CN109694400A - 一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白及其制备方法 Download PDF

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cell
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lys
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高光
崔院平
程远政
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Suzhou Gaohong Likang Biotechnology Co Ltd
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Suzhou Gaohong Likang Biotechnology Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明提供了一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及制备方法，其中所述F蛋白的氨基酸序列为SEQ:ID:NO:1。并在可溶的F蛋白的Furin识别位点上进行氨基酸点突变；同时在C端添加了GCN4片段制备F蛋白，通过这样的序列设计，保证了在真核***中表达出来的F蛋白避免被Furin酶解从而保持了胞外段的完整性，维持了F蛋白的Pre‑fusion状态和完整的免疫原性。这样的F蛋白是诱导机体产生针对RSV病毒具有免疫保护作用的抗体所必需的，有效提高了后期筛选到阳性抗体的几率。

Description

一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）属于副粘病毒科肺病毒属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒。RSV病毒每年会造成约6400万人的全球感染，超过300万婴幼儿住院治疗，16万婴幼儿的死亡，是引起婴幼儿病毒性支气管炎和肺炎的最主要的病原体，因而针对RSV感染的预防免疫和临床治疗是及其重要的。目前全球范围内尚无可应用的RSV疫苗，其研制是世界性的难题。因此RSV病毒引起的下呼吸道疾病成为我国乃至全球婴幼儿计划免疫中缺失最严重的病种之一。临床上用于治疗RSV相关疾病的药物各有缺陷，且在我国没有上市，因而有效治疗RSV病毒引起的新生儿下呼吸道疾病是我们亟待解决的问题，而针对RSV病毒的治疗性抗体是解决问题最直接的手段。抗体制备过程中的第一步是用具有免疫原性的抗原对动物进行免疫。RSV病毒的F蛋白是用于动物免疫并诱导机体产生RSV免疫保护的理想抗原。F蛋白是RSV病毒表面最重要的一种糖蛋白，它与宿主细胞膜表面的特异受体结合，介导病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，引起病毒核酸进入宿主细胞内而得到复制。具有这样的能力主要是由于F蛋白拥有两个多重碱性氨基酸蛋白酶（Furin）的酶切位点。在应用真核***表达F蛋白的过程中，保持其pre-fusion时的天然活性状态，即不被Furin酶解，是使其具有完整免疫原性并用于动物免疫的关键。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提出一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白，其氨基酸序列为SEQ:ID:NO:1。
优选地，一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、选取RSV病毒F蛋白的胞外段，所述胞外段的序列为SEQ:ID:NO:2，（26AA-513AA），将其中的Furin切割区域进行点突变，并在N端添加CD5信号肽、C端添加GCN4片段，按照人类的密码子偏好性进行密码子优化，合成该优化的基因，并亚克隆至pcDNA3.1-Neoless表达载体中，测序验证无误后，使用Qiagen质粒大量抽提试剂盒制备去内毒素质粒；
S2、选取293F细胞解冻后转移至离心管中，并加入预热至室温的FreeStyle™ 293培养基，混匀后室温离心5分钟，去掉上清后，用FreeStyle™ 293培养基重悬细胞后，将细胞悬液转移至摇瓶中，连续培养，调整细胞至对数生长期；
S3、将转染试剂及上述构建的可溶性F蛋白表达载体混合均匀；取1×PBS缓冲液至6孔板中，加入pcDNA-CMV-Soluble F protein质粒后充分混匀，加入转染试剂，混匀，室温下静置10分钟；
S4、将上述转染复合物加入到293F细胞中充分混匀，将细胞置于37℃、5% CO2培养箱，培养6~8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyle™ 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养；
S5、连续培养7天后，离心收集培养基上清，用滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用体外免疫层析检测试剂检测卡进行检测后，继续用帕利珠单抗磁珠亲和层析纯化目的重组蛋白。
优选地，所述S1中CD5信号肽的序列为SEQ:ID:NO:3。
优选地，所述S1中GCN4片段的序列为SEQ:ID:NO:4。
优选地，所述S2中所述细胞悬液在摇瓶中连续培养期间，当细胞密度达到2*10^6细胞/mL时，进行稀释传代，细胞的接种密度为5*10^5细胞/mL。
优选地，所述S3中转染试剂为LVTransm转染试剂。
优选地，所述S4中转染复合物为DNA/ LVTransm。
优选地，所述S5中体外免疫层析检测试剂检测卡为 Alere BinaxNOW® RSV 检测卡。
本发明的有益效果主要体现在：由于识别Pre-fusion状态的F蛋白表位中和活性更强，F蛋白的结构不稳定，且中间存在Furin酶识别的片段，真核表达时会将其切割成F1和F2两个片段，为了解决这些问题，申请人在可溶的F蛋白的Furin识别位点上进行氨基酸点突变；同时在C端添加了GCN4片段。通过这样的序列设计，保证了在真核***中表达出来的F蛋白避免被Furin酶解从而保持了胞外段的完整性，维持了F蛋白的Pre-fusion状态和完整的免疫原性。 这样的F蛋白是诱导机体产生针对RSV病毒具有免疫保护作用的抗体所必需的，有效提高了后期筛选到阳性抗体的几率。
附图说明
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：
图1：RSV病毒可溶性F蛋白全长示意图。
图2：SDS-PAGE电泳检测结果示意图。
图3：Alere BinaxNOW® RSV Card试剂盒检测结果示意图。
图4：pDonor-CMV-puro载体示意图。
具体实施方式
本发明揭示了一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法，其中所述F蛋白的氨基酸序列为SEQ:ID:NO:1，其序列为：
MELPILNTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANSRARREAPRGMRYTMNLQRNVNVTDSLKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
其制备方法包括如下步骤：在RSV病毒F蛋白的全长序列中，选取RSV病毒F蛋白的胞外段（26AA-513AA），所述胞外段的序列为SEQ:ID:NO:2，其序列为：
QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANSKAKKEAPRGMRYTMNLQRNVNVTDSLKKKKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL
将其中的Furin切割区域进行点突变，并在N端添加CD5信号肽、C端添加GCN4片段，按照人类的密码子偏好性进行密码子优化，合成该优化的基因，并亚克隆至pcDNA3.1-Neoless表达载体中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒。其中，所述CD5信号肽为SEQ:ID:NO:3，该序列为：MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG。所述GCN4片段序列为SEQ:ID:NO:4，序列为RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER。所述突变位点以氨基酸在全长的序列中所在位置看，其中编码蛋白的106位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K；编码蛋白的108位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K；编码蛋白的109位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K；编码蛋白的133位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K；编码蛋白的135位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K；编码蛋白的136位点的精氨酸R已经突变为编码赖氨酸K。即106R>K, 108R>K, 109R>K, 133R>K, 135R>K, 136R>K。
从液氮中取出293F细胞，在37℃水浴锅中迅速解冻，在生物安全柜中将解冻后的细胞转移至15mL离心管中，并加入5mL预热至室温的FreeStyle™ 293培养基，轻轻混匀后，室温500xg离心5分钟，在生物安全柜中去掉上清后，用20mL FreeStyle™ 293培养基重悬细胞后，将细胞悬液转移至125mL的摇瓶中，设置摇床转速130RPM、5% CO2，连续培养，调整细胞至对数生长期。期间，细胞密度达到2*10^6细胞/mL时，进行稀释传代，细胞的接种密度为5*10^5细胞/mL。
从冰箱中取出LVTransm转染试剂及上述构建的可溶性F蛋白表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出1×PBS缓冲液，温热至室温。取2mL 1×PBS至6孔板的一个孔，加入100μg pcDNA-CMV-Soluble F protein质粒后，移液器上下吹打充分混匀后，加入300μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
将上述DNA/ LVTransm转染复合物加入到50 mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱，130RPM培养6~8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyle™ 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Alere BinaxNOW® RSV Card进行检测后，继续用Palivizumab磁珠亲和层析纯化目的重组蛋白。其中，Alere BinaxNOW® RSV 试剂盒进行可溶性F蛋白的检测，结果如图3所示，其中SF为RSVF蛋白的检测，Control为FreeStyle™ 293培养基的检测，P为阳性 QC样品检测，N为阴性 QC样品检测，以上图中结果显示：本试剂盒采用胶体金原理进行检测，在硝酸纤维素膜上有2条线，一条为样本线，吸附有抗RSV抗体，另一条为对照线，吸附有对照抗体。抗RSV抗体和对照抗体结合到可视粒子上，这种粒子干燥结合到惰性纤维支持物上。检测条是由显示检测结果的结合垫和有条带的膜组成的。当测试样本滴加到检测条顶部的白色垫上，闭合检测卡。样本中存在的RSV抗原与抗RSV抗体结合形成复合物，此复合物被固定在样品线上的抗RSV抗体捕获并产生颜色反应，形成可视的样本线。固定的对照线抗体捕获一个可视的结合物，形成一条粉红色的对照线。图3所示，P所代表的阳性QC样本（样本线和对照线均显色）和N所代表的阴性QC样本（对照线显色，样本线未显色）检测结果表明试剂盒的检测是处于正常状态，其中Control为FreeStyle™ 293培养基的检测结果（样本线未显色，对照线显色）说明培养基中不含有影响检测结果的物质，SF的RSVF蛋白检测结果（样本线和对照线均显色）表明RSV抗原阳性。
对以上制备的可溶性F蛋白进行SDS-PAGE检测，其检测结果如图2所示， SDS-PAGE用于检测蛋白的大小和浓度，浓度越高显示的越明显，图2所示可以看出可溶性蛋白F的大小在60KD左右，与设计中的大小一致，说明表达出的可溶性F蛋白的分子量是正确的，其中样本浓度通过2μg和4μg的量可以看出，随着浓度的增大显示的越明显。
以下简述下本发明F蛋白的应用：
如果想获得针对F蛋白的特异性纳米抗体，需要免疫羊驼，但由于可溶性F蛋白带有GCN4片段，为了排除筛选的克隆与该GCN4片段结合的可能，需要构建一个过表达全长RSV F蛋白的重组K562细胞株；根据NCBI上公布的全长F蛋白序列信息，按照人类的密码子偏好性进行优化，合成该全长片段后亚克隆至慢病毒表达载体中。综上所述，通过构建了全长F蛋白野生型序列（全长型）和突变型（可溶性）（Furin cleavage site突变）进行基因合成，亚克隆至pDonor-CMV-puro中，构建表达载体。所述pDonor-CMV-puro载体如图1所示。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒。该载体为sleepingbeauty转座子***中携带目的基因的转座子载体，使用该载体与表达转座酶的pSB11质粒，可将目的基因稳定整合至靶细胞基因组中获取到稳定高表达目的基因的重组细胞株。
本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
序列表
<110> 苏州高泓利康生物科技有限公司
<120> 一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Leu Pro Ile Leu Asn Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Arg Gly Met Arg Tyr Thr Met Asn Leu Gln Arg Asn Val Asn Val Thr
115 120 125
Asp Ser Leu Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 2
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile
20 25 30
Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp
35 40 45
Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala
50 55 60
Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser
65 70 75 80
Lys Ala Lys Lys Glu Ala Pro Arg Gly Met Arg Tyr Thr Met Asn Leu
85 90 95
Gln Arg Asn Val Asn Val Thr Asp Ser Leu Lys Lys Lys Lys Lys Phe
100 105 110
Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala
115 120 125
Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser
130 135 140
Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys
165 170 175
Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile
180 185 190
Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile
195 200 205
Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr
210 215 220
Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val
245 250 255
Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu
260 265 270
Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys
275 280 285
Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly
290 295 300
Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn
305 310 315 320
Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln
325 330 335
Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser
340 345 350
Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys
355 360 365
Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser
370 375 380
Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser
385 390 395 400
Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr
405 410 415
Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr
420 425 430
Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro
435 440 445
Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp
450 455 460
Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe
465 470 475 480
Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu
485
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly
20
<210> 4
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
1 5 10 15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu
20 25 30
Arg

Claims (8)

1.一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ:ID:NO:1。
2.根据权利要求1所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、选取RSV病毒F蛋白的胞外段，所述胞外段的序列为SEQ:ID:NO:2，将其中的Furin切割区域进行点突变，并在N端添加CD5信号肽、C端添加GCN4片段，按照人类的密码子偏好性进行密码子优化，合成该优化的基因，并亚克隆至pcDNA3.1-Neoless表达载体中，测序验证无误后，使用Qiagen质粒大量抽提试剂盒制备去内毒素质粒；
S2、选取293F细胞解冻后转移至离心管中，并加入预热至室温的FreeStyle™ 293培养基，混匀后室温离心5分钟，去掉上清后，用FreeStyle™ 293培养基重悬细胞后，将细胞悬液转移至摇瓶中，连续培养，调整细胞至对数生长期；
S3、将转染试剂及上述构建的可溶性F蛋白表达载体混合均匀；取1×PBS缓冲液至6孔板中，加入pcDNA-CMV-Soluble F protein质粒后充分混匀，加入转染试剂，混匀，室温下静置10分钟；
S4、将上述转染复合物加入到293F细胞中充分混匀，将细胞置于37℃、5% CO2培养箱，培养6~8小时后，加入新鲜的FreeStyle™ 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养；
S5、连续培养7天后，离心收集培养基上清，用滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用体外免疫层析检测试剂检测卡进行检测后，继续用帕利珠单抗磁珠亲和层析纯化目的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S1中CD5信号肽的序列为SEQ:ID:NO:3。
4.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S1中GCN4片段的序列为SEQ:ID:NO:4。
5.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S2中所述细胞悬液在摇瓶中连续培养期间，当细胞密度达到2*10^6细胞/mL时，进行稀释传代，细胞的接种密度为5*10^5细胞/mL。
6.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S3中转染试剂为LVTransm转染试剂。
7.根据权利要求6所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S4中转染复合物为DNA/ LVTransm。
8.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S5中体外免疫层析检测试剂检测卡为 Alere BinaxNOW® RSV 检测卡。
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