CN109709318A - 同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片及试剂盒。所述的化学发光微阵列芯片的反应区内包含一组由检测目标物的捕获抗体固定在芯片载体上组成的矩阵阵列，检测目标物为多种心肌标志物。试剂盒包括化学发光微阵列芯片、标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物、检测目标物标准溶液。利用上述生物芯片或者试剂盒同时检测多种心肌标志物，可弥补现阶段心肌标志物同时定量检测技术的空白，满足在紧急情况下对心肌标志物同时进行快速检测的要求，具有多靶标、成本低、自动化程度高、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。

Description

同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片及试剂盒

技术领域

本发明属于POCT检测技术领域，涉及一种生物芯片，特别涉及一种同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片及试剂盒。

背景技术

心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。其中，急性心肌梗死最常见、最危险。个人行为方式和生活习惯的转变，使中国人发生心血管疾病的风险迅速赶超美国等发达国家。

心血管检验是整个心血管领域中的“瓶颈”学科，因为只有在尽可能短的时间内正确诊断疾病，才能早发现、早治疗，最大程度防止致残、致死后果，改善患者预后和生活质量。近年来，对于心血管生物标志物的研究日益深入，积累了大量临床经验和证据，逐步明确了它们的临床适应症和新的研究领域，推动了他们的临床应用。生物标记物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断。心脏标志物全称为心脏损伤早期标志物，是指心脏损伤后6小时内血中水平升高的标志物，是临床中诊断心肌梗死、心肌缺血、心衰等心脏疾病的重要检测指标，主要包括心肌肌钙蛋白I(cTnⅠ)、肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、D-二聚体(D-Dimer)和N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)等。随着科技不断发展，血液中的心衰标志物检测被逐步应用于临床，给心血管疾病的早期诊断、预后转归提供了方法。

心肌肌钙蛋白I(cTNI)在健康人的血清或血浆中浓度极低，检测不到，患者胸痛发作后4-8小时，坏死的心肌细胞大量释放cTNI进入血液循环***，12-48小时达峰值，严重心梗病人数天后cTNI仍然维持在较高水平，是诊断心肌损伤和心肌梗死的最优标志物。

肌红蛋白(MYO)存在于心肌和骨骼肌中，体积小，心肌细胞坏死时能迅速扩散入血，1-2小时浓度就可升高，是急性心肌梗死的早期指标。心梗病人发病后24小时，MYO浓度可恢复正常，因此MYO可以用于诊断再发心肌梗死。

肌酸激酶同工酶(CK-MB)是WHO推荐的判断心肌梗死三个标准之一。CK-MB是肌酸激酶的三个二聚体同工酶之一，在心肌中比例较高，心肌细胞坏死时进入血液循环，心梗患者发病后3-4小时后浓度升高，18-24小时达峰，72小时内可恢复正常。

D-二聚体(D-Dimer)是检测血液的D-二聚体的含量变化可作为体内高凝状态和纤溶亢进的标志。急性心肌梗死及脑血栓形成时，患者急性发病时血浆D-二聚体水平明显增高，D-二聚体检测不仅可作为观察心肌梗死病情的一项指标，而且也是观察溶栓治疗的一种理想检测方法。

NT-proBNP是BNP激素原***后没有活性的N-末端片段，与BNP相比，半衰期更长，更稳定，其浓度可以反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放，因此更能反映BNP通路的激活。血浆NT-proBNP水平随心衰程度加重而升高。在急性心衰的诊断中，NT-proBNP有着重要意义。

目前，以上标志物已经被医院广泛接受。也有多种单独检测上述指标的试剂盒面市。但是目前采取的主流方法是免疫单指标的测定方法(例如ELISA和化学发光法等)。虽然能够测定上述标志物，但是存在检测速度慢，检测成本高等缺点。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的上述问题，本发明的第一目的是提供一种同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，本发明的第二目的是提供检测试剂盒，利用上述化学发光微阵列芯片或者试剂盒同时检测多种心肌标志物，可弥补现阶段心肌标志物同时定量检测技术的空白，满足在紧急情况下对心肌标志物同时进行快速检测的要求，具有多靶标、成本低、自动化程度高、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。

技术方案：本发明所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，所述的化学发光微阵列芯片的反应区内包含一组由检测目标物的捕获抗体固定在芯片载体上组成的矩阵阵列，检测目标物为多种心肌标志物。

所述的化学发光微阵列芯片的反应区内还包含阳性对照阵列和阴性对照阵列。

所述矩阵的列数为3的倍数。将矩阵设的列数设为3的倍数，从而每个检测目标物捕获抗体可点3个重复点，使测定结果更直观更准确。

所述的多种心肌标记物为心肌肌钙蛋白Ⅰ、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、D-二聚体和N末端脑钠肽前体中的任意一种或几种。本发明所述的心肌标志物不局限于上述所列举的具体的标志物，现有技术中已经存在的心肌标志物都可以采用本发明方法检测其含量。实验证明，本发明对上述五种心肌标记物同时检测可以达到理想的检测效果。

阵列中，阴性对照为牛血清白蛋白，阳性对照为HRP酶标记的羊抗小鼠IgG。

所述化学发光微阵列芯片的芯片载体为多孔板，如72孔板、96孔板、384孔板等。

本发明还提供了所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片的制备方法，包括：将检测目标物的捕获抗体通过生物芯片制备***在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中固定0.5-4h后用封闭液封闭，洗去封闭液后即得。

在点样前，对96孔板需要先经过表面处理，具体的处理方法为：在96孔板每个微孔内加入250μL的多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万，sigma公司)溶液(用PH7.4的PBS进行配置)，其浓度为5-100μg/mL，最佳浓度为20-30μg/mL；在25℃下，将孔板静置6-12h，最佳时间为8小时；然后用去离子水对板进行洗涤，洗涤3次，每次300μL；再用300μL PBS缓冲液洗涤一次。通过上述处理，可以得到更好的抗体偶联效果。

所述检测目标物的捕获抗体为抗cTnⅠ抗体、抗MYO抗体、抗CK-MB抗体、抗D-Dimer抗体和抗NT-proBNP抗体。

点样时，抗cTnⅠ抗体浓度为0.2mg/mL、抗MYO抗体浓度为0.15mg/mL、抗CK-MB抗体浓度为0.2mg/mL、抗D-Dimer抗体浓度为0.1mg/mL、抗NT-proBNP抗体浓度为0.2mg/mL；阴性对照牛血清白蛋白的浓度为0.5mg/mL，阳性对照为HRP酶标记的羊抗小鼠IgG，浓度为0.5mg/mL。

所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。

本发明还提供了所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片在制备检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测试剂盒，包含所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片。

所述的检测试剂盒，还包括标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物、检测目标物标准溶液中的一种或几种。

所述的第二抗体溶液为含有浓度为0.3～0.32μg/mL的标记有HRP酶的抗cTnⅠ第二抗体、浓度为0.4～0.42μg/mL的标记有HRP酶的抗MYO第二抗体、浓度为0.25～0.27μg/mL的标记有HRP酶的抗CK-MB第二抗体、浓度为0.12～0.13μg/mL的标记有HRP酶的抗D-Dimer第二抗体、浓度为0.15～0.16μg/mL的标记有HRP酶的抗NT-proBNP第二抗体的混合溶液；化学发光底物选自过氧化物-鲁米诺混合溶液、过氧化物-异鲁米诺或其衍生物混合溶液、过氧化物-吖啶酯或吖淀酰胺类物质的混合溶液。

有益效果：

本发明化学发光微阵列芯片用于多种如5种心肌标志物的同时快速检测，应用该发明可以有效地提高检测效率、降低检测成本，本发明还进一步提供了检测试剂盒。。由于有效地将多个指标集成在一张芯片中进行检测，只需要一份病人血样就可以实现多个指标的同时快速检测。目前世界上还没有同类产品面市。

本发明的化学发光微阵列芯片或试剂盒的检测原理采用经典的双抗体夹心法。在标准化的多孔板为载体的芯片基质上固定捕获抗体，这些抗体可以捕获被测样本中特异性的靶标物质，被捕获的物质与标记有HRP酶或碱性磷酸酶的第二抗体相结合，形成复合物。加入对标记物敏感的化学发光底物进行化学发光，其光信号通过CCD摄像头采集，通过光信号的强弱可以判断被测样本中特定标志物抗原的浓度。

本发明试剂盒使用了化学发光微阵列芯片技术平台，而国内其他厂家的单项检测方法使用的是普通化学发光手段。与之相比，本产品的优势在于：①由于抗体特异性高、亲和力强，并且受到其他杂质影响较低，因此，对生物样品的要求非常低，可简化样品的前处理过程；②本发明可以在一块芯片上设置分区和多个平行重复点，可有效控制芯片质量，极大地提高了芯片检测结果的可靠性，使其检测结果的可控性和可靠性远远高于普通化学发光试剂盒等其他常规检测方法，便于建立标准化检测平台，可节省大量样本、检测时间和人员设备；③能够快速高通量、平行化定量分析大量的样品；④操作简单，结果正确率高；⑤病人只需采一份血样，且迅速可以给出检测结果。

附图说明

图1为化学发光微阵列芯片上各个捕获抗体阵列及对照阵列示意图；

图2为反应后的化学发光微阵列芯片阵列成像图；

图3为cTnI标准曲线；

图4为MYO标准曲线；

图5为CK-MB标准曲线；

图6为D-Dimer标准曲线；

图7为NT-proBNP标准曲线。

具体实施方式

据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

抗cTnⅠ抗体、抗MYO抗体、抗CK-MB抗体、标记有HRP酶的抗cTnⅠ第二抗体、标记有HRP酶的抗MYO第二抗体、标记有HRP酶的抗CK-MB第二抗体均购买自bbisolution公司。

抗D-Dimer抗体、抗NT-proBNP抗体、标记有HRP酶的抗D-Dimer第二抗体、标记有HRP酶的抗NT-proBNP第二抗体购买自seebio公司。

化学发光底物A和底物B购买自Thermo Scientific公司。HRP酶标记的羊抗小鼠IgG，购买自Abcam公司。

实施例1

一种用于5种心肌标志物的生物芯片(或称化学发光微阵列芯片)及试剂盒，所述生物芯片和试剂盒的制备方法包括如下步骤：

(1)生物芯片的制备：

本实施例的生物芯片的载体为96孔板，材质为聚苯乙烯。载体上的每个孔均可独立形成一个反应区，每个反应区内包含一组由检测目标物(cTnⅠ、MYO、CK-MB、D-Dimer和NT-proBNP)的捕获抗体固定在芯片载体上组成的矩阵阵列，矩阵的列数为3，每个检测目标物抗体可点3个重复点，使测定结果更直观更准确。每个反应区内还包含阳性对照阵列和阴性对照阵列，列数均为3。具体布局如图1所示。

在点样前，对96孔板先进行表面处理，具体的处理方法为：在96孔板每个微孔内加入250μL的多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万，sigma公司)溶液(用PH7.4的PBS进行配置)，浓度为25μg/mL；在25℃下，将孔板静置8h；然后用去离子水对板进行洗涤，洗涤3次，每次300μL；再用300μL PBS缓冲液洗涤一次。

以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物的捕获抗体通过生物芯片制备***在96孔板上点样操作后，于37℃水浴中固定1h后用封闭液(10mg/mL BSA的磷酸盐缓冲液)封闭，洗去封闭液后即得。各个检测目标物的捕获抗体均点3点重复，各个检测目标物的捕获抗体的阵列布局设计参见图1。点样时，各个检测目标物的捕获抗体浓度如下：抗cTnⅠ抗体浓度为0.2mg/mL、抗MYO抗体浓度为0.15mg/mL、抗CK-MB抗体浓度为0.2mg/mL、抗D-Dimer抗体浓度为0.1mg/mL、抗NT-proBNP抗体浓度为0.2mg/mL；阴性对照牛血清白蛋白的浓度为0.5mg/mL，阳性对照为HRP酶标记的羊抗小鼠IgG，浓度为0.5mg/mL。

(2)试剂盒的制备：将步骤(1)中得到的生物芯片与以下组分共同包装成试剂盒。组分包括：①含有浓度为0.3μg/mL的标记有HRP酶的抗cTnⅠ第二抗体、浓度为0.4μg/mL的标记有HRP酶的抗MYO第二抗体、浓度为0.25μg/mL的标记有HRP酶的抗CK-MB第二抗体、浓度为0.12μg/mL的标记有HRP酶的抗D-Dimer第二抗体、浓度为0.15μg/mL的标记有HRP酶的抗NT-proBNP第二抗体的混合溶液；②化学发光底物A(含1％过氧化氢)和底物B(含1％鲁米诺和2％Tris)；③含有不同浓度检测目标物浓度的一组标准品，具体组成如表1所示。

表1标准品溶液组成组分表

实施例2

本发明同时检测血液样本中cTnⅠ、MYO、CK-MB、D-Dimer和NT-proBNP的具体检测步骤：

(1)将实施例1中的试剂盒在室温下平衡30分钟；

(2)在生物芯片上，选择6个反应孔，每个孔内分别加入实施例1中的标准品溶液1-6，加入的体积为50μL；然后在其他孔内加入稀释后的血液样本(全血样本和Ph7.4的PBS缓冲液按体积比1:1混合)，每个孔加入50μL；再向上述所有反应孔内继续加入50μL含有浓度为0.3μg/mL的标记有HRP酶的抗cTnⅠ第二抗体、浓度为0.4μg/mL的标记有HRP酶的抗MYO第二抗体、浓度为0.25μg/mL的标记有HRP酶的抗CK-MB第二抗体、浓度为0.12μg/mL的标记有HRP酶的抗D-Dimer第二抗体、浓度为0.15μg/mL的标记有HRP酶的抗NT-proBNP第二抗体的混合溶液；室温下反应15分钟；然后PBST(10mM K₂HPO₄,150mM NaCl，0.05％Tween-20)洗涤；

(3)每个孔内加入实施例1中所述的化学发光底物A和B的1:1体积混合溶液100μL；

(4)加入后立即用CCD进行图像采集，根据cTnⅠ、MYO、CK-MB、D-Dimer和NT-proBNP相应捕获抗体的阵列点化学发光强度信号及对应浓度，可绘制标准曲线；根据标准曲线及样本中各个检测项目的化学发光信号强度，可以计算出样本中的各个检测目标物的含量。

本实施例中，绘制的标准曲线见附图3～7。检测结果见图2、表2。其中对照参比值由参比试剂盒检测得到，参比试剂盒：cTnI参比试剂盒：罗氏公司；MYO参比试剂盒：罗氏公司；CK-MB参比试剂盒ALSERT公司；D-Dimer参比试剂盒：罗氏公司；NT-proBNP参比试剂盒：罗氏公司。

表2同时检测血液样本中cTnⅠ、MYO、CK-MB、D-Dimer和NT-proBNP的化学发光微阵列芯片检测结果及参比试剂盒检测结果

从表2的结果可看出，与主流使用的商品化的检测试剂盒相比，阳性样本的检测结果数值浮动均在20％以内，本发明的检测准确度较高。使用本试剂盒可以实现高效率，简操作，低成本，用时短等多个优点，非常有助于及时，准确地发现心衰和监控心衰的发展程度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，其特征在于，所述的化学发光微阵列芯片的反应区内包含一组由检测目标物的捕获抗体固定在芯片载体上组成的矩阵阵列，检测目标物为多种心肌标志物。

2.根据权利要求1所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，其特征在于，所述的化学发光微阵列芯片的反应区内还包含阳性对照阵列和阴性对照阵列。

3.根据权利要求1所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，其特征在于，所述矩阵的列数为3的倍数。

4.根据权利要求1所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，其特征在于，所述的多种心肌标记物为心肌肌钙蛋白Ⅰ、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、D-二聚体和N末端脑钠肽前体中的任意一种或几种。

5.根据权利要求1所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片，其特征在于，所述化学发光微阵列芯片的芯片载体为多孔板。

6.根据权利要求1～5任一项所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括：将检测目标物的捕获抗体通过生物芯片制备***在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中固定0.5-4h后用封闭液封闭，洗去封闭液后即得。

7.根据权利要求1～5任一项所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片在制备检测试剂盒中的应用。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述的同时检测多种心肌标志物的化学发光微阵列芯片。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物、检测目标物标准溶液中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体溶液为含有浓度为0.3～0.32μg/mL的标记有HRP酶的抗cTnⅠ第二抗体、浓度为0.4～0.42μg/mL的标记有HRP酶的抗MYO第二抗体、浓度为0.25～0.27μg/mL的标记有HRP酶的抗CK-MB第二抗体、浓度为0.12～0.13μg/mL的标记有HRP酶的抗D-Dimer第二抗体、浓度为0.15～0.16μg/mL的标记有HRP酶的抗NT-proBNP第二抗体的混合溶液；化学发光底物选自过氧化物-鲁米诺混合溶液、过氧化物-异鲁米诺或其衍生物混合溶液、过氧化物-吖啶酯或吖淀酰胺类物质的混合溶液。