CN109706171B

CN109706171B - 水稻高光效基因hpe1及其应用

Info

Publication number: CN109706171B
Application number: CN201910145604.8A
Authority: CN
Inventors: 路铁刚; 张治国; 崔学安; 吴金霞; 孙学辉
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109706171A

Abstract

本发明公开了水稻高光效基因HPE1及其应用。本发明提供了供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物株高和/或调控植物植物光合作用中的应用：1)蛋白HPE1；2)编码蛋白HPE1的DNA分子；3)含有编码蛋白HPE1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；本发明提供的HPE1基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的光合效率。将本发明所提供的HPE1基因导入突变体中，获得转基因水稻，使其光合效率明显高于突变体。说明本发明对培育高光效水稻新材料具有重要的理论及实际意义。

Description

水稻高光效基因HPE1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及作物的光合效率改良范畴，特别涉及水稻高光效基因HPE1及其应用。

背景技术

在我国，粮食安全始终是重要问题之一。由于人口的增加和可耕地面积的不断减少，对于水稻这样重要的粮食作物，培育更加高产的品种始终是首要的育种目标。水稻产量每一次突破，都离不开新的有利资源的发现与利用，20世纪50年代，水稻矮秆资源的发现及矮化育种的成功，实现水稻产量第一次飞跃；20世纪60-70年代，水稻不育胞质的发现及三系成功配套，使我国的水稻产量实现第二次飞跃；20世纪末，超级杂交稻的培育成功使中国杂交稻的产量提高了20％。超级稻的成功培育主要利用了理想株型和杂种优势。在理想株型中，水稻叶片的适度卷曲是其考虑的一个重要因素之一，其作用已在高产和超高产育种中得到充分的体现。如两系超级杂交稻“两优培九”、培矮64S/E32的骨干亲本培矮64S，叶片卷曲度达60％，E32的剑叶卷曲度达39％；三系超级稻协优9308组合的剑叶卷曲度约15％。卷叶性状对叶片光合生理、群体生态效应及经济性状的影响的研究表明，适度卷叶对塑造个体良好的株型、改善生育后期群体质量、提高产量具有重要的作用。培育高光效作物是种植业的主要目标之一。当前，通过基因工程育种获得具有高光效品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是与光合作用相关基因的筛选与功能发现。

利用构建的突变体库获得相关高光效突变体，克隆控制水稻重要农艺性状的功能基因，为水稻的高光效育种及品种改良提供基础，并为水稻分子育种设计提供理论依据。然而，目前对控制水稻叶片性状的分子基础还知之甚少。迄今为止在水稻上控制叶片性状的基因只有OsAGO7(Shi等，2007)和rl9(Yan等，2008)已经被克隆并进行了初步的功能研究。在水稻中过量表达OsAGO7能引起叶片腹向卷曲(Shi等，2007)。Adenot等(2006)在拟南芥中研究发现,TAS3ta-siRNA能通过AGO7蛋白作用来控制叶的极性发育。rl9为KAN基因家族成员，编码GARP转录因子，与玉米的KAN1(ZmKAN1)同源性高(Yan等，2008)，在拟南芥叶的极性发育中KAN1基因家族参与了离轴细胞命运的决定(Kerstetter等，2001)。

发明内容

为了筛选水稻中哪些为光合作用相关基因，本发明一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物株高和/或调控植物植物光合作用中的应用：

1)蛋白HPE1；

2)编码蛋白HPE1的DNA分子；

3)含有编码蛋白HPE1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白HPE1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述应用中，所述调控植物株高为提高植物株高；

或，所述调控植物植物光合作用为提高植物光合作用；

或，所述提高植物光合作用具体为提高植物光合效率。

本发明还提供了如下1)-3)中任一种物质在培育高株高植物或高杆植物中的应用：

或，如下1)-3)中任一种物质在培育高光合作用植物中的应用：

或，如下1)-3)中任一种物质在培育高光合效率植物中的应用：

1)蛋白HPE1；

2)编码蛋白HPE1的DNA分子；

所述蛋白HPE1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明的另一个目的是提供抑制HPE1蛋白活性的物质或抑制HPE1蛋白编码基因表达的物质的用途。

本发明提供了制HPE1蛋白活性的物质或抑制HPE1蛋白编码基因表达的物质在如下a)-c)中任一中的应用；

或，本发明提供了抑制HPE1蛋白活性或抑制HPE1蛋白编码基因表达在如下a)

-c)中任一中的应用；

a)降低植物株高；

b)培育低株高植物；

c)培育低杆植物；

所述蛋白HPE1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述应用中，

所述抑制HPE1蛋白活性的物质或抑制HPE1蛋白编码基因表达的物质为如下a或b：

a)序列3所示的DNA或其编码的RNA；

b)含有a的载体或重组菌或重组病毒。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的实施例中，出发植物为水稻或其突变体。

本发明第3个目的是提供如下方法：

本发明提供了一种培育株高提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育株高提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述出发植物；

或本发明提供了一种培育株高降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的株高低于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育株高降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的株高低于所述出发植物；

或本发明提供了一种培育光合作用提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的株光合作用高于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育光合作用提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合作用高于所述出发植物；

或本发明提供了一种培育光合作用降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合作用低于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育光合作用降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合作用低于所述出发植物；

或本发明提供了一种培育光合效率提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合效率高于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育光合效率提高转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合效率高于所述出发植物；

或本发明提供了一种培育光合效率降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合效率低于所述出发植物；

或，本发明提供了一种培育光合效率降低转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的光合效率低于所述出发植物；

所述蛋白HPE1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述光合作用通过光合效率体现；

所述降低出发植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，或，所述降低出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性为将序列3所示的DNA分子导入出发植物中；

或，所述提高目的植物中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，或，所述提高出发植物中蛋白HPE1的含量和/或活性为将所述蛋白HPE1编码基因导入目的植物中。

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的实施例中，出发植物为水稻或其突变体。

上述中，所述光合效率由CO₂气孔导度和/或单位面积光合作用效率体现。

本发明从构建的水稻T-DNA***突变体库中筛选获得了一个光合效率显著降低的突变体zw235,与野生型相比，突变体zw235不仅光合效率显著降低，而且呼吸速率显著提高，同时突变体的叶绿素含量也显著降低。遗传分析表明，突变体zw235受一对隐性单核基因控制的，利用图位克隆方法分离出了控制该突变性状的基因，命名为HPE1。同时用互补的方法对该基因进行了功能互补研究，恢复突变体的表型。值得关注的是，在野生型日本晴中过表达HPE1基因，显著地提高作物的光合效率，进而提高植株的生物量和产量。

实验证明，本发明提供的HPE1基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的光合效率。将本发明所提供的HPE1基因导入野生型水稻日本晴中，获得转基因水稻，在正常生长状态下，提高转HPE1基因的表达量，使其光合效率明显高于空载体对照植株。说明本发明对培育高光效水稻新材料具有重要的理论及实际意义。

在水稻中没有报道HPE1与光合效率相关的研究报告。本研究在构建的***突变体库中发现一个光合效率相关突变体，株高略低，叶绿素含量降低，突变体光合参数显著降低。基因克隆揭示了该突变性状是HPE1基因控制的。在本研究中，突变体所表现出的性状参与了植株的形态建成，造成叶片的卷曲，而且农艺性状没有多大改变，预示该基因有强大的应用前景。植株的略矮化同时有利于增强茎秆强度和抗倒伏能力。这些功能对于作用品种的改良具有重要的作用，可以用基因工程或遗传工程方法增强作物对不良环境的抗性，如提高作用的抗倒伏能力。在改造植株的株高同时，也可以用该基因调控植株的形态建成，提高植株的光合效率，选育所需要的有利的性状：抗倒伏、半卷曲、光合效率高等农艺性状优良的株型。另外，可利用基因工程方法改变植株的形状，这在园艺观赏植物中有重要的利用价值。

附图说明

图1为突变体zw235和野生型的形态表型比较图；

A为野生型和卷叶突变体zw235植株的抽穗期的大田比较图；B、C为野生型和卷叶突变体zw235剑叶横叶切面的比较图；D为野生型和卷叶突变体zw235剑叶叶片中间部分比较图；E为野生型和卷叶突变体zw235叶片卷曲度比较图；F为野生型和卷叶突变体zw235叶片直立度比较图。

图2为突变体zw235与野生型植株叶绿素含量比较图；

其中，20DAG代表植株萌芽生长20天，60DAG代表植株萌芽生长60天。

图3为基因图位克隆；

注HPE1基因的粗定位和精细定位；粗横线代表染色体，短竖线代表染色体上的分子标记，RM3-13、RM3-14为初定位分子标记的名称，其余标记为精细定位的分子标记。其中图3D为基因结构图，突变体zw235中基因HPE1存在单个碱基突变(G变为T).

图4为互补试验结果。

图5为干扰试验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的部分检测方法：

株高的测定：成熟期，从地表到单株最高穗的顶部(不含芒)的高度。取株系内10个株高的平均值。各节数据也依此类推。节从上向下数。

卷曲度(Leaf rolling index LRI)＝[Lw(展开后叶缘间距)-Ln(在同一位点测量叶片到叶缘的自然距离)]/Lw(展开后叶缘间距)X100％。

光合效率参数测定：在始穗后一周，选择气温高于30度以上的晴天，于每天的上午9：00开始对选定的水稻植株的剑叶进行光合速率测定，测定部位为剑叶叶片的前部l/3处；每个测定数据用时1分钟；每组材料限时1小时内测定完成；同日的13：00开始重复上午的测定；在后一周时间内再重复进行2次测定；光合测定***为单台的美国生产的Li-co 6400便携式光合速率测定仪，使该仪器能自动测定净光合速率、光呼吸速率、胞间CO₂浓度。

叶绿素含量测定：叶绿素含量的测定采用丙酮浸提法。具体如下：剪取相同生长部位的水稻叶片，准确称重后剪成2mm小碎块放于丙酮：乙醇＝1:1的溶液(10ml)中浸泡。待浸泡24小时后，叶片发白，以丙酮和乙醇的混合提取液为空白对照，测定叶绿素提取液的OD₆₆₃nm和OD₆₄₅nm。对照和转基因植株均设3个重复。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度(A₆₆₃和A₆₄₅)与溶液中叶绿素含量可分别用下列方程式表示：

叶绿素含量用以下公式进行计算：

Chlorophyll(mg/L)＝(20.2×A₆₄₅nm+8.02×A₆₆₃nm)×稀释倍数

由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。

实施例1、HPE1回补突变体的表型研究

一、突变体zw235的发现及表型分析

突变体zw235来源于本实验室所构建的T-DNA***突变体库，野生型为日本晴水稻(Oryza sativa L.ssp.Japonica；以下也称为野生型水稻wt)。

与野生型水稻相比，突变体zw235的HPE1基因突变，其他基因不变。

突变体和野生型材料均种植于中国农科院生物所试验田。在成熟期，测定了株高和卷曲度，突变体株高为野生型的3/4(图1.A)，约80厘米，叶片卷曲度为67％(图1,B.C.E)。突变体zw235的叶绿素含量显著降低(图2)，突变体的光合效率也显著降低(表1)。图1D为野生型和卷叶突变体zw235剑叶叶片中间部分比较图；图1F为野生型和卷叶突变体zw235叶片直立度比较图。

表1突变体和野生型材料光合作用结果

二、高光效基因HPE1的定位克隆

由于低光效突变体zw235是粳稻遗传背景材料，与籼稻品种Dular(OryzasativaL.ssp.Indica)组配杂交组合，这样产生的多态性将更加丰富，产生F_l代，F_l代自交产生F₂代分离群体。所有材料种植于中国农科院生物所试验田。

1、水稻基因组DNA的微量提取

采用简易CTAB法提取。具体步骤如下：

1)取约500mg新鲜的水稻嫩叶用液氮速冻后研磨成粉末，迅速转移至1.5mLEppendorf管中；

2)加入700μL 65度预热的CTAB抽提缓冲液(100mM Tris-HCl PH8，20mM EDTA,1.4M NaCl，2.0％CTAB,1％PVP)，65度水浴40min，每隔10min摇动混匀；

3)加入等体积的氯仿异戊醇混合液(20:1)，摇动混匀3min，静置3min；

4)12000rpm离心10min，转移上清于另一洁净的1.5mL离心管中；

5)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混勻，室温静置片刻出现白色絮状沉淀；

6)12000rpm离心6min，弃上清收集沉淀；

7)加入1000μL 75％的乙醇洗涤沉淀；

8)12000rpm，离心5min后，弃上清；

9)超净台上吹干沉淀后加入300μL纯净水溶解。

2、基因的定位及克隆

HPE1目的基因用F₂分离群体定位，植株生长90天后，突变性状表现明显，取突变体植株叶片提取基因组DNA进行基因定位。首先取100个F₂突变体植株进行粗定位，在水稻12个连锁群上大约每隔约20cM选取多态性较好的分子标记，用40个突变体植株进行连锁分析，找到与HPE1连锁的分子标记后，用200个突变体植株进一步验证。验证正确后，上大群体进行染色体步移，进一步精细定位目的基因。定位所用的分子标记如表2所示，共用2800个F₂突变体植株将HPE1定位于23.5kb区段内，在这个小区段内预测共有3个完整的ORF，对3个ORF进行基因结构分析并全部进行测序分析，确定候选基因(图3)。

表2为引物序列

候选基因HPE1的核苷酸序列为序列1，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列2。

三、高光效基因HPE1的互补试验

1、互补转基因植物的制备

1)、水稻总RNA的提取

(1)材料及器具的准备：取野生型水稻幼苗装入加有钢珠的2ml EP管中立即放入液氮中，如果不接着提取RNA，则所取材料应该从液氮中取出放入-80℃冰箱中保存。

(2)0.1％DEPC水的配制(2L)：1mLDEPC/1L无菌ddH₂O(由于DEPC见光分解，故所盛容器需用报纸裹住)，配制时混匀过夜，然后取一部分装在250mL的瓶中灭菌备用。

(3)75％乙醇的配制：75mL无水乙醇/25mL灭菌的0.1％DEPC水。

(4)大中小枪头及1.5mL的EP管和PCR管(多)用0.1％DEPC水处理24h，然后装在玻璃瓶中灭菌(如果是进口枪头和EP管可以直接灭菌后使用)；2mLEP管灭菌。

(5)将装有材料的EP管放置在破碎器上充分破碎。组织样品按50-100mg/ml加入Trizol试剂，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果会不好，充分混匀，室温放置5min。

(6)4℃12000rpm离心5min，弃沉淀。

(7)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min。

(8)4℃12000rpm离心15min。

(9)小心吸取上层水相至另一离心管中。再加200ulTrizol重复2、3、4步骤。

(10)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇轻轻混匀，室温放置5-10min。

(11)4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

(12)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

(13)4℃8000rpm离心5min，尽量弃上清。

(14)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

(15)无菌DEPC水溶解并检测RNA。

2)、RNA反转录

反转录的体系和程序如下：

上述样品

反转录得到cDNA。

3)、互补载体的构建

用引物设计软件DNAMAN设计出引物146cdsF和146cdsR.

引物146cdsF:CCCGGGATGGGAATAGC

146cdsR:TCTAGATCAGCAACCACTG

以上述2得到的cDNA为模板，用引物146cdsF和146cdsR进行PCR扩增(扩增体系和扩增反应同一般普通PCR，只是把rTaq聚合酶换成高保证的KOD酶)，得到PCR产物。

经过测序，该PCR产物具有序列1所示的核苷酸，为基因HPE1。

将上述得到的PCR产物经过用SmaI和XbaI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pCambia23A载体(U平台购买，http://mall.uptbio.com/)连接，得到重组载体pCambia23A-HPE1。

经过测序，该重组载体pCambia23A-HPE1为将序列1所示的核苷酸替换pCambia23A载体的SmaI和XbaI位点得到的载体。

4)、转基因植物的构建和分子鉴定

将上述重组载体pCambia23A-HPE1导入农杆菌AGL1中，得到重组菌AGL1/pCambia23A-HPE1(经过酶切验证，得到阳性重组菌)。

将重组菌AGL1/pCambia23A-HPE1采用水稻遗传转化(wan et al.,Plantmolecular Biology 2009)转入突变体zw235(来自水稻突变体库Wan et al.,2009plantmolecular biology)中，得到T0代转HPE1基因互补水稻(CP)。

提取T0代转HPE1基因互补水稻幼叶的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用Q1引物和Q2引物进行定量PCR扩增。

Q1：TGTTCAACTTCCCGTCGCAG

Q2:TTCGTGGTGCTGGTGGATT

定量PCR在iQ5Muticolor Real-Time PCR DetectionSystem(Bio-Rad)上进行，所用PCR Master Mixture为SYBR Green Mix；每一个样品都独立重复3次，所用内参引物为actinF和actinR；反应所需条件：95℃ 3min；95℃ 20s，56℃ 20s，40cycles；72℃ 30s；72℃ 5min；采用2^-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)计算目的基因表达的相对含量。

ACTINF:TGCTATGTACGTCGCCATCCAG

ACTINR:AATGAGTAACCACGCTCCGC。

结果如图4B所示，可以看出，T0代转HPE1基因互补水稻中的HPE1基因表达量恢复到野生型水稻中的水平。

2、互补转基因植物的表型研究

将T0代转HPE1基因互补水稻(CP)、野生型水稻(WT)和突变体zw235种植大田，开花期观察表型。

结果如图4A所示，wt为野生型日本睛品种，zw235为高光效基因破坏突变体，CP为T0代转HPE1基因互补水稻，可以看出，与野生型水稻相比，zw235突变体的株高降低，而回补实验获得的T0代转HPE1基因互补水稻的株高恢复为野生型水平。

检测T0代转HPE1基因互补水稻(CP)的光合效率(umolm²s^-1)、蒸腾效率(mmolm²s^-1)、胞间CO2浓度(molmol^-1)和CO2气孔导度(molm²s^-1)，结果如表1所示。可以看出，回补实验获得的T0代转HPE1基因互补水稻的光合效率恢复为野生型水平。

因此，可以看出，HPE1基因可以提高植物株高和光合效率，HPE1提高植物光合作用。

实施例2、抑制HPE1基因表达在降低植物光合作用中的应用

一、CAS9敲除载体转HPE1植株的制备

1、CAS9敲除HPE1重组载体的制备

CAS9敲除HPE1重组载体为将序列表中序列3所示的片段替换Cas9-1300载体(购自全式金)的HindIII和SmaI酶切位点间的片段得到的载体。

具体方法如下：

首先以Cas9-1300为模板，分别用引物CAS9-1300-1F/目的基因-CAS9-1R和目的基因-CAS9-2F/CAS9-1300-2R扩增得到含有目标基因HPE1的两段序列，再以CAS9-1300-1F与CAS9-1300-2R为引物，以两段***片段为模板，扩增一段长约400bp的***片段，并胶回收纯化；其次37℃过夜双酶(HindIII/SmaI)切Cas9-1300载体(购自全式金)得到载体骨架；最后利用全式金生物公司的Cloning and Assembly Kit将长约400bp的***片段与Cas9-1300载体骨架重组连接起来。

CAS9-1300-1F:

GGCCAGTGCCAAGCTTGTACGTTGGAAACCACGTG

目的基因-CAS9-1R:

TGCCGCTCGCTTGCTGCTTCTGCCACGGATCATCTGCAC

目的基因-CAS9-2F:

AGCAGCAAGCGAGCGGCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CAS9-1300-2R:

ATTTGAACTTGCAGCCCGGGGCCATTTGTCTGCAGAATTG

2、CAS9敲除转HPE1植株

将上述CAS9敲除HPE1重组载体导入农杆菌AGL1中，得到重组菌AGL1/CAS9-HPE1(经过酶切验证，得到阳性重组菌)。

将重组菌AGL1/CAS9-HPE1采用水稻遗传转化(wan et al.,Plant molecularBiology 2009)转入野生型水稻中，得到T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻。

提取T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻幼叶的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用Q1引物和Q2引物进行定量PCR扩增。

Q1：GCTTGGGTTCGTTAGGTGAGA

Q2:TACTTGGAGTTGCGGAGGAC

ACTINF:TGCTATGTACGTCGCCATCCAG

ACTINR:AATGAGTAACCACGCTCCGC。

结果如图5B所示，可以看出，T0代转HPE1基因RNAi水稻(RNAi)中的HPE1基因表达量低于野生型水稻，表明干扰成功。

采用同样的方法，将空载体pTCK309导入野生型水稻中，得到T0代转pTCK309水稻。

3、CAS9敲除转HPE1植株的表型研究

将T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻、野生型水稻(WT)和突变体zw235种植大田，开花期观察表型。以T0代转CAS9水稻为对照。

结果如图5A所示，wt为野生型日本睛品种，zw235为高光效基因破坏突变体，CAS9为T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻，可以看出，与野生型水稻相比，zw235突变体的株高降低，T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻RNAi的株高也降低，T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻与zw235突变体表型一致。

T0代转pTCK309水稻与野生型水稻表型一致。

将T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻CAS9-1、T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻CAS9-2、T0代转HPE1基因CAS9敲除水稻CAS9-3、野生型水稻(WT)和突变体zw235种植大田，成熟期测定光合数据如表3所示。

表3为成熟期测定光合数据

上述结果表明，降低HPE1基因表达，不仅降低植物株高，还降低了光合效率。

实施例3、提高HPE1基因表达在提高植物光合作用中的应用

1、转基因植物的构建和分子鉴定

将实施例1制备的重组载体pCambia23A-HPE1导入农杆菌AGL1中，得到重组菌AGL1/pCambia23A-HPE1(经过酶切验证，得到阳性重组菌)。

将重组菌AGL1/pCambia23A-HPE1采用水稻遗传转化(wan et al.,Plantmolecular Biology 2009)转入野生型水稻日本晴中，得到T0代转HPE1基因水稻(OV)。

提取T0代转HPE1基因水稻幼叶的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用Q1引物和Q2引物进行定量PCR扩增。

Q1：TGTTCAACTTCCCGTCGCAG

Q2:TTCGTGGTGCTGGTGGATT

定量PCR在iQ5Muticolor Real-Time PCR DetectionSystem(Bio-Rad)上进行，所用PCR Master Mixture为SYBR Green Mix；每一个样品都独立重复3次，所用内参引物为actinF和actinR；反应所需条件：95℃ 3min；95℃ 20s，56℃ 20s，40cycles；72℃ 30s；72℃ 5min；采用2^-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)计算目的基因表达的相对含量。以野生型水稻为对照。

ACTINF:TGCTATGTACGTCGCCATCCAG

ACTINR:AATGAGTAACCACGCTCCGC。

结果如表4所示，T0代转HPE1基因水稻(OV-1、OV-2和OV-3)中HPE1基因相对表达量均高于野生型水稻。

表4为目的基因表达的相对含量

采用同样的方法，将空载体pCambia23A导入野生型水稻中，得到T0代转pCambia23A水稻。

2、过表达转基因植物的表型研究

将T0代转HPE1基因水稻(OV-1、OV-2、OV-3)、野生型水稻(WT)种植大田，成熟期检测光合作用相关参数光合效率(umolm²s^-1)、蒸腾效率(mmolm²s^-1)、胞间CO₂浓度(molmol^-1)和CO₂气孔导度(molm²s^-1)。

结果如下表5所示，HPE1基因可以提高植物株高和光合效率，HPE1提高植物光合作用。T0代转pCambia23A水稻与野生型水稻无显著差异。

表5为测定的光合数据

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 水稻高光效基因HPE1及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2373

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.）

<400> 1

atgggaatag cggcgccacc gtgtcagcca gggcagacca ccacgttcgt cataagccaa 60

cccaccagca gcaagagctc cccggcggcg atcgtcgtcc ggccgccggc cacggcgagt 120

tcttcttcta tgtcccactc ccagggtttc caccagccca gcagcggcgc cgtcttcggc 180

ttctcctccg atggcttcga cggccgcccc ggctccggcc aagaccacca gcagcacgag 240

cagcagcagc agcagcacgt ggcgcagcag agccgccgcg acaagctgag ggtgcaaggc 300

ttcgacccgg cggcggcggc ggcggggcac gggttgctcc ccatcgaggg cgacgagcat 360

ggcgcggagc ccggcgccat gtacgaccac gcggaggcgg cggcggccgg ggcgtcgaac 420

atgctctccg agatgttcaa cttcccgtcg cagccgccga cgggcccctc cgccaccgag 480

ctgctcgcca gccagatgaa cgccaactac cggttcgggt tccggcaggc ggcgggtttg 540

gccggcggcg aaggcggttg gttcggcggc ggcggcgcgg ccggccggac tgggttggtg 600

ctcggtgggg ccagcttggg ttcgttaggt gagacgtcgt cgccgaagca gcaagcgagc 660

ggcatggcgg gcctcgccgc tgacccggcc gcggcgatgc acctgttcct gatgaacccg 720

cagcagcagc agcagcagca gtcacggtcg tcgacgtcgc cgccgccgtc ggacgcgcag 780

tcggcaatcc accagcacca cgaagcgttc caggcgttcg gcggcgccgg tgcagcagcg 840

ttcggcggcg gcgcggcggc cggcgtggtg gaaggccagg ggctctccct ctcgctgtcg 900

ccgtcgctgc agcagctgga gatggcgaag caggcggagg agctgcgcgt ccgcgacggc 960

gtgctctact tcaaccggca acagcagcag cagcaggcgg cggcggcggc ggcgtcggtg 1020

cagcagcagc tcccgatggc attgcacggg caggtcggcg tgctggggca gcagctgcac 1080

ggcggcgggt acggcggccc ggcgggcgtc gccggcgtcc tccgcaactc caagtacacc 1140

cgcgcggcgc aggagctcct cgaggagttc tgcagcgtcg gccgcggcca gatcaagggc 1200

ggcggcggcc gcggctccgc ccccaataac cctaactcca gcaaggccgc cgcctccagc 1260

tccggcgccg cccagtcccc ctcgtcggcg tccaaagaac cccctcaact ctcccccgcc 1320

gaccgcttcg agcaccagcg caagaaggcc aagctcatct ccatgctcga cgaggtggac 1380

aggaggtaca accactactg cgaccagatg cagatggtgg tgaacttctt cgactcggtg 1440

atggggttcg gggcggcgac gccgtacacg gcgctggcgc agaaggccat gtcgaggcac 1500

ttccggtgcc tcaaggacgc gatcgcggcg cagctgaggg ggacgtgcga ggcgctgggg 1560

gagaaggacg ccggcacggg gtcggggctg accaaggggg agacgccgcg gctgcgggcc 1620

atcgaccaga gcctccggca gcagcgcgcc ttccaccaca tggggatcat ggagcaggag 1680

gcgtggcgcc cccagcgcgg cctccccgag cgctccgtca acatcctccg ctcctggctc 1740

ttcgaacact tcctccaccc gtacccgagc gatgcagata agcacctgtt ggcgaggcag 1800

accgggctgt ccaggaacca ggtctcgaat tggttcatca acgcccgtgt ccggctatgg 1860

aagcccatga tcgaggagat gtaccagcaa gaatgcaagg agctcgaggg ctcctccggc 1920

gccggcgacg acccctccgg cgccgacgac acgcactcgc cgacgaccac cgccgccgcg 1980

catcatcagc acaggcacgg ccagctaatg gtagagcacg gcggcgcgtc cagcggcggc 2040

ggcgccgcca tgtcgtcgca caagcacgag cccggcgtcg tcgcggggcc ctcctcgtcg 2100

tcggcggcgg cggtggcgga cgccgccttc gtcggcatcg acccggtgga gctcctcggc 2160

ggcgacggcg cggcggccga cgacctgtac gggcggttcg acccggccgg cgccgtcagg 2220

gtgcggtacg ggccggcggg cgccgccgcc ggcgccgccg cggcggcggc cggcgacgtg 2280

tcgctgacgc tgggcctgca gcacgccggc gccggcaacg ccgggcccga cggcagcggc 2340

cgcttctcct tgcgagacta cagtggttgc tga 2373

<210> 2

<211> 790

<212> PRT

<213>水稻(Oryza sativa L.）

<400> 2

Met Gly Ile Ala Ala Pro Pro Cys Gln Pro Gly Gln Thr Thr Thr Phe

1 5 10 15

Val Ile Ser Gln Pro Thr Ser Ser Lys Ser Ser Pro Ala Ala Ile Val

20 25 30

Val Arg Pro Pro Ala Thr Ala Ser Ser Ser Ser Met Ser His Ser Gln

35 40 45

Gly Phe His Gln Pro Ser Ser Gly Ala Val Phe Gly Phe Ser Ser Asp

50 55 60

Gly Phe Asp Gly Arg Pro Gly Ser Gly Gln Asp His Gln Gln His Glu

65 70 75 80

Gln Gln Gln Gln Gln His Val Ala Gln Gln Ser Arg Arg Asp Lys Leu

85 90 95

Arg Val Gln Gly Phe Asp Pro Ala Ala Ala Ala Ala Gly His Gly Leu

100 105 110

Leu Pro Ile Glu Gly Asp Glu His Gly Ala Glu Pro Gly Ala Met Tyr

115 120 125

Asp His Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ser Asn Met Leu Ser Glu

130 135 140

Met Phe Asn Phe Pro Ser Gln Pro Pro Thr Gly Pro Ser Ala Thr Glu

145 150 155 160

Leu Leu Ala Ser Gln Met Asn Ala Asn Tyr Arg Phe Gly Phe Arg Gln

165 170 175

Ala Ala Gly Leu Ala Gly Gly Glu Gly Gly Trp Phe Gly Gly Gly Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ser

195 200 205

Leu Gly Glu Thr Ser Ser Pro Lys Gln Gln Ala Ser Gly Met Ala Gly

210 215 220

Leu Ala Ala Asp Pro Ala Ala Ala Met His Leu Phe Leu Met Asn Pro

225 230 235 240

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Arg Ser Ser Thr Ser Pro Pro Pro

245 250 255

Ser Asp Ala Gln Ser Ala Ile His Gln His His Glu Ala Phe Gln Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Phe Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly

275 280 285

Val Val Glu Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Ser Leu Gln

290 295 300

Gln Leu Glu Met Ala Lys Gln Ala Glu Glu Leu Arg Val Arg Asp Gly

305 310 315 320

Val Leu Tyr Phe Asn Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Ala Ala Ala

325 330 335

Ala Ala Ser Val Gln Gln Gln Leu Pro Met Ala Leu His Gly Gln Val

340 345 350

Gly Val Leu Gly Gln Gln Leu His Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Pro Ala

355 360 365

Gly Val Ala Gly Val Leu Arg Asn Ser Lys Tyr Thr Arg Ala Ala Gln

370 375 380

Glu Leu Leu Glu Glu Phe Cys Ser Val Gly Arg Gly Gln Ile Lys Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Arg Gly Ser Ala Pro Asn Asn Pro Asn Ser Ser Lys Ala

405 410 415

Ala Ala Ser Ser Ser Gly Ala Ala Gln Ser Pro Ser Ser Ala Ser Lys

420 425 430

Glu Pro Pro Gln Leu Ser Pro Ala Asp Arg Phe Glu His Gln Arg Lys

435 440 445

Lys Ala Lys Leu Ile Ser Met Leu Asp Glu Val Asp Arg Arg Tyr Asn

450 455 460

His Tyr Cys Asp Gln Met Gln Met Val Val Asn Phe Phe Asp Ser Val

465 470 475 480

Met Gly Phe Gly Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Gln Lys Ala

485 490 495

Met Ser Arg His Phe Arg Cys Leu Lys Asp Ala Ile Ala Ala Gln Leu

500 505 510

Arg Gly Thr Cys Glu Ala Leu Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Gly Ser

515 520 525

Gly Leu Thr Lys Gly Glu Thr Pro Arg Leu Arg Ala Ile Asp Gln Ser

530 535 540

Leu Arg Gln Gln Arg Ala Phe His His Met Gly Ile Met Glu Gln Glu

545 550 555 560

Ala Trp Arg Pro Gln Arg Gly Leu Pro Glu Arg Ser Val Asn Ile Leu

565 570 575

Arg Ser Trp Leu Phe Glu His Phe Leu His Pro Tyr Pro Ser Asp Ala

580 585 590

Asp Lys His Leu Leu Ala Arg Gln Thr Gly Leu Ser Arg Asn Gln Val

595 600 605

Ser Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Val Arg Leu Trp Lys Pro Met Ile

610 615 620

Glu Glu Met Tyr Gln Gln Glu Cys Lys Glu Leu Glu Gly Ser Ser Gly

625 630 635 640

Ala Gly Asp Asp Pro Ser Gly Ala Asp Asp Thr His Ser Pro Thr Thr

645 650 655

Thr Ala Ala Ala His His Gln His Arg His Gly Gln Leu Met Val Glu

660 665 670

His Gly Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Met Ser Ser His Lys

675 680 685

His Glu Pro Gly Val Val Ala Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala

690 695 700

Val Ala Asp Ala Ala Phe Val Gly Ile Asp Pro Val Glu Leu Leu Gly

705 710 715 720

Gly Asp Gly Ala Ala Ala Asp Asp Leu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Ala

725 730 735

Gly Ala Val Arg Val Arg Tyr Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala

740 745 750

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Ser Leu Thr Leu Gly Leu Gln His

755 760 765

Ala Gly Ala Gly Asn Ala Gly Pro Asp Gly Ser Gly Arg Phe Ser Leu

770 775 780

Arg Asp Tyr Ser Gly Cys

785 790

<210> 3

<211> 559

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg 60

cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 120

gccaagcttg tacgttggaa accacgtgat gtgaagaagt aagataaact gtaggagaaa 180

agcatttcgt ggtgggccat gaagcctttc aggacatgta ttgcagtatg ggccggccca 240

ttacgcaatt ggacgacaac aaagactagt attagtacca cctcggctat ccacatagat 300

caaagctgat ttaaaagagt tgtgcagatg atccgtggcg ggtcttcgag aagacctgtt 360

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 420

accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 480

gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcccc gggctgcaag ttcaaatctt 540

gcattagcgc aagaaacga 559

Claims

1.如下1) -3) 中任一种物质在提高水稻光合作用中的应用：

1) 蛋白HPE1；

2) 编码蛋白HPE1的DNA分子；

3) 含有编码蛋白HPE1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白HPE1为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述DNA分子是编码区为序列表中序列1所示的DNA分子。

3.如下1) -3) 中任一种物质在培育高光合作用水稻中的应用：

或，如下1) -3) 中任一种物质在培育高光合效率水稻中的应用：

1) 蛋白HPE1；

2) 编码蛋白HPE1的DNA分子；

4.一种培育光合作用提高转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因水稻，所述转基因水稻的株光合作用高于所述出发水稻；

或，一种培育光合作用提高转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因水稻，所述转基因水稻的光合作用高于所述出发水稻；

或一种培育光合效率提高转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因水稻，所述转基因水稻的光合效率高于所述出发水稻；

或，一种培育光合效率提高转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中蛋白HPE1的含量和/或活性，得到转基因水稻，所述转基因水稻的光合效率高于所述出发水稻；

所述蛋白HPE1为序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述提高目的水稻中编码蛋白HPE1的DNA分子的表达量和/或活性，或，所述提高出发水稻中蛋白HPE1的含量和/或活性为将所述蛋白HPE1编码基因导入目的水稻中。