CN109701029B - 蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体，属于生物医学纳米材料技术领域，该纳米晶体自组装聚集体是以蛋白质为载体材料，将油溶性纳米粒子包封在载体材料中形成纳米晶体自组装聚集体。本发明还公开了其制备方法，以蛋白质和油溶性纳米晶体之间的疏水性相互作用为主要反应机理，以蛋白质为载体，将油溶性纳米晶体包裹在蛋白质自组装成的纳米球状结构中。该制备方法操作简单、易于扩大化生产，所制得的自组装聚集体具有纳米晶体装载密度高、纳米晶体利用率高(超过90％)、自组装聚集体的粒径可以在大范围内调控、易于进行表面修饰、具有较好的胶体稳定性、高生物相容性和低生物毒性等优点；同时，利用该法可以非常方便的制备多功能纳米材料。

Description

蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学纳米材料技术领域，具体涉及蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体及其制备方法。

背景技术

在过去的二十年中，人们研发出多种纳米晶体如超顺磁性氧化铁纳米粒子、量子点、金纳米颗粒、碳纳米管等。这些纳米晶体具有荧光、超顺磁性或等离子体效应等功能，这使它们被广泛地应用于生物医学领域。将纳米晶体组装成更大的胶体颗粒有助于改善纳米晶体的性质，例如改善其在水中的溶解性和稳定性、提供比单个纳米晶体更强的信号等。更重要的是，通过组装两种或多种具有不同性质的纳米晶体，可以构建多功能纳米粒子。而且，大量的研究结果表明，100-300纳米的纳米颗粒，更适合应用于药物递送和肿瘤成像***。

为了实现纳米晶体的组装，研究人员开发了多种支架材料，包括胶束、硅介孔纳米材料等，来构建纳米晶体自组装聚集体以满足生物***的需求。然而，与天然材料如蛋白质、核酸相比，这些人工合成的材料具有毒性高、生物相容性差等缺点，这使得用人工合成的材料为支架材料构建的纳米晶体自组装体系不能被真正转化为药物或诊断试剂。而且，在大多数情况下，这些纳米晶体自组装体系还存在纳米晶体负载效率较低，自组装聚集体内晶体含量低等缺点。

近年来，蛋白质作为无毒、具有良好的生物相容性的天然材料，已经在一些研究中被设计成纳米球状结构用于递送疏水性小分子药物。研究人员将药物加载到蛋白质纳米球状结构中，以增强药物靶向并降低化疗药物对正常组织的毒性。而以蛋白质作为载体最成功的例子就是白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)，它已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于多种癌症的治疗。

在一些研究中，蛋白质作为某些亲水性纳米粒的支架材料被用于肿瘤的治疗，这些研究中的纳米晶体自组装聚集体都存在纳米晶体的负载密度低、产品结构控制差、大小形状均匀度差等缺点，影响了复合纳米材料的制备。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体，利用具有疏水结构域的蛋白质和油溶性纳米晶体之间的疏水相互作用成功构建纳米晶体负载效率高、载体内的纳米晶体密度大、粒径连续可控、生物相容性好的纳米晶体自组装体系；本发明的另一目的在于提供其制备方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体，该纳米晶体自组装聚集体是以蛋白质为载体材料，将油溶性纳米粒子包封在载体材料中形成纳米晶体自组装聚集体。该自组装聚集体由蛋白质与油溶性纳米晶体自组装形成。组装的驱动力为疏水性作用，蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的水合动力学粒径在20-500nm范围内连续可调。

进一步的，所述的蛋白质选自牛血清白蛋白、鸡蛋白溶菌酶、牛乳白蛋白等具有疏水性结构域的蛋白质。

进一步的，所述的油溶性纳米粒子为量子点、超顺磁性氧化铁纳米粒子、银纳米晶体、金纳米晶体中的一种或几种的组合。

所述的蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的制备方法，将所述的油溶性纳米粒子(一种或几种)同时溶于有机溶剂，并与蛋白质溶液混合，即得同时具有多种纳米晶体特性的多功能纳米晶体自组装聚集体。所述的蛋白质介导的油溶性纳米晶体自组装聚集体，其合成方法在于将蛋白质溶液与油溶性纳米晶体混合。

进一步的，所述的蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的制备方法，包括如下步骤：

1)将蛋白质溶液溶解在蛋白质缓冲液中，配置成蛋白溶液；蛋白质缓冲液为水或者磷酸盐缓冲液；

2)将一种或几种油溶性纳米粒子溶解在有机溶剂中，配置成纳米晶体溶液；

3)将纳米晶体溶液与蛋白质溶液混合，震荡摇匀；

4)将上述混合液在室温下孵育，得到孵育后的混合液；

5)将上述孵育后的混合液离心，去除上清液，沉淀即为蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体。

进一步的，所述的蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/mL，所述的纳米晶体溶液的浓度为0.05-20mg/mL，纳米晶体的浓度越高，所得纳米晶体自组装聚集体的粒径越大。

进一步的，步骤4)中，所述的孵育的时间为三小时以上。

发明原理：小尺寸的纳米晶体与蛋白质接触时诱导蛋白质发生结构变化使蛋白质暴露出疏水结构域，蛋白质中的疏水结构域与油溶性纳米晶体的疏水表面通过疏水作用力相互连接，进而自组装成蛋白质-纳米晶体自组装聚集体。

有益效果：与现有技术相比，本发明的蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体，具有较高的晶体密度，每个纳米晶体聚集体中装载超过五十个纳米晶体，易于合成多功能纳米粒子；具有较高的纳米晶体封装效率，超过90％的纳米晶体被包封在BSA自组装颗粒中；该自组装聚集体具有良好的生物相容性和低生物毒性，易于表面修饰，纳米晶体自组装聚集体的表面为蛋白质，暴露着大量氨基和羧基，易于与抗体、多肽等功能分子偶联；该自组装聚集体粒径均匀，且具有较好的胶体稳定性，能够长时间保存。

本发明的蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体制备方法，操作简单、易于扩大化生产，同时，利用该法可以非常方便的制备多功能纳米材料，纳米晶体聚集体的水合动力学粒径可以在20nm-500nm之间调控。因此，这种蛋白质介导的油溶性纳米晶体自组装聚集体能够广泛地被应用到成像、检测、治疗等生物医学领域。

附图说明

图1为实施例1中的牛血清白蛋白介导的超顺磁性氧化铁纳米粒子自组装聚集体(SPIONs@BSA)的透射电子显微镜照片(Transmission Electron Microscope，TEM)；

图2为实施例1中通过控制晶体浓度控制牛血清白蛋白介导的超顺磁性氧化铁纳米粒子自组装聚集体(SPIONs@BSA)粒径的曲线图；

图3为实施例2中的牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)的透射电子显微镜照片(Transmission Electron Microscope，TEM)；

图4为实施例2中的牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)的水合动力学粒径分布曲线；

图5为实施例2中牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)的水合动力学粒径随时间变化的曲线；

图6为实施例3中的牛血清白蛋白介导的多功能纳米晶体自组装聚集体(SPIONs&QDs@BSA)的荧光和磁铁吸引照片；

图7为实施例4中牛血清白蛋白介导的多功能纳米晶体自组装聚集体(gQDs&rQDs@BSA)内不同晶体的比例控制分析结果；

图8为实施例5中的鸡蛋白溶菌酶介导的量子点自组装聚集体(QDs@CEWL)的透射电子显微镜照片(Transmission Electron Microscope，TEM)；

图9为实施例5中的鸡蛋白溶菌酶介导的量子点自组装聚集体(QDs@CEWL)的高分辨透射电子显微镜照片(Transmission Electron Microscope，TEM)。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，以下结合实例及附图对本发明提供的技术方法做进一步详细的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体，该纳米晶体自组装聚集体是以蛋白质为载体材料，将油溶性纳米粒子包封在载体材料中形成纳米晶体自组装聚集体。该自组装聚集体由蛋白质与油溶性纳米晶体自组装形成。组装的驱动力为疏水性作用，蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的水合动力学粒径在20-500nm范围内连续可调。

蛋白质选自牛血清白蛋白、鸡蛋白溶菌酶、牛乳白蛋白等具有疏水性结构域的蛋白质。油溶性纳米粒子为量子点、超顺磁性氧化铁纳米粒子、银纳米晶体、金纳米晶体中的一种或几种的组合。

蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的制备方法，将油溶性纳米粒子(一种或几种)同时溶于有机溶剂，并与蛋白质溶液混合，即得同时具有多种纳米晶体特性的多功能纳米晶体自组装聚集体。蛋白质介导的油溶性纳米晶体自组装聚集体，其合成方法在于将蛋白质溶液与油溶性纳米晶体混合。包括如下步骤：

1)将蛋白质溶液溶解在蛋白质缓冲液中，配置成蛋白溶液；蛋白质缓冲液为水或者磷酸盐缓冲液；

2)将一种或几种油溶性纳米粒子溶解在有机溶剂中，配置成纳米晶体溶液；

3)将纳米晶体溶液与蛋白质溶液混合，震荡摇匀；

4)将上述混合液在室温下孵育，得到孵育后的混合液；

5)将上述孵育后的混合液离心，去除上清液，沉淀即为蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体。

蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/mL，纳米晶体溶液的浓度为0.05-20mg/mL，纳米晶体的浓度越高，所得纳米晶体自组装聚集体的粒径越大。步骤4)中，孵育的时间为三小时以上。

实施例1牛血清白蛋白介导的超顺磁性氧化铁纳米粒子自组装聚集体(SPIONs@BSA)的制备以及其粒径控制

具体操作为：

1)合成粒径为6nm的油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子。

2)将牛血清白蛋白溶液溶解在水中，配置成浓度为2mg/mL的蛋白溶液。

3)将油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子溶解在四氢呋喃中，制成浓度为0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL，2mg/mL的纳米晶体溶液。

4)将800μL纳米晶体溶液注入3mL蛋白质溶液中，快速震荡摇匀；

5)将上述混合液在室温下孵育三小时或以上；

6)将上述孵育后的混合液离心，去上清，沉淀即为所得。

图1和图2分别是所制备的牛血清白蛋白介导的油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子自组装聚集体(SPIONs@BSA)的TEM图和其水合动力学粒径随超顺磁性氧化铁纳米粒子浓度变化的曲线。从图1可以看出：所制备的超顺磁性氧化铁纳米粒子自组装成团簇结构，粒径均一，纳米晶体密度高，同一个团簇结构中有50个以上的纳米晶体。从图2可以看出，油溶性纳米粒子的浓度越高，所得纳米晶体自组装聚集体的粒径越大。

实施例2牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)的制备

具体操作为：

1)合成油溶性量子点。

2)将牛血清白蛋白溶液溶解在磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为2mg/mL的蛋白溶液。

3)将油溶性量子点溶解在四氢呋喃中，制成浓度为1mg/mL的纳米晶体溶液。

4)将100μL纳米晶体溶液注入3mL蛋白质溶液中，快速震荡摇匀；

5)将上述混合液在室温下孵育三小时或以上；

6)将上述孵育后的混合液离心，去上清，沉淀即为所得。

图3和图4分别是所制备的牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)的TEM图和其水合动力学粒径曲线。从图3可以看出：所制备的量子点自组装成团簇结构，纳米晶体密度高，同一个团簇结构中有50个以上的纳米晶体。从图4可以看出，所制备的量子点自组装聚集体粒径均一。

图5展示的是所制备的牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)在水中的胶体稳定性。将牛血清白蛋白介导的量子点自组装聚集体(QDs@BSA)溶解在水中，放置在4摄氏度环境下，QDs@BSA的粒径在1个月以内不发生变化，展现出很好的胶体稳定性。

实施例3牛血清白蛋白介导的多功能纳米晶体自组装聚集体(SPIONs&QDs@BSA)的制备

具体操作为：

1)合成油溶性量子点。

2)合成粒径为6nm的油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子。

3)将牛血清白蛋白溶液溶解在磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为2mg/mL的蛋白溶液。

4)将油溶性量子点和油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子同时溶解在四氢呋喃中，制成浓度为1mg/mL的纳米晶体溶液，两种纳米晶体的质量比为1:1。

5)将200μL纳米晶体溶液注入3mL蛋白质溶液中，快速震荡摇匀；

6)将上述混合液在室温下孵育三小时或以上；

将上述孵育后的混合液离心，沉淀即为所得。

图6是所制备的多功能纳米晶体自组装聚集体(SPIONs&QDs@BSA)在磁铁吸引下的荧光特性，表示所制备的多功能纳米晶体自组装聚集体(SPIONs&QDs@BSA)同时具有磁性和荧光特性。

实施例4牛血清白蛋白介导的多功能纳米晶体自组装聚集体(gQDs&rQDs@BSA)聚集体内不同晶体的比例控制

具体操作为：

1)合成红色和绿色油溶性量子点；

2)将牛血清白蛋白溶液溶解在磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为2mg/mL的蛋白溶液；

4)将两种颜色的油溶性量子点同时溶解在四氢呋喃中，制成浓度为1mg/mL的纳米晶体溶液，两种纳米晶体的质量比为1:1、3:1、5:1；

5)将200μL纳米晶体溶液注射到3mL蛋白质溶液中，快速震荡摇匀；

6)将上述混合液在室温下孵育三小时或以上；将上述孵育后的混合液离心。

图7是所制备的多功能纳米晶体自组装聚集体(gQDs&rQDs@BSA)内不同晶体的比例控制分析结果。

实施例5鸡蛋白溶菌酶(Chicken egg white lysozyme,CEWL)介导的量子点自组装聚集体(QDs@CEWL)的制备

具体操作为：

1)合成油溶性量子点。

2)将鸡蛋白溶菌酶溶解在磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为5mg/mL的蛋白溶液。

3)将油溶性量子点溶解在四氢呋喃中，制成浓度为0.2mg/mL的纳米晶体溶液。

4)将50μL纳米晶体溶液注入3mL蛋白质溶液中，快速震荡摇匀；

5)将上述混合液在室温下孵育三小时或以上；

6)将上述孵育后的混合液离心，去上清，沉淀即为所得。

图8和图9是所制备的鸡蛋白溶菌酶介导的量子点自组装聚集体(QDs@CEWL)的TEM图。从图8可知，量子点自组装成不规则球状团簇。从图9可知，在每一个团簇结构中量子点的封装密度高，在显微镜的一个层面可以看到10个左右的量子点，纳米颗粒的粒径为30纳米到40纳米。

Claims (1)

1.蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体的制备方法，其特征在于：该纳米晶体自组装聚集体是以蛋白质为载体材料，将油溶性纳米粒子包封在载体材料中形成纳米晶体自组装聚集体，包括如下步骤：

1)将蛋白质溶液溶解在蛋白质缓冲液中，配置成蛋白溶液；

2)将一种或几种油溶性纳米粒子溶解在有机溶剂中，配置成纳米晶体溶液；

3)将纳米晶体溶液与蛋白质溶液混合，震荡摇匀；

4)将上述混合液在室温下孵育，得到孵育后的混合液；

5)将上述孵育后的混合液离心，去除上清液，沉淀即为蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体；

所述的蛋白质选自牛血清白蛋白、鸡蛋白溶菌酶和牛乳白蛋白；所述的油溶性纳米粒子为量子点、银纳米晶体、金纳米晶体中的一种或几种的组合；所述的蛋白溶液的浓度为2mg/mL，所述的纳米晶体溶液的浓度为1mg/mL；步骤4)中，所述的孵育的时间为三小时以上；所述的有机溶剂为四氢呋喃。

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