 샘플 내의 표적은 바코드로 설명되고, 바코드의 차이에 의해 샘플 내의 또 다른 표적과 구별될 수 있다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예는 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합으로 반복된다.
[0011]
일부 구체예에서, 상기 방법은 다중화된 영상화에 적용될 수 있는 효율적이고 확장 가능한 신호 증폭 방법에 사용하기 위한 프로브를 생성하는데 사용된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 RNA 및 DNA 순차적 형광 인 시튜 하이브리드화(seqFISH)에 사용하기 위한 프로브를 생성하는데 사용된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 면역형광 연구에 사용하기 위한 프로브를 생성하는데 사용된다.
[0012]
한 번에 수개의 앰플리콘의 증폭만을 허용하여, 한 샘플로부터 수십 또는 수백 종을 영상화할 때 극도로 시간이 많이 소요되는 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)과 같은 다른 방법과 달리, 일차, 이차, 삼차, 사차, 및 판독 프로브와 관련하여 본원에 개시된 방법은 다른 화학적 변형보다 합성하기에 훨씬 간단하고 비용이 덜 들며, 기존의 효소 프로브 합성 프로토콜과 쉽게 호환된다.
도면의 간단한설명
[0013]
도 1. 좌측: 예로서 2개의 상이한 표적 서열을 나타내는 LANTERN 체계의 개요. 상이한 색상은 각각 별개의 표적을 증폭시키는데 사용된 직교 서열('A' 및 'B'로 표시됨), 및 직교 판독 프로브 결합 부위('C'로 표시됨)를 나타낸다. 일차 프로브를 직접 판독하는 것과 비교하여 2*2*4 = 16배 증폭에 해당하는 한 라운드의 증폭이 도시되어 있다. 우측: 상단: NIH3T3 세포에서 자홍색 및 청록색으로 도시된 상이한 색상의 2개의 프로브 세트를 갖는 Eef2에 대한 광시야 RNA FISH. (A) 통상적인 smFISH, 노출 시간 100 ms. (B) 6 라운드의 LANTERN, 노출 시간 1 ms. 하단: NIH3T3 세포에서 Eef2에 대한 공초점 RNA LANTERN(6 라운드). (C) 제1 하이브리드화 (D) 재하이브리드화 #12, 실시간으로 약 10시간에 해당하며, 반복된 포름아미드 스트리핑 및 재하이브리드화 동안 증폭된 신호의 안정성을 나타낸다. 달리 언급되지 않는 한 모든 이미지는 63x 오일 대물 렌즈로 촬영되었다.
[0014]
도 2. 좌측: 60개 LANTERN 증폭기의 풀링된 테스트에 대한 쌍별 공동국소화 히트맵. 2D 공동국소화는 두 번째 이미지의 국소 최대값 주위의 3-픽셀 박스에서 한 이미지의 국소 최대값에 대한 최대-투영 이미지를 검색함으로써 추정되었다. 인접한 증폭기(예를 들어: 1 및 2, 3 및 4)에 해당하는 비대각 정사각형은 증폭기 쌍이 이 실험을 위해 동일한 유전자에 표적화되었기 때문에 높은 공동국소화를 갖는다. 중앙: 동일한 유전자에서 smFISH(가로 축) 및 LANTERN(세로 축)에 의해 검출된 도트의 수 사이의 상관관계를 보여주는 산점도. 각 유전자에는 2개의 증폭기가 할당되었다. 우측: 동일한 유전자에 대한 제1 증폭기에 의해 검출된 토드의 수(가로 축)와 제2 증폭기에 의해 검출된 도트의 수(수직 축) 사이의 상관관계를 보여주는 산점도.
[0015]
도 3. NIH3T3 세포에서 Eif4g1에 대한 RNA FISH의 광시야 이미지는 동일한 유전자에 대한 2개의 직교 증폭된 서열(A 및 B) 및 통상적인 smFISH(C) 사이의 공동국소화를 나타낸다. 노출 시간 40 ms(A 및 B) 및 400 ms(C). (D)는 한 번에 3개의 채널을 모두 보여준다. DAPI 핵 염색은 회색으로 표시된다.
[0016]
도 4. NIH3T3 세포에서 텔로미어 DNA FISH의 공초점 이미지(청록색). 좌측: 증폭되지 않은 텔로미어 DNA FISH, 500 ms 노출 시간. 우측: LANTERN-증폭된 텔로미어 DNA FISH, 500 ms 노출 시간. 이미지는 동일한 대조도(contrast)로 표시된다. DAPI 핵 염색은 회색으로 표시된다.
[0017]
도 5. LANTERN 증폭 전(A 및 C) 및 후(B 및 D) DNA-컨쥬게이션된 항체로 염색된 NIH3T3 세포의 광시야 이미지. 항-라민 B 및 DNA-컨쥬게이션된 이차 항체로 염색된 A 및 B는 핵막 하층 염색을 나타낸다. 노출 시간 200 ms(A) 및 10 ms(B). 항-TIMM44 및 DNA-컨쥬게이션된 이차 항체로 염색 C 및 D는 미토콘드리아 염색을 나타낸다. 노출 시간 200 ms(C) 및 20 ms(D).
[0018]
도 6. A-C: 인간 유방암 생검 샘플에서 Eef2에 대한 RNA FISH의 공초점 이미지. (A) 클리어링 전, 높은 배경을 나타낸다, 노출 1 s. (B) 클리어링 후, 감소된 배경을 나타낸다, 노출 1 s. (C) 클리어링 및 LANTERN 증폭 후, 더 밝고 선명한 도트를 나타낸다. 노출 100 ms. (D-E) 성체 마우스 뇌 섹션에서 Eef2에 대한 RNA FISH의 공초점 이미지. D: smFISH 신호(청록색), 노출 4 s. (E) 클리어링 및 LANTERN 증폭 후 상이한 뇌 샘플(청록색), 노출 50 ms. (F-G) 전체-마운트 닭 배아에서 Notch1(청록색 및 자홍색) 및 Lfng(녹색) 인트론에 대한 RNA FISH의 공초점 이미지. (F) 이 임계값에서 거의 볼 수 없는 증폭되지 않은 신호, 노출 1 s. (G) LANTERN 후 신호, 노출 1 s. 동일한 유형의 모든 샘플은 동일한 대조 수준으로 표시되며, 핵의 DAPI 염색은 하부 패널에서 회색이다.
[0019]
도 7: 형광 신호를 증폭하고 고도로 공동국소화하는 대표적인 증폭기.
[0020]
도 8: LANTERN은 매우 특이적이다. 대부분의 증폭된 신호는 올바르게 결합된 패드락 프로브에서 발생한다. 이미지는 증폭되지 않은 형광 스폿과 비교하여 LANTERN으로부터의 더 높은 강도의 형광 스폿을 입증하기 위해 동일한 대조도로 표시된다.
[0021]
도 9: LANTERN은 알츠하이머병 인간 뇌 섹션에서 자가형광 및 리포푸신을 극복한다. (A) 유전자 Eef2에 대한 LANTERN 증폭된 형광 스폿은 리포푸신 강도 카운트를 임계값으로 설정한 후에도 유지되며, 이는 증폭된 형광 스폿이 훨씬 더 밝음을 나타낸다. (B) 비-증폭된, 단일 분자 FISH 형광 스폿과 비교하여, 임계값 설정은 리포푸신이 여전히 강하게 남아 있는 동안 전사체 스폿을 제거한다. 이미지는 LANTERN 증폭 후 더 밝은 신호를 나타내기 위해 동일한 대조도로 표시된다.
[0022]
도 10: LANTERN은 관류된, 밤새 파라포름알데히드 고정된 마우스 뇌 조직 섹션에서 형광 신호를 증폭시킨다. 상부 패널의 대조도는 하부 패널과 동일한 대조도를 갖는 중간 패널보다 10x 더 낮다. 이는 동일한 단일 세포의 형광 신호가 6 주기의 LANTERN 후에 증폭됨을 나타낸다.
[0023]
도 11: 고도로 다중화된 seqFISH+ 실험에서 LANTERN의 정량적 평가. (A). 상부 패널: 모든 형광 채널에서 노출 시간 5 s인 LANTERN 전 seqFISH+ 실험에서 '유사색' 하이브리드화 중 하나의 예. 하부 패널: 647 nm 채널에서 200 ms 노출, 561 nm 채널에서 300 ms 노출, 및 488 nm 채널에서 400 ms 노출을 갖는 LANTERN 증폭된 이미지. 동일한 형광 채널의 이미지는 동일한 대조도로 표시된다. (B) 각 형광 채널에서 LANTERN 증폭 배수. 647 nm, 561 nm 및 488 nm 형광 채널은 smFISH에 비해 10 주기의 LANTERN 후에 각각 76.03, 59.49, 및 59.82의 증폭 배수를 나타내었다. (C) 벌크 RNA-seq 측정에 대한 LANTERN을 사용하여 3,000개의 유전자를 프로파일링하는 seqFISH+ 실험의 비교. 45쌍의 고유한 LANTERN 증폭기를 이 실험에 사용하였다. 결과는 RNA-seq 측정에 대한 0.73의 우수한 Pearson 상관 계수를 보여준다.
[0024]
도 12: LANTERN의 대안적인 체계. (A) 한 쌍의 분할 증폭기를 사용하여, 이 경우 패드락 프로브 또는 다른 경우 반전된 패드락 일차 프로브에 하이브리드화될 수 있다. 이후, 효소적 리가제가 분할 증폭기를 라이게이션하는데 사용되며, 부정확하게 결합된 분할 증폭기는 라이게이션되지 않고 고농도 포름아미드 세척에 의해 씻겨나갈 것이다. 다음으로, 분할 삼차 증폭기 쌍을 라이게이션된 이차 증폭기에 하이브리드화한 다음, 효소 라이게이션 및 엄격한 포름아미드 세척을 수행한다. 바람직한 증폭 배수가 달성될 때까지 분할 증폭기 하이브리드화, 효소 라이게이션, 및 엄격한 포름아미드 세척을 반복함으로써 이 주기를 반복한다. 마지막으로, 증폭된 스캐폴드는 형광단 컨쥬게이션된 판독 올리고뉴클레오티드로 검출될 수 있다. (B) 부목(splint) 서열을 통해 라이게이션 효소와 추가로 라이게이션되어, 올바르게 결합된 증폭기를 추가로 안정화시킬 수 있는 추가 서열을 함유하는 분할 증폭기의 선택적 설계. (C) 647 nm 형광 채널에서 분할 증폭기로 검출된 Eef2 전사체의 증폭된 샘플.
상세한 설명
[0025]
하기 설명은 당업자가 개시된 주제를 제조 및 사용하고 이를 적용의 맥락에서 포함시킬 수 있도록 제공된다. 다양한 변형 뿐만 아니라 상이한 적용에서의 다양한 용도는 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 광범위한 구체예에 적용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 제시된 구체예로 제한하고자 하는 것이 아니라, 본원에 개시된 원리 및 신규한 특징과 일치하는 가장 넓은 범위로 제공되어야 한다.
정의
[0026]
달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 분야의 당업자에 의해 통상적인 용례에 따라 이해되어야 한다.
[0027]
본원에서 사용되는 바와 같이, 숫자와 관련된 용어 "대략" 또는 "약"은 일반적으로 달리 언급되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백한 경우를 제외하고 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 숫자의 5%, 10%, 15%, 또는 20%의 범위 내에 속하는 숫자를 포함하는 것으로 간주된다(이러한 숫자가 가능한 값의 0% 미만이거나 100%를 초과하는 경우는 제외됨).
[0028]
본원에서 사용되는 용어 "LANTERN"은 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 지칭하는 두문자어이다.
[0029]
용어 "올리고뉴클레오티드"는 핵염기, 변형된 핵염기, 당, 변형된 당, 포스페이트 브릿지, 또는 변형된 브릿지의 임의의 조합을 함유하는 뉴클레오티드 모노머의 폴리머 또는 올리고머를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 다양한 길이를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 2 내지 약 1000개의 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 다양한 관련 구체예에서, 단일-가닥, 이중-가닥, 및 삼중-가닥의 올리고뉴클레오티드 약 4 내지 약 10개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 길이 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 9 내지 약 39개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 4개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 25개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이의 상보적 가닥의 듀플렉스이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이의 상보적 가닥의 듀플렉스이다.
[0030]
본원에서 사용되는 용어 "프로브" 또는 "프로브들"은 분자 표적(예를 들어, mRNA 샘플, DNA 분자, 단백질 분자, RNA 및 DNA 아이소형 분자, 단일 뉴클레오티드 다형성 분자 등)에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 합성 또는 자연 발생의 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 프로브는 핵산 분자, 올리고뉴클레오티드, 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 서열), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 프로브는 키메라인 프로브의 경우 하나 이상의 핵산 분자와 연결될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 일부 구체예에서, 프로브 자체는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 프로브는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 신호 모이어티(예를 들어, 염료 또는 형광단)와 직접 또는 중간 분자를 통해 간접적으로 연결된다.
[0031]
본원에서 사용되는 용어 "결합 부위"는 다른 분자가 프로브에 결합할 수 있는 프로브의 일부를 지칭한다. 특정 구체예에서, 프로브의 결합 부위는 비공유 상호작용을 통해 또 다른 분자에 결합한다.
[0032]
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 본원에 기재된 바와 같은 관심 공급원으로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 일부 구체예에서, 관심 공급원은 동물 또는 인간과 같은 유기체를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 유체를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 골수; 혈액; 혈액 세포; 복수; 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플; 세포-함유 체액; 자유 부유 핵산; 가래; 타액; 소변; 뇌척수액, 복막액; 흉막액; 대변; 림프; 부인과 유체; 피부 면봉; 질 면봉; 구강 면봉; 비강 면봉; 도관 세척액 또는 기관지폐포 세척액과 같은 세액 또는 세척액; 흡인물; 찰과표본; 골수 검체; 조직 생검 검체; 수술 검체; 대변, 다른 체액, 분비물, 및/또는 배설물; 및/또는 그로부터의 세포 등이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수득된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 수득된 "일차 샘플"이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 일차 생물학적 샘플은 생검(예를 들어, 미세 바늘 흡인물 또는 조직 생검), 수술, 체액(예를 들어, 혈액, 림프, 대변 등)의 수집으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 용어 "샘플"은 일차 샘플을 처리함으로써(예를 들어, 일차 샘플의 하나 이상의 성분을 제거하고/하거나 하나 이상의 제제를 이에 첨가함으로써) 수득되는 제조물을 지칭한다. 예를 들어, 여과는 반투과성 막을 사용한다. 이러한 "처리된 샘플"은, 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나 일차 샘플을 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 분리 및/또는 정제 등과 같은 기술에 적용함으로써 수득된 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "샘플"은 DNA, RNA, 전사체, 또는 염색체와 같은 핵산을 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "샘플"은 세포로부터 추출된 핵산을 지칭한다.
[0033]
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설사 그렇다 하더라도, 완료되고/거나 완료까지 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것이 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및/또는 화학적 현상에 내재된 잠재적인 완전성 부족을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
[0034]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "표지"는 일반적으로 세포에서 분자 표적 내의 특정 표적 부위를 인식하고 이에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 표지는 세포에서 분자 표적에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 분자 표적에 대해 친화성을 갖는 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 분자 표적에 공유적으로 연결될 수 있는 제1 모이어티에 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 분자 표적은 표지와 공유 결합을 형성할 수 있는 제2 모이어티를 포함한다. 특정 구체예에서, 표지는 분자 표적을 포함하거나 이로 구성된 세포의 식별을 제공할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 복수의 세포가 표지화되고, 여기서 복수의 각각의 세포는 다른 표지된 세포에 비해 독특한 표지를 갖는다.
[0035]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "바코드"는 일반적으로 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 표지의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 바코드 서열은 전형적으로 분자 표적을 포함하는 단일 세포를 식별하기에 충분한 길이 및 고유성을 갖는다.
[0036]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "연결된"은 2개의 분자 사이의 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 지칭한다. 특히, 비공유 상호작용의 유형은 하이브리드화이다.
[0037]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "시스-라이게이션된"은 일반적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 상의 올리고뉴클레오티드 5'에서 3'으로의 라이게이션을 지칭한다. 특정 구체예에서, "시스-라이게이션된"은 올리고뉴클레오티드의 말단이 함께 라이게이션된 것을 지칭한다. 특정 구체예에서, "시스-라이게이션된"은 올리고뉴클레오티드의 한 말단이 올리고뉴클레오티드의 다른 말단 앞의 임의의 위치에 있는 뉴클레오티드에 라이게이션된 것을 지칭한다.
[0038]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "트랜스-라이게이션된"은 일반적으로 상이한 올리고뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드 5'에서 3'으로의 라이게이션을 지칭한다. 특정 구체예에서, "트랜스-라이게이션된"은 하나의 올리고뉴클레오티드의 말단이 다른 뉴클레오티드의 말단에 함께 라이게이션된 것을 지칭한다. 특정 구체예에서, "트랜스-라이게이션된"은 올리고뉴클레오티드의 한 말단이 상이한 올리고뉴클레오티드 상의 임의의 뉴클레오티드에 있는 뉴클레오티드에 라이게이션된 것을 지칭한다.
[0039]
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "부목 프로브" 또는 "부목" 또는 "부목 서열"은 상보적인 프로브에 하이브리드화되거나 결합하는 또 다른 프로브에 상보적인 프로브를 지칭하며, 프로브들은 서로 공유적으로 연결되어 있지 않다. 특정 구현예에서, 용어 "부목 프로브"는 문헌[Lohman et al. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acid Research, 2014, vol. 42 No. 3 1831-1844]의 정의 및 기술을 사용하며, 그 전체는 참조로 포함된다.
구체예
[0040]
본원의 개시는 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 조성물에 대한 구체예를 제시한다.
[0041]
본원의 개시는 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 키트에 대한 구체예를 제시한다.
[0042]
본원의 개시는 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 방법에 대한 구체예를 제시한다.
[0043]
본원의 개시는 RNA 및 DNA seqFISH 뿐만 아니라 면역형광법과 같은 다중화된 영상화에 적용될 수 있는 효율적이고 확장 가능한 신호 증폭 방법을 제시한다(도 1, 도 3-5). 일부 구체예에서, 수십 또는 수백 개의 직교 앰플리콘의 증폭이 한 번에 수행될 수 있다.
[0044]
한 번에 수개의 앰플리콘의 증폭만을 허용하여, 한 샘플로부터 수십 또는 수백 종을 영상화할 때 극도로 시간이 많이 소요되는 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)과 같은 다른 방법과 달리, 일차, 이차, 삼차, 사차, 및 판독 프로브는 다른 화학적 변형보다 합성하기에 훨씬 간단하고 비용이 덜 들며 기존의 효소 프로브 합성 프로토콜과 쉽게 호환된다.
[0045]
일부 구체예에서, 복수의 프로브를 포함하는, 연결된-증폭 형광 인 시튜 하이브리드화를 위한 조성물이 제공되고, 여기서 조성물은 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 하나 이상의 일차 프로브를 포함하고, 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브를 포함하고, 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브 상의 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함한다.
[0046]
일부 구체예에서, 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 키트가 제공되고, 여기서 조성물은 다음을 포함하는데, 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브를 포함하고, 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 사차 프로브 상의 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함한다.
[0047]
일부 구체예에서, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 방법이 제공되며, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 방법은 샘플을 하나 이상의 표적에 결합하는 하나 이상의 일차 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 일차 프로브는 표적에 하이브리드화된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 이차 프로브를 일차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고; 여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 삼차 프로브를 적어도 하나의 이차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 선택적으로 포함하고; 여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 사차 프로브를 적어도 하나의 삼차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 선택적으로 포함하고, 여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (i)-(iv) 동안 또는 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 검출할 수 있는 판독 프로브를 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위에 하이브리드화시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 세포를 영상화하여 핵산에 대한 일차 프로브의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 매번 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 판독 프로브로 접촉 및 영상화 단계를 선택적으로 반복하는 단계를 포함하며, 여기서 하나의 표적에 대한 적어도 하나의 판독 프로브는 검출 가능한 모이어티 내의 동일한 표적에 대한 적어도 하나의 다른 판독 프로브와 상이하다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예는 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합으로 반복된다.
샘플
[0048]
일부 구체예에서, 상기 방법은 샘플을 분석하는 단계를 포함하며, 여기서 샘플은 박테리아 세포, 고세균 세포, 진핵 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 샘플은 조직, 세포, 또는 세포로부터의 추출물을 포함한다. 특정 구체예에서, 샘플은 생물막을 포함한다. 특정 구체예에서, 샘플은 환자로부터 수득된 세포를 포함한다.
표적
[0049]
일부 구체예에서, 표적은 전사체, RNA, DNA 유전자좌, 염색체, DNA, 단백질, 지질, 글리칸, 세포 표적, 소기관, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 전사체, RNA, DNA 유전자좌, 염색체, DNA, 단백질, 지질, 글리칸, 세포 표적, 소기관, 및 이들의 임의의 조합은 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된다.
일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브
[0050]
일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 하나의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 2개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 3개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 4개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 5개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 6개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 7개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 8개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 9개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 적어도 10개의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다.
[0051]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차 프로브는 표적 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
[0052]
일부 구체예에서, 서열은 표적 핵산 서열에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적이다. 일부 구체예에서, 서열 상보성은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다.
[0053]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차 프로브는 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0054]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 이차 프로브는 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0055]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 삼차 프로브는 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0056]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 사차 프로브는 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0057]
일부 구체예에서, 이차 프로브는 일차 프로브 상의 이차 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 삼차 프로브는 이차 프로브 상의 이차 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 사차 프로브는 삼차 프로브 상의 삼차 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 프로브 보체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열 상보성을 포함한다.
[0058]
일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-100개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-10개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-20개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-30개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-40개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-50개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-60개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-70개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-80개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 일차, 이차, 삼차, 및 사차 프로브 결합 부위의 길이는 5-90개 뉴클레오티드의 범위이다.
[0059]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 조성물 또는 키트는 2개 이상의 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 일차 프로브를 포함한다.
[0060]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 조성물 또는 키트는 일차 프로브에 결합할 수 있는 2개 이상의 이차 프로브를 포함하고, 여기서 각각의 이차 프로브는 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다.
[0061]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 조성물 또는 키트는 2개 이상의 삼차 프로브를 포함하고, 각각은 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위에 결합할 수 있으며, 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다.
[0062]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 키트는 DNA 리가제를 포함한다.
[0063]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 방법은 샘플을 하나 이상의 표적에 결합하는 2개 이상의 일차 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 2개 이상의 일차 프로브는 표적에 하이브리드화된다.
[0064]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 이차 프로브를 라이게이션된 일차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고, 여기서 이차 프로브는 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다.
[0065]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 삼차 프로브를 적어도 2개의 이차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고; 여기서 각각의 삼차 프로브는 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함한다.
[0066]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 청구항의 방법은 검출 가능한 판독 프로브를 2개 이상의 판독-프로브 결합 부위에 하이브리드화시키는 단계를 포함한다.
[0067]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 매번 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 판독 프로브로 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 하나의 표적에 대한 각각의 새로운 복수의 적어도 하나의 판독 프로브는 동일한 표적에 대한 이전의 복수의 적어도 하나의 판독 프로브와 상이하며, 이들은 적어도 검출 가능한 모이어티가 상이하다.
증폭기 단편
[0068]
일부 구체예에서, 각각의 이차, 각각의 삼차, 및/또는 각각의 사차 프로브는 적어도 2개의 증폭기 단편을 포함한다.
[0069]
일부 구체예에서, 이차, 이차 및 삼차, 이차, 삼차 및 사차, 이차 및 사차, 삼차, 삼차 및 사차, 또는 사차 프로브는 적어도 2개의 증폭기 단편을 포함한다.
[0070]
특정 구체예에서, 이차 프로브 증폭기 단편은 적어도 제1 증폭기 단편을 포함하고, 여기서 제1 증폭기 단편은 일차 프로브에 대한 상보성 영역을 포함하며, 상보성 영역은 일차 프로브에 하이브리드화된다. 특정 구체예에서, 이차 프로브 증폭기 단편은 적어도 제2 증폭기 단편을 포함하고, 여기서 제2 증폭기 단편은 일차 프로브에 대한 상보성 영역을 포함하며, 상보성 영역은 일차 프로브에 하이브리드화된다.
[0071]
일부 구체예에서, 삼차 프로브 증폭기 단편은 적어도 제1 증폭기 단편을 포함하고, 여기서 제1 증폭기 단편은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화된다. 특정 구체예에서, 삼차 프로브 증폭기 단편은 적어도 제2 증폭기 단편을 포함하고, 여기서 제2 증폭기 단편은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화된다.
[0072]
일부 구체예에서, 사차 프로브 증폭기 단편은 적어도 제1 증폭기 단편을 포함하고, 여기서 제1 증폭기 단편은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화된다. 일부 구체예에서, 사차 프로브 증폭기 단편은 제2 단편을 포함하고, 여기서 제2 단편은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 단편에 하이브리드화된다.
[0073]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 조성물, 키트, 또는 방법은 임의의 이차, 삼차, 또는 사차 증폭기 단편의 제1 또는 제2 단편을 라이게이션하는 리가제를 포함한다.
[0074]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 증폭기 단편은 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0075]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 임의의 이전 구체예의 올리고뉴클레오티드 영역을 포함한다.
[0076]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 상보성 영역은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열 상보성을 포함한다.
부목 서열
[0077]
일부 구체예에서, 임의의 구체예의 조성물, 키트, 또는 방법은 부목 서열을 포함한다.
[0078]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 각각의 부목 서열은 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열은 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0079]
일부 구체예에서, 부목 서열은 이차, 삼차, 또는 사차 증폭기 단편의 제1 증폭기 단편, 제2 증폭기 단편, 또는 둘 모두의 증폭기 단편에 하이브리드화된다.
[0080]
특정 구체예에서, 부목 서열은 적어도 2개의 부목 서열 단편을 포함한다.
[0081]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 부목 서열 단편은 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[0082]
일부 구체예에서, 부목 서열 단편은 라이게이션된다.
프로브의 안정화
[0083]
일부 구체예에서, 방법은 일차, 이차, 삼차 프로브, 또는 사차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 일차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 삼차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 사차 프로브를 안정화시키는 단계를 추가로 포함한다.
[0084]
일부 구체예에서, 프로브는 효소 라이게이션, 화학적 라이게이션, 올리고 부목 프로브가 있거나 없는 UV 가교, 부목 프로브의 하이브리드화, 매트릭스를 통한 가교, 및 화학적 가교, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 방법에 의해 안정화된다. 특정 구체예에서, 효소 라이게이션에 사용되는 효소는 T4 리가제, T7 리가제, 퀵 리가제, T3 리가제, 및 앰플리가제로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 화학적 라이게이션은 아민-포스페이트, 디아민, 및 티올 라이게이션을 포함하는 것으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 매트릭스를 통한 가교는 폴리아크릴아미드 또는 아가로스로부터 제조된 하이드로겔을 포함한다. 특정 구체예에서, 안정화를 위한 화학적 가교는 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 및 DSP(디티오비스 숙신이미딜 프로피오네이트)와 같은 가역적 가교제로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 부목 프로브는 잠금 핵산(LNA) 또는 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다.
[0085]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, LNA 또는 PNA, 또는 단백질, 분자 복합체, 또는 작은 화학 분자와 같은 하나 이상의 추가 분자를 통해 시스-라이게이션된다.
[0086]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 직접 또는 중간 분자를 통해 간접적으로 UV 시스-라이게이션된다.
[0087]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 직접적으로 또는 중간 분자를 통해 세포 또는 샘플 매트릭스와 시스-라이게이션된다. 특정 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 또는 가역적 가교제를 포함하는 화학적 가교제를 사용하여 시스-라이게이션된다. 특정 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 천연 조직 매트릭스, 조직 매트릭스, 또는 외인성 매트릭스를 포함하는 매트릭스를 사용하여 시스-라이게이션된다. 특정 구체예에서, 외인성 매트릭스는 하이드로겔을 포함한다.
[0088]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 후속 라운드의 프로브 하이브리드화 전에 안정화된다. 특정 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 스트리핑 단계 전에 안정화된다.
[0089]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 리가제의 사용에 의해 라이게이션된다. 특정 구체예에서, 프로브는 시스 또는 트랜스로 라이게이션된다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 시스-라이게이션된다. 일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 트랜스-라이게이션된다.
[0090]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 아크릴아미드 중합에 의해 시스-라이게이션된다.
[0091]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 클릭 화학에 의해 시스-라이게이션된다.
[0092]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브는 반응성 기에 의해 시스-라이게이션되고, 여기서 반응성 기는 알켄, 알킨, 아지드, 아미드, 아민, 니트론, 포스페이트, 테트라진, 및 테트라졸로부터 선택된 반응성 쌍을 형성한다.
[0093]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 라이게이션되거나 가교된 일차 프로브를 사용한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 시스 또는 트랜스로 라이게이션되거나 가교된 일차 프로브를 포함한다.
[0094]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차, 이차, 또는 삼차 프로브는 라이게이션되거나 가교된다.
[0095]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 일차, 이차, 또는 삼차 프로브는 시스-라이게이션된다.
[0096]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 효소는 DNA 또는 RNA 리가제, 또는 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제, 및/또는 상기 임의의 것의 조합을 포함한다.
[0097]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 키트는 DNA 리가제를 포함한다.
형광단
[0098]
일부 구체예에서, 임의의 구체예의 조성물, 키트, 또는 방법은 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 전술한 구체예 중 어느 하나의 조성물, 키트, 또는 방법은 적어도 2개의 상이한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 특정 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 동일하다.
[0099]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 형광단이다.
[00100]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 플루오레세인, 로다민, 알렉사 플루오르, DyLight 플루오르, ATTO 염료, 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 플루오레세인 및 플루오레세인의 화학적 유도체; 에오신; 카르복시플루오레세인; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC); 플루오레세인 아미다이트(FAM); 에리트로신; 로즈 벵갈; 박테리아 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 분비된 플루오레세인; 메틸렌 블루; 레이저 염료; 로다민 염료(예를 들어, 로다민, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 123, 아우라민 O, 설포로다민 101, 설포로다민 B, 및 텍사스 레드)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00101]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 ATTO 염료; 아크리딘 염료(예를 들어, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우); 알렉사 플루오르; 7-아미노 악티노마이신 D; 8-아닐리노나프탈렌-1-설포네이트; 아우라민-로다민 염색; 벤잔트론; 5,12-비스(페닐에티닐)나프타센; 9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 블랙라이트 페인트; 브레인보우; 칼세인; 카르복시플루오레세인; 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르; 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르; 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 2-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 2-클로로-9,10-디페닐안트라센; 쿠마린; 시아닌 염료(예를 들어, 시아닌, 예를 들어, Cy3 및 Cy5, DiOC6, SYBR 그린 I); DAPI, 다크 켄처, DyLight 플루오르, 플루오-4, 플루오프로브; 플루오론 염료(예를 들어, 칼세인, 카르복시플루오레세인, 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, 에오신, 에오신 B, 에오신 Y, 에리트로신, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 플루오레세인 아미다이트, 인디안 옐로우, 메르브로민); 플루오로-제이드 염색; Fura-2; Fura-2-아세톡시메틸 에스테르; 녹색 형광 단백질, Hoechst 염색, 인디언 옐로우, Indo-1, 루시퍼 옐로우, 루시페린, 메로시아닌, 광학 증백제, 옥사진 염료(예를 들어, 크레실 바이올렛, 나일 블루, 나일 레드); 페릴렌; 페난트리딘 염료(에티디움 브로마이드 및 프로피디움 아이오다이드); 플록신, 피코빌린, 피코에리트린, 피코에리트로빌린, 피라닌, 로다민, 로다민 123, 로다민 6G, RiboGreen, RoGFP, 루브렌, SYBR 그린 I, (E)-스틸벤, (Z)-스틸벤, 설포로다민-101, 설포로다민 B, Synapto-pHluorin, 테트라페닐 부타디엔, 테트라소듐 트리스(바토페난트롤린 디설포네이트)루테늄(II), 텍사스 레드, TSQ, 움벨리페론, 또는 옐로우 형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00102]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 알렉사 플루오르 패밀리의 형광 염료(Molecular Probes, Oregon)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 알렉사 플루오르 염료는 형광 현미경 및 세포 생물학에서 세포 및 조직 표지로 널리 사용된다. 알렉사 플루오르 시리즈의 여기 및 방출 스펙트럼은 가시 스펙트럼을 포괄하고 적외선까지 확장된다. 패밀리의 개별 구성원은 대략 이들의 최대 여기(nm)에 따라 넘버링된다. 특정 알렉사 플루오르 염료는 쿠마린, 로다민, 크산텐(예를 들어, 플루오레세인), 및 시아닌 염료의 설폰화를 통해 합성된다. 일부 구체예에서, 설폰화는 알렉사 플루오르 염료를 음으로 하전되게 하고 친수성으로 만든다. 일부 구체예에서, 알렉사 플루오르 염료는 유사한 여기 및 방출의 일반적인 염료(예를 들어, 플루오레세인, 로다민), 및 어느 정도 더 새로운 시아닌 시리즈보다 더 안정하고, 더 밝으며, pH에 덜 민감하다. 예시적인 알렉사 플루오르 염료는 Alexa-350, Alexa-405, Alexa-430, Alexa-488, Alexa-500, Alexa-514, Alexa-532, Alexa-546, Alexa-555, Alexa-568, Alexa-594, Alexa-610, Alexa-633, Alexa-647, Alexa-660, Alexa-680, Alexa-700, 또는 Alexa-750을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00103]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 DyLight 플루오르 패밀리의 형광 염료(Dyomics and Thermo Fisher Scientific) 중 하나 이상을 포함한다. 예시적인 DyLight 플루오르 패밀리 염료는 DyLight-350, DyLight-405, DyLight-488, DyLight-549, DyLight-594, DyLight-633, DyLight-649, DyLight-680, DyLight-750, 또는 DyLight-800을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00104]
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 나노물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 형광단은 나노입자이다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 양자점이거나 양자점을 포함한다. 일부 구체예에서, 형광단은 양자점이다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 양자점을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 금 나노입자이거나 금 나노입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 금 나노입자이다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 금 나노입자를 포함한다.
판독 프로브
[00105]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 하나 이상의 판독 프로브는 검출 가능한 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 포함한다.
[00106]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 하나 이상의 판독 프로브는 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[00107]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 하나 이상의 판독 프로브는 상이한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[00108]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 하나 이상의 판독 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[00109]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 13개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 14개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 판독 프로브는 30, 50, 100, 200, 250, 500, 750, 또는 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[00110]
일부 구체예에서, 판독 프로브는 일차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브는 이차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브는 삼차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브는 사차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 상보적이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브는 부목 서열 단편에 상보적이다. 일부 구체예에서, 프로브 보체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열 상보성을 포함한다.
[00111]
일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-100개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-10개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-20개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-30개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-40개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-50개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-60개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-70개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-80개 뉴클레오티드의 범위이다. 일부 구체예에서, 판독 프로브 결합 부위의 길이는 5-90개 뉴클레오티드의 범위이다.
[00112]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 조성물 또는 키트는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위 중 적어도 하나에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 2개 이상의 판독 프로브를 포함한다.
[00113]
일부 구체예에서, 임의의 이전 구체예의 조성물 또는 키트는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위 중 적어도 하나에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 2개 이상의 판독 프로브를 포함한다.
샘플 영상화
[00114]
일부 구체예에서, 방법은 프로브 또는 바코드를 영상화하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 표적 프로브 또는 바코드를 영상화하는 단계를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이한 기술이 영상화 단계에 사용될 수 있다.
[00115]
일부 구체예에서, 영상화 방법은 epi-형광 현미경, 공초점 현미경, 상이한 타입의 초-해상도 현미경(PALM/STORM, SSIM/GSD/STED), 및 광 시트 현미경(SPIM 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00116]
일부 구체예에서, 영상화 방법은 I5M 및 4Pi-현미경, 자극 방출 고갈 현미경(STEDM), 기저 상태 고갈 현미경(GSDM), 공간적 구조 조명 현미경(SSIM), 광-활성 국소 현미경(PALM), 가역적 포화 광학 선형 형광 전이(RESOLFT), 전체 내부 반사 형광 현미경(TIRFM), 형광-PALM(FPALM), 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 1-나노미터 정확도의 형광 이미징(FIONA), 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 예시적인 초해상도 기술을 포함한다. 예를 들어: Chi, 2009 "Super-resolution microscopy: breaking the limits," Nature Methods 6(1): 15-18; Blow 2008, "New ways to see a smaller world," Nature 456:825-828; Hell, et al, 2007, "Far-Field Optical Nanoscopy," Science 316: 1153; R. Heintzmann and G. Ficz, 2006, "Breaking the resolution limit in light microscopy," Briefings in Functional Genomics and Proteomics 5(4):289-301; Garini et al., 2005, "From micro to nano: recent advances in high-resolution microscopy," Current Opinion in Biotechnology 16:3-12; and Bewersdorf et al, 2006, "Comparison of I5M and 4Pi-microscopy," 222(2): 105-1 17; and Wells, 2004, "Man the Nanoscopes," JCB 164(3):337-340.
[00117]
일부 구체예에서, 전자 현미경(EM)이 영상화에 사용된다.
[00118]
일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 검출한다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 국소화한다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적의 3차원 공간 정보를 제공한다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 정량화한다. 다수의 접촉 및 영상화 단계를 사용함으로써, 제공된 방법은 놀랍게도 높은 처리량으로 다수의 표적에 대한 공간 및/또는 정량적 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, F개의 검출 가능하게 상이한 타입의 표지를 사용할 때, N번의 접촉 및 영상화 단계 후에 최대 F N 개 표적의 공간 및/또는 정량적 정보가 획득될 수 있다.
[00119]
영상화를 위한 특정 기술은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 2014년 4월 30일에 출원되고 명칭이 MULTIPLEX LABELING OF MOLECULES BY SEQUENTIAL HYBRIDIZATION BARCODING인 국제 PCT 특허 출원 번호 PCT/US2014/036258를 참조하고, 이의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[00120]
일부 구체예에서, 상기 방법은 세포 크기 및 모양, 마커, 면역형광 측정, 또는 이들의 임의의 조합을 분석하는 단계를 포함한다.
프로브 제거
[00121]
일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예의 방법은 각 단계 후에 샘플을 세척하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 샘플은 비특이적 하이브리드화 반응을 제거하는 완충제로 세척된다. 특정 구체예에서, 포름아미드가 세척 단계에서 사용된다. 특정 구체예에서, 세척 완충제는 엄격하다. 특정 구체예에서, 세척 완충제는 10% 포름아미드, 2xSSC, 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함한다.
[00122]
일부 구체예에서, 상기 방법은 1회 이상의 영상화 단계 후에 하나 이상의 프로브를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로브를 제거하는 단계는 복수의 판독 프로브를 프로브를 분해하는 효소와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거하는 단계는 복수의 프로브를 DNase와 접촉시키는 단계, 복수의 프로브를 RNase와 접촉시키는 단계, 광표백, 가닥 치환, 포름아미드 세척, 열 변성, 화학적 변성, 절단, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거하는 단계는 프로브를 제거하기 위한 광표백을 포함한다.
[00123]
일부 구체예에서, 상기 방법은 1회 이상의 영상화 단계 후에 판독 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 판독 프로브를 판독 프로브를 분해하는 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 제거 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 스트리핑 시약, 세척 완충제, 광표백, 화학적 표백, 및 이들의 임의의 조합을 사용하여 판독 프로브를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 표적 판독 프로브를 DNase와 접촉시키는 단계, 복수의 표적 프로브를 RNase와 접촉시키는 단계, 광표백, 가닥 치환, 포름아미드 세척, 열 변성, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 판독 프로브는 광표백에 의해 제거된다.
[00124]
일부 구체예에서, 상기 방법은 샘플을 청소하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 CLARITY에 의해 청소된다. 일부 구체예에서, 샘플은 하이드로겔 포매 후 청소된다.
[00125]
프로브를 제거하기 위한 특정 기술은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 2014년 4월 30일에 출원되고 명칭이 MULTIPLEX LABELING OF MOLECULES BY SEQUENTIAL HYBRIDIZATION BARCODING인 국제 PCT 특허 출원 번호 PCT/US2014/036258를 참조하고, 이의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[00126]
본원에 개시된 본 발명의 구체예를 추가로 예시하기 위해 하기 비제한적인 방법이 제공된다. 당업자는 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 여러 구체예의 실시에서 잘 기능하는 것으로 밝혀진 접근법을 나타내고, 따라서 실시예 대한 방식의 예를 구성하는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구체예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
방법
프로브 설계 및 합성
[00127]
유전자- 또는 항체 바코드-특이적 일차 프로브는 FISH 분야에서 통상적인 바와 같이 관심 RNA 또는 DNA 서열을 표적화하도록 설계된다. 일반적으로, 25-35개의 뉴클레오티드 상보적 영역이 사용된다. RNA FISH의 경우, 이들 중 10-30개의 뉴클레오티드가 각 전사체에 대해 설계된다.
[00128]
직접 판독 프로브 부위 대신에, 일차 프로브는 제1 라운드의 증폭 패드락 프로브(이하 'A' 서열로 지칭됨)에 대한 1-4개 부위 뿐만 아니라 라이게이션을 위한 부목을 하이브리드화하는데 사용될 수 있는 5' 및 3' 공통 서열을 갖는다.
[00129]
5'-인산화된 증폭 프로브의 3개의 풀이 합성된다. 제1 풀(이차 프로브)은 일차 프로브 상의 'A' 서열에 결합하고 'B' 서열의 다중 반복부를 표시한다. 제2 풀(삼차 프로브)은 'B' 서열에 결합하고 'A' 서열의 다중 반복부를 표시한다. 제3 풀(판독 프로브)은 'A' 서열 또는 'B' 서열에 결합하고 형광-컨쥬게이션된 판독 프로브에 대한 결합 부위를 표시한다.
증폭 프로토콜
[00130]
예를 들어, 8% SDS 또는 Triton X-100에 의해 RT에서 30분 동안, 또는 에탄올 또는 메탄올에 의해 -20℃에서 1-24시간 동안 샘플의 선택적인 사전-청소가 수행될 수 있다.
[00131]
일차 프로브 또는 항체는, 예를 들어, 표준 하이브리드화 또는 표준 면역형광 차단 완충제에서 smFISH에 대해 정상으로서 샘플과 함께 인큐베이션된다.
[00132]
일차 프로브가 5'-인산화되는 경우, 이들은 리가제에 의해 라이게이션된다.
[00133]
일차 프로브가 5' 아크리다이트 기를 갖는 경우, 샘플은 폴리아크릴아미드 겔에 포매된다. 중합 후, 샘플의 분해/청소는, 예를 들어, 1% SDS/50 mM Tris HCl/2 mM CaCl2 중 프로테이나제 K로 37℃에서 1-24시간 동안 수행된다.
[00134]
샘플을 반복적으로 하이브리드화시키고, 세척하고, 안정화시키고, 이차 및 삼차 프로브에 연결 및 세척한 다음, 판독 올리고로 판독한다.
[00135]
증폭된 샘플은 선택적으로 후고정될 수 있다. 이 단계는 포름아미드 스트리핑 및 재하이브리드화의 많은 영상화 라운드에 걸쳐 증폭의 안정성을 보장할 수 있다.
영상화
[00136]
이후, 화학적-컨쥬게이션된 형광 판독 프로브를 적합한 완충제, 예를 들어, 10% 에틸렌 카르보네이트, 4xSSC 및 10% 6.5-10 kDa 덱스트란 설페이트에서 RT-37℃로 각각의 판독 어댑터 상의 고유한 10-17개 뉴클레오티드 서열에 직접 또는 짧은 브릿지를 사용하여 5-40분 동안 하이브리드화한 다음 10% 포름아미드, 2xSSC 및 0.1% 트리톤 X-100과 같은 온화한 세척에 이어 DAPI와 같은 핵 염색을 수행한다.
[00137]
영상화는 일반적으로 4xSSC, 25 mM Tris HCl, 글루코스 옥시다제, 카탈라제, 및 Trolox로 구성된 항-표백 완충제 시스템에서, 적절한 필터 세트 및 레이저 조명을 사용하여 정상 smFISH에서와 같이 수행된다. 일반적으로 50-500 mW의 레이저 출력 및 20x 내지 100x의 대물 렌즈가 sCMOS 카메라가 장착된 공초점 또는 광시야 현미경에 사용된다. 중요하게는, 증폭은 회전 디스크 공초점 현미경에서 Z 슬라이스당 노출 시간을 10 ms까지 크게 단축할 수 있어 배경 신호클 크게 감소시킨다. 대안적으로, 광시야 설정은 일반적으로 공초점 영상화를 필요로 하는 조직 샘플에서 smFISH를 영상화하는데 사용될 수 있다.
[00138]
형광 판독 프로브는 5-10개 뉴클레오티드 토홀드를 사용하여 가닥 치환 여부에 관계없이 60% 이하의 포름아미드 세척에 의해 스트리핑된다. 가닥 치환은 더 높은-GC 함량 판독 서열로부터 형광 신호를 완전히 소멸시키는데 도움이 될 수 있다.
실험 1
[00139]
본원에 개시된 방법은 원형 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 라이게이션되거나 폴리아크릴아미드 겔에 가교될 수 있고 이차 프로브 결합 부위를 함유할 수 있는 DNA 일차 프로브 또는 DNA-컨쥬게이션된 항체를 사용하여 인 시튜 또는 시험관내 관심 핵산 또는 단백질을 표적화한다.
[00140]
예로서, 일차 결합 부위(도 1)는 ssDNA 일차 프로브와 하이브리드화되며, 이는 더 높은 친화성을 위해 잠금 핵산(LNA) 또는 다른 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
[00141]
일차 프로브는 DNA 리가제에 의해 공유 원형화를 가능하게 하는 포스페이트, 또는 폴리아크릴아미드 가교로의 자유 라디칼 중합을 가능하게 하는 아크릴아미드에 의해 5' 말단에서 변형된다. 이러한 라이게이션/중합 단계는 후속 라운드의 하이브리드화 및 세척 동안 표적화된 뉴클레오티드에 결합하는 일차 프로브를 안정화시킨다.
[00142]
프로브를 라이게이션하기 위해 효소를 사용하는 것은 클릭 화학을 사용하여 라이게이션할 프로브를 설계하는 것보다 몇 가지 이점이 있다. 효소 라이게이션은 라이게이션을 위해 프로브의 두 말단이 서로 바로 옆에 있어야 하기 때문에 더 큰 특이성을 허용한다. 대조적으로, 클릭 화학은 종종 인접하지 않은 프로브의 말단을 라이게이션시킬 것이다. 효소 라이게이션의 사용은 증폭이 매우 특이적임을 보장한다. 또한, 효소의 사용은 실험을 위한 대량의 올리고뉴클레오티드의 저렴한 생산을 가능하게 한다. 클릭 화학을 이용하는 개별 프로브는 프로브당 대략 1000 미달러에 구입하는 경우가 많다.
[00143]
다음으로, 5'-인산화 변형을 갖는 패드락-스타일 이차 프로브는 일차 프로브 내의 하나 또는 수개의 이차 결합 부위(들)에 하이브리드화되고, 이후 DNA 리가제로 라이게이션된다. 이러한 이차 프로브는 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위를 함유한다. 이차 프로브의 하이브리드화 및 라이게이션 후, 5'-인산화 변형을 갖는 패드락-스타일 삼차 프로브는 이차 프로브 내의 2개 이상의 삼차 결합 부위에 하이브리드화되고, 이후 DNA 리가제로 라이게이션된다. 이러한 삼차 프로브는 2개 이상의 이차 프로브 결합 부위를 함유한다.
[00144]
중요하게는, 상기 단계가 반복될 수 있다. 이차 및 삼차 프로브는 2개 이상의 이차 또는 삼차 프로브 결합 부위를 보유하기 때문에, 단계의 반복은 이차 및 삼차 프로브의 지수적 증폭을 가능하게 한다. 예를 들어, 각각 2개의 프로브 결합 부위를 갖는 이차 및 삼차 프로브 하이브리드화 및 라이게이션의 2회 라운드는 하나의 이차 프로브 결합 부위를 24=16개의 이차 프로브 결합 부위로 증폭시킬 수 있다. 이차 및 삼차 프로브 하이브리드화 및 라이게이션의 추가 단계는 판독 프로브 결합 부위의 수를 이론적으로 수천 배 증가시킬 수 있고; 실제로, 수백 번 달성되었다(도 1 및 도 6E).
[00145]
원하는 수의 반복 후, 다중 판독 프로브 결합 부위를 함유하는 5' 말단 인산화 변형을 갖는 패드락-스타일 프로브를 유사하게 하이브리드화하고 라이게이션한다. 이후, 판독 결합 부위는 형광단에 컨쥬게이션된 17-nt 또는 더 짧은 판독 프로브에 의해 가시화되며, 이는 일차 프로브로부터의 직접 신호와 비교하여 지수적으로 증폭된 신호를 제공한다. 판독 프로브로부터의 형광 신호는 일차 프로브 및 패드락 구조에 영향을 미치지 않고 60% 이하의 포름아미드 용액을 사용하여 스트리핑될 수 있다(도 1).
[00146]
이차, 삼차, 및 판독 프로브 서열의 직교 세트를 제조함으로써, 세포, 조직, 전체-마운트 샘플, 또는 추출된 시험관내 샘플에서 많은 관심 핵산 또는 단백질 종 모두에 대해 신호 증폭을 수행할 수 있다(도 2). 서열은 직교하며 서로 교차-하이브리드화되지 않기 때문에, 많은 표적에 대한 이러한 증폭 과정은 한 번에 모두 함께 달성될 수 있다(도 2). 다중화 증폭은 개별 표적이 하나씩 순차적으로 영상화되는 바코딩되지 않은 seqFISH, 또는 바코딩된 seqFISH로 구현될 수 있으며, 여기서 개별 표적에 할당된 색상 또는 유사색은 바코딩된 하이브리드화의 여러 라운드에서 변경된다. 예를 들어, 20,000개 초과의 유전자는 각각 20개의 유사색을 갖는 4회의 바코딩 라운드에 의해 검출될 수 있다(204=160,000).
[00147]
본 발명자들은 종래의 smFISH를 사용한 LANTERN에 의해 검출된 도트 뿐만 아니라 2개의 상이한 LANTERN 증폭기 사이에서 양호한 일치를 발견하였다(도 2, 중앙 및 우측 및 도 3). RNA FISH에 추가하여, LANTERN은 DNA-컨쥬게이션된 항체로부터의 게놈 DNA FISH 신호(도 4) 및 단백질 신호(도 5)를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 마우스 뇌, 인간 유방암 생검, 및 전체-마운트 닭 배아와 같은 여러 조직 및 세포 유형에서 RNA FISH 신호를 증폭시키기 위해 LANTERN을 적용하였다(도 6). LANTERN은 폴리아크릴아미드 하이드로겔-포매 프로토콜과 호환성이 매우 높으며 샘플의 포매 및 청소 전 또는 후에 수행될 수 있다.
[00148]
이 방법은 기존의 증폭 방법에 비해 다음과 같은 이점이 있다. LANTERN-증폭된 신호는 일차, 이차 및 삼차 프로브가 물리적으로 얽혀 있기 때문에 많은 라운드의 판독 프로브 하이브리드화 및 스트리핑에 걸쳐 안정적으로 시각화될 수 있다(도 1B). 대조적으로, 분지형 DNA 증폭 접근법과 같은 다른 증폭 방법으로부터의 신호는 여러 라운드의 판독 프로브 하이브리드화 및 스트리핑 후에 감소될 수 있다.
[00149]
증폭 수준은 본질적으로 확률적인 회전환 증폭(RCA) 및 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)과 같은 방법과 달리, 프로브에 대한 연속적인 라운드에 대한 라운드 수 및 결합 부위의 수에 의해 결정된다.
[00150]
아마도 dsDNA 나노구조의 강성 특성으로 인해, 증폭된 신호는 여러 라운드에 걸쳐 매우 안정적이다(도 1). 본 발명자들은 이미지 정렬을 통해 불완전한 단계 이동을 보정한 후, 12번의 재하이브리드화에 걸쳐, 즉, 실시간으로 약 10시간에 걸쳐 X 및 Y 방향으로 약 3 nm의 평균 제곱근 정밀도로 가우시안 핏팅을 사용하여 고도로 증폭된 RNA FISH 도트의 중심을 국소화할 수 있음을 발견하였다.
참고 문헌
[00151]
하기 참고 문헌은 그 전체가 포함된다.
Claims (51)
- 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스(exponential radiance)로 테더링된 연결된 증폭을 위한 조성물로서, 상기 조성물이
(i) 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 하나 이상의 일차 프로브(여기서 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(ii) 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브(여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(iii) 선택적으로, 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브(여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(iv) 선택적으로, 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브(여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(v) 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브; 및
(vi) 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함하는, 조성물. - 복수의 프로브를 포함하는, 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 키트로서, 상기 키트가 적어도
(i) 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 하나 이상의 일차 프로브(여기서 각각의 일차 프로브는 하나 이상의 이차 프로브 결합 부위 및 선택적으로 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(ii) 각각이 일차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 이차 프로브(여기서 각각의 이차 프로브는 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(iii) 선택적으로, 각각이 이차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 삼차 프로브(여기서 각각의 삼차 프로브는 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(iv) 선택적으로, 각각이 삼차 프로브에 결합할 수 있는 하나 이상의 사차 프로브(여기서 각각의 사차 프로브는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함함);
(v) 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브 상의 판독 프로브 결합 부위에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 하나 이상의 판독 프로브; 및
(vi) 프로브가 하이브리드화될 때 또는 후에 또는 프로브가 하이브리드화된 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 포함하는, 키트. - 지수 래디언스로 테더링된 연결된 증폭을 위한 방법으로서,
(i) 샘플을 하나 이상의 표적에 결합하는 하나 이상의 일차 프로브와 접촉시키는 단계로서, 각각의 일차 프로브가 표적에 하이브리드화되는 단계;
(ii) 하나 이상의 이차 프로브를 일차 프로브에 하이브리드화시키는 단계로서, 각각의 이차 프로브가 하나 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 단계;
(iii) 선택적으로, 하나 이상의 삼차 프로브를 적어도 하나의 이차 프로브에 하이브리드화시키는 단계로서, 각각의 삼차 프로브가 하나 이상의 사차 프로브 결합 부위 또는 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 단계;
(iv) 선택적으로, 하나 이상의 사차 프로브를 적어도 하나의 삼차 프로브에 하이브리드화시키는 단계로서, 각각의 사차 프로브가 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 단계; 및
(v) 단계 (i)-(iv) 동안 또는 후에 하나 이상의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브를 안정화시키는 단계;
(vi) 검출할 수 있는 판독 프로브를 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위에 하이브리드화시키는 단계;
(vii) 단계 (vi) 후에 세포를 영상화하여 핵산에 대한 일차 프로브의 상호작용을 검출하는 단계; 및
(viii) 선택적으로, 매번 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 판독 프로브로 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 하나의 표적에 대한 적어도 하나의 판독 프로브가 검출 가능한 모이어티 내의 동일한 표적에 대한 적어도 하나의 다른 판독 프로브와 상이하여, 샘플 내의 표적이 바코드로 설명되고, 바코드의 차이에 의해 샘플 내의 또 다른 표적과 구별될 수 있는 단계를 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서, 단계 (i)-(vii) 중 어느 하나가 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합으로 반복되는 방법.
- 제3항에 있어서, 일차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 이차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 삼차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 사차 프로브를 안정화시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 적어도 2개의 증폭기 단편을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이차, 이차 및 삼차, 이차 및 삼차 및 사차, 이차 및 사차, 삼차, 삼차 및 사차, 또는 사차 프로브가 적어도 2개의 증폭기 단편을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 이차 프로브 증폭기 단편이 적어도
(a) 제1 증폭기 단편(여기서 제1 증폭기 단편은 일차 프로브에 대한 상보성 영역을 포함하며, 상보성 영역은 일차 프로브에 하이브리드화됨); 및
(b) 제2 증폭기 단편(여기서 제2 증폭기 단편은 일차 프로브에 대한 상보성 영역을 포함하며, 상보성 영역은 일차 프로브에 하이브리드화됨)을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 삼차 프로브 증폭기 단편이 적어도
(a) 제1 증폭기 단편(여기서 제1 증폭기 단편은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화됨); 및
(b) 제2 증폭기 단편(여기서 제2 증폭기 단편은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 이차 프로브 또는 상기 이차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화됨)을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 사차 프로브 증폭기 단편이 적어도
(a) 제1 증폭기 단편(여기서 제1 증폭기 단편은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 단편에 하이브리드화됨); 및
(b) 제2 단편(여기서 제2 단편은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 삼차 프로브 또는 상기 삼차 프로브의 제1 또는 제2 단편에 하이브리드화됨)을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 리가제가 임의의 이차, 삼차, 또는 사차 증폭기 단편의 제1 또는 제2 단편을 라이게이션하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 부목 서열이 이차, 삼차, 또는 사차 증폭기 단편의 제1 증폭기 단편, 제2 증폭기 단편, 또는 둘 모두의 증폭기 단편에 하이브리드화되고, 부목 서열이 적어도 2개의 부목 서열 단편을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 부목 서열 단편이 라이게이션되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브가 이차, 삼차, 또는 사차 프로브의 제1 또는 제2 증폭기 단편에 하이브리드화되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브가 부목 서열 단편에 하이브리드화되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제3항에 있어서, 안정화가 효소 라이게이션, 화학적 라이게이션, 올리고 부목 프로브가 있거나 없는 UV 가교, 부목 프로브의 하이브리드화, 매트릭스를 통한 가교, 및 화학적 가교, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 전사체, RNA, DNA 유전자좌, 염색체, DNA, 단백질, 지질, 글리칸, 세포 표적, 소기관, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제20항에 있어서, 표적이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열에 컨쥬게이션되는 표적.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 시스-라이게이션에 의해 안정화되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 효소를 사용한 시스-라이게이션에 의해 안정화되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제23항에 있어서, 효소가 DNA 또는 RNA 리가제, 또는 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제, 및/또는 상기 임의의 것의 조합인 효소.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 프로브의 접촉 또는 하이브리드화 동안 시스-라이게이션에 의해 안정화되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 일차 프로브가 표적 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 상보성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 아크릴아미드 가교에 의해 시스-라이게이션되는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 프로브가 프로브 상의 반응성 기에 의해 시스-라이게이션되고, 반응성 기가 알켄, 알킨, 아지드, 아미드, 아민, 니트론, 포스페이트, 테트라진, 및 테트라졸로부터 선택된 반응성 쌍인 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브 중 하나 이상이 검출 가능한 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브가 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 키트 또는 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브가 상이한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 키트 또는 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 프로브가 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 검출 가능한 모이어티를 포함하는 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 동일한 조성물, 키트, 또는 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 키트가 2개 이상의 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 일차 프로브를 추가로 포함하는 조성물 또는 키트.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 키트가 하나 이상의 일차 프로브에 결합할 수 있는 2개 이상의 이차 프로브를 추가로 포함하고, 각각의 이차 프로브가 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 조성물 또는 키트.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 키트가 각각 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위에 결합할 수 있는 2개 이상의 삼차 프로브를 추가로 포함하고, 각각의 삼차 프로브가 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 조성물 또는 키트.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 키트가 하나 이상의 판독 프로브 결합 부위 중 적어도 하나에 결합할 수 있고 검출될 수 있는 2개 이상의 판독 프로브를 추가로 포함하는 조성물 또는 키트.
- 제2항에 있어서, DNA 리가제를 추가로 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 하나 이상의 표적에 결합하는 하나 이상의 일차 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 일차 프로브가 표적에 하이브리드화되는 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 이차 프로브를 일차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고, 여기서 이차 프로브가 2개 이상의 삼차 프로브 결합 부위 또는 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 삼차 프로브를 적어도 2개의 이차 프로브에 하이브리드화시키는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 삼차 프로브가 2개 이상의 판독 프로브 결합 부위를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 판독 프로브를 2개 이상의 판독-프로브 결합 부위에 하이브리드화시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 매번 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 판독 프로브로 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 하나의 표적에 대한 각각의 새로운 복수의 적어도 하나의 판독 프로브가 동일한 표적에 대한 이전의 복수의 적어도 하나의 판독 프로브와 상이하며, 이들은 적어도 검출 가능한 모이어티가 상이한 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 일차 프로브가 라이게이션되거나 가교되는 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 일차, 이차, 또는 삼차 프로브가 시스 또는 트랜스로 라이게이션되거나 가교되는 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 일차, 이차, 또는 삼차 프로브가 시스-라이게이션되는 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 각 단계 후에 세척되는 방법.
- 제49항에 있어서, 샘플이 비특이적 하이브리드화 반응물을 제거하는 완충제로 세척되는 방법.
- 제50항에 있어서, 세척 완충제가 엄격한 것인 방법.
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