CN102144027B

CN102144027B - 生产多能干细胞的方法

Info

Publication number: CN102144027B
Application number: CN200980135775.7A
Authority: CN
Inventors: 榎龙嗣; 岩本章子; 西江敏和; 円居隆宏; 高岛扶有子; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2029-07-07
Also published as: US9238797B2; JP5688970B2; DK2295538T3; CN102144027A; KR101642790B1; US20110117653A1; WO2010004989A1; EP2295538B1; KR20110025861A; EP2295538A4; JPWO2010004989A1; EP2295538A1

Abstract

本发明涉及一种生产含有多能干细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在营养饥饿条件下处理已与核程序重编因子接触的体细胞的步骤，和/或用能够使细胞周期停滞的物质处理体细胞的步骤。本发明使得可以高频率诱导和生长多能干细胞，还使得可以高效率生产多能干细胞。作为核程序重编因子，可使用选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28中的任一个。

Description

生产多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生产具有分化成多种细胞的能力的多能干细胞的方法。

背景技术

能够分化成生物体的所有细胞系的多能干细胞，具有分化成任意的细胞类型和产生任意类型组织或器官的潜在能力。因此，将这种细胞应用于新的旨在再生和补充生物体中损失的细胞的疗法(再生医学)是值得期待的。此外，这种细胞可供作为胚胎学、分子生物学和药学领域中的研究工具。

胚胎干细胞(ES细胞)已知是一种多能干细胞，其是从处于称为胚泡的时期的早期胚胎当中的内细胞团建立的“细胞株系”。但是，从伦理学角度，通过破坏人胚胎来制备人ES细胞通常招致反对，这种研究在许多情况下是受限制的。

为了克服ES细胞的问题，开发了多能干细胞，它是通过将基因人工导入到体细胞中而诱导出的细胞株系，无需使用胚胎(诱导的多能干细胞(iPS细胞)：例如非专利文献1)。这种细胞是通过将参与细胞全能性的获得和保持的基因人工导入到体细胞中制备的。目前，对于制备这种细胞的程序或者利用这种细胞的方法的研究正在积极推进。

非专利文献1公开了通过导入编码四种肽即OCT3/4、SOX2、c-MYC和KLF4的基因来制备人iPS细胞的方法。此外，其他研究者报道了通过导入编码另外四种多肽即OCT4、SOX2、NANOG和LIN28的基因来制备人iPS细胞(非专利文献2)。但是，并非所有导入了这些基因的体细胞会被诱导成iPS细胞，事实上，只有其中一部分(占总细胞数的0.02％或更低)会被诱导成iPS细胞。为了提高诱导效率，尝试了向培养基加入抑制DNA甲基化的物质(非专利文献3)。此外，由于c-MYC是癌基因，在将导入了基因的细胞应用于医学时，该细胞发生癌化的风险是不可避免的，因此进行了不用c-MYC来诱导iPS细胞的尝试。但是，在这种情形下，诱导效率进一步降低(占总细胞数的0.001％或更低)。这样，在当前的情况下尚不能说制备iPS细胞的技术已确立。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Cell，vol.131，pp.861-872，2007

非专利文献2：Science，vol.318，pp.1917-1920，2007

非专利文献3：Nature，doi：10.1038/nature07056，2008

发明概要

本发明所要解决的课题

为了设法利用多能干细胞，迫切需要开发出有效率地制备多能干细胞的方法。本发明的一个目标是提高多能干细胞的诱导效率和促进对多能干细胞的研究和利用。

解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人作出了极大的努力，结果发现，在培养已与参与细胞核的程序重编的因子(本文中也称为核程序重编因子，nuclearreprogrammingfactors)接触过的体细胞时，通过在营养饥饿条件下处理该细胞，可以高频率地诱导出ES细胞样细胞，即保持多能性的干细胞，从而可以高效率地和稳定地生产多能干细胞，于是完成了本发明。此外还发现，与使用聚凝胺(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene))的常规方法相比，当在具有结合到反转录病毒的活性的功能物质存在下，将携带编码核程序重编因子的基因的反转录病毒载体导入体细胞中时，多能干细胞的诱导效率得到提高，从而可以更高的效率获得多能干细胞，于是完成了本发明。

概括地说，本发明的第一个发明涉及生产含有多能干细胞的细胞群体的方法，该方法的特征在于包括将已与核程序重编因子接触过的体细胞在营养饥饿条件下处理的步骤，和/或用能够使细胞周期停滞的物质处理体细胞的步骤。作为第一发明的一个方面，提供了其中在营养饥饿条件下处理的步骤是在蛋白质饥饿条件下处理的步骤的生产方法，和提供了其中在蛋白质饥饿条件下处理的步骤是如下培养步骤的生产方法：用具有低蛋白质浓度的培养基，例如蛋白质浓度为0-0.5％的培养基，来培养已与核程序重编因子接触过的体细胞。此外，提供了其中已与核程序重编因子接触过的体细胞是选自以下的体细胞的生产方法：在加入了核程序重编因子的培养基中培养过的体细胞、导入了核程序重编因子的体细胞、导入了编码核程序重编因子的基因的体细胞和其中核程序重编因子的表达用物质来诱导的体细胞。此外，还提供了其中核程序重编因子选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28的生产方法。

本发明的第二个发明涉及生产含有多能干细胞的细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：

(1)使核程序重编因子与体细胞接触的步骤，和

(2)在营养饥饿条件下处理(1)中获得的体细胞和/或用能够使细胞周期停滞的物质处理体细胞的步骤。

作为第二个发明的一个方面，提供了其中步骤(1)通过选自以下的操作进行的生产方法：将核程序重编因子加到培养基、将核程序重编因子或编码核程序重编因子的基因导入到体细胞中，和用物质来诱导核程序重编因子在体细胞中的表达。另外，提供了其中步骤(2)的在营养饥饿条件下处理的步骤是在蛋白质饥饿条件下处理的步骤的生产方法，和提供了其中在蛋白质饥饿条件下处理的步骤是通过用具有低蛋白质浓度的培养基、例如蛋白质浓度为0-0.5％(w/v)的培养基培养细胞来进行的生产方法。另外，还提供了其中在蛋白质饥饿条件下处理的步骤中所用的培养基中包含细胞死亡抑制剂的生产方法。此外，还提供了其中核程序重编因子选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28的生产方法。

本发明的第三个发明提供生产多能干细胞的方法，所述方法包括通过第一和第二个发明生产含有多能干细胞的细胞群体的步骤，和从所得的细胞群体分离多能干细胞的步骤。

本发明的第四个发明涉及生产含有多能干细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在具有结合到反转录病毒的活性的功能物质存在下，用携带编码核程序重编因子的基因的反转录病毒载体感染体细胞的步骤。作为第四个发明的一个方面，提供了其中具有结合到反转录病毒的活性的功能物质是选自纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、V型胶原、多肽的片段、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖的功能物质，和具有衍自该物质的反转录病毒结合位点的功能物质。另外，还提供了其中具有结合到反转录病毒的活性的功能物质是具有纤连蛋白的肝素-II结合区域的多肽。此外，还提供了其中编码核程序重编因子的基因是编码选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28的核程序重编因子的基因的生产方法。

本发明的第五个发明提供生产多能干细胞的方法，所述方法包括通过第四个发明生产含有多能干细胞的细胞群体的步骤，和从所得的细胞群体分离多能干细胞的步骤。

发明的效果

由于根据本发明获得的多能干细胞具有分化成所需细胞的能力，并且通过分化多能干细胞获得的分化细胞在活体中显示出高的移入能力，因此本发明的方法非常适用于基础研究和医学应用研究。

附图简述

图1是来自克隆#1和克隆#3(通过本发明建立的iPS细胞克隆)的ES细胞以及作为阳性对照的253G1和作为阴性对照的成人皮肤成纤维细胞(NHDF-Ad)的标志基因表达模式的电泳照片。

图2是从表现出形成所建立的iPS细胞克隆的畸胎瘤的能力的三胚层衍生的细胞的照片。

图3是显示通过EB分化诱导所建立的iPS细胞克隆的多能性的照片。

实施本发明的方式

以下详细描述本发明。

在本发明的方法中，体细胞指构成生物体的细胞当中除生殖细胞以外的细胞。通过使这些体细胞与核程序重编因子接触，会发生核程序重编，从而细胞可获得全能性。

使体细胞与核程序重编因子接触的步骤可通过以下方法来进行：将所述因子的多肽加到与体细胞接触的培养基的方法(例如CellStemCell，vol.4，pp.472-476，2009)、将所述因子的多肽导入到体细胞中的方法、将编码所述因子的基因导入到体细胞中的方法、或者用某种物质如化学物质等(例如5-氮杂-2’脱氧胞苷、BIX-01294、PD0325901、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸等)诱导所述内源因子在体细胞中的表达的方法或者任何上述方法的组合。

将编码核程序重编因子的基因导入体细胞中的方法，包括例如将掺入了编码核程序重编因子的基因的载体导入到体细胞中的方法。对载体没有具体限定，而是可以使用选自已知的载体的适当载体。例如，使用病毒载体的方法或者使用非病毒载体的方法中任一者都可用于本发明。这些载体的细节已在许多文献中公布，可从这些许多文献当中作出适当选择来使用载体。

对如上所用的病毒载体没有具体限定，而是通常可使用在基因转移的方法中采用的已知病毒载体，例如反转录病毒载体(包括慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、类人猿病毒载体、痘苗病毒载体或者仙台病毒载体。特别优选地，可使用反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。作为病毒载体，优选其中复制能力缺损从而不能在感染的细胞中自我复制的病毒载体。或者，在基因转移时，可使用能提高基因转移效率的物质。能提高基因转移效率的物质的例子包括具有结合到病毒载体的能力的物质，例如诸如纤连蛋白和纤连蛋白片段的物质。优选地，可使用具有肝素结合位点的纤连蛋白片段，例如以Retronectin(注册商标，CH-296，TAKARABIOINC.制造)市售的片段。在特别是使用反转录病毒载体或慢病毒载体导入基因时，上述物质是优选的，不过这不是对本发明的特别限定。可通过将编码核程序重编因子的基因掺入到一种或多种病毒载体中来使用这些基因。当使用两种或更多种反转录病毒载体或慢病毒载体时，特别是当病毒感染进行多次时，优选使用能提高基因转移效率的物质，特别是纤连蛋白或纤连蛋白片段。

常规上，在基于诱导多能干细胞的目的用反转录病毒载体进行的基因转移中，已经使用了聚凝胺，它是具有提高用反转录病毒感染细胞的效率的活性的合成聚阳离子。本发明人首先发现，在不采用聚凝胺而是在具有结合到反转录病毒的活性的功能物质存在下使用反转录病毒载体将编码核程序重编因子的基因导入到体细胞中时，与使用聚凝胺的情况相比，多能干细胞的诱导效率得到提高，结果是可高频率地获得多能干细胞。即，作为本发明的另一个方面，提供了生产含有多能干细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在具有结合到反转录病毒的活性的功能物质存在下，用携带编码核程序重编因子的基因的反转录病毒载体感染体细胞的步骤。如上所述，在本方面中，可使用反转录病毒载体，包括慢病毒载体或假型载体。

另外，对具有结合到反转录病毒的活性的功能物质没有任何具体限制，只要该物质是具有所述活性的物质即可，不过例如可使用纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、V型胶原、前述多肽的片段、聚赖氨酸或DEAE-葡聚糖。此外，可使用具有衍自所述物质的反转录病毒结合位点的功能物质。作为纤连蛋白的片段，优选的是在分子中具有肝素-II结合区域的片段，这种片段在例如国际公开号97/18318小册子中有描述。作为具有肝素-II结合区域的纤连蛋白片段，可使用Retronectin(注册商标，CH-296，TAKARABIOINC.制造)。或者，也可使用在功能上与这些功能物质相当的物质，例如具有肝素结合位点的功能物质。另外，可使用功能物质的混合物、含有功能物质的多肽、功能物质的聚合物或者功能物质的衍生物。

此外，可使用具有结合到反转录病毒的活性并同时具有结合到靶标细胞(即将向其中导入基因的体细胞)的活性的功能物质，或者可将具有结合到反转录病毒的活性的功能物质和具有靶标细胞结合活性的功能物质一起使用。对具有靶标细胞结合活性的功能物质没有具体限定，不过其例子包括具有能结合靶标细胞的配体的物质。配体的例子包括细胞粘附蛋白(纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或其片段、激素、细胞因子、细胞表面上的抗原的抗体、多糖、糖蛋白、糖脂、衍自糖蛋白或糖脂的糖链、或者靶细胞的代谢物。

在本发明的一个优选方面，功能物质以固定在例如细胞培养中所用的容器(板、培养皿、瓶或袋)或载体(微珠等)上的固定状态来使用。

根据本发明的方法，由于即使使用低浓度的病毒也能以比常规方法更高的效率获得多能干细胞，因此有可能大大降低所用的病毒量。

另外，如以下实施例所示，根据本发明，即使当仅将编码OCT4、SOX2和KLF4的三种基因导入到体细胞中时，也能以比常规方法更高的效率获得多能干细胞。

对以上使用的非病毒载体没有具体限制，不过其例子包括质粒载体，这可通过使用载体(如脂质体或配体-聚赖氨酸)的导入方法、磷酸钙方法、电穿孔方法或粒子枪方法来导入。

编码核程序重编因子的基因通常是通过将它们***到病毒载体或非病毒载体中使得它们在适当启动子的控制下表达来使用。作为启动子，可使用能促进组成型表达的启动子、其表达由某种物质(例如四环素或多柔比星)诱导的启动子等中的任何一种。另外，为了获得基因的有效转录，载体中可存在能与启动子或转录起始位点协作的其他调节元件，例如增强子序列或终止子序列。另外，可仅将编码其中一种核程序重编因子的基因掺入到一个载体中，和可将编码多个因子的多个基因通过将它们掺入到一个载体中来使用。此外，除了编码所述因子的基因以外，还可掺入可作为确认所述基因的导入的标志的基因(例如抗药基因、编码报道酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。

作为用于本发明的核程序重编因子，OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG或LIN28是已知的，通常使它们中的多种、优选两种至三种或更多种与体细胞接触。有关衍自各种生物体(例如人、小鼠)的因子的氨基酸序列的信息，以及编码所述因子的基因的核苷酸序列的信息，可从数据库获得。编码所述因子的基因可分离得到，或者基于可从数据库获得的序列信息人工合成而得到。此外，所述因子(多肽)还可从通过培养已导入了这些基因的转化子获得的培养物获得。

以下描述了用编码核程序重编因子的基因制备多能干细胞的方法。

(1)使核程序重编因子与体细胞接触的步骤

对本发明中所用的体细胞没有具体限定，因此可使用任意的体细胞。例如，可使用诸如成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、血细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、造血干细胞或神经干细胞等体细胞。体细胞可以是从活体收集的任何体细胞，或者是作为细胞株系建立的体细胞。当需要将制备的多能干细胞或从这种细胞分化的细胞移植到活体中时，优选的是用采集自活体本身的体细胞诱导多能干细胞。

用上述的已知载体将编码核程序重编因子的基因导入到体细胞中，并从导入的基因表达所述因子。如此进行核程序重编因子和体细胞之间的接触。

当基因转移是用多个掺入了编码核程序重编因子的基因的载体进行时，各个载体可依次导入到体细胞中，或者可制备载体的混合物，从而将载体同时导入到体细胞中。

(2)在营养饥饿条件下处理已与核程序重编因子接触的体细胞的步骤。

通过将已与核程序重编因子接触的体细胞例如在(1)中所述的步骤中获得的体细胞暴露于营养饥饿的条件，可提高多能干细胞的诱导和生长的频率或产率，从而可高效率地生产多能干细胞。本文中，暴露于营养饥饿条件是指将细胞在这样的培养基中进行培养：该培养基不含有作为细胞营养来源的成分当中的某种指定成分(例如氨基酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、有机酸或维生素)，或者该指定成分的浓度降低(在下文中，这种培养基在一些情况中被描述为营养饥饿培养基)。本发明没有具体限定，不过在本发明中，可以采用在这样的培养基中培养细胞的操作，该培养基不含蛋白质或蛋白质的浓度降低，例如培养基的蛋白质浓度在0-0.5％(w/v)的范围内(在下文中，这种培养基在一些情况中被描述为蛋白质饥饿培养基)，优选培养基的蛋白质浓度在0-0.3％(w/v)的范围内，更优选培养基的蛋白质浓度在0-0.1％(w/v)的范围内。可用已知的方法，例如Lowry方法、Bradford方法或二喹啉甲酸(BCA)方法，通过测量标准的蛋白质(例如牛血清白蛋白)来测量蛋白质饥饿培养基中的蛋白质浓度。

用于制备蛋白质饥饿培养基的基础培养基含有能量来源如氨基酸、糖类或有机酸、维生素、用于调节pH的缓冲成分，或者无机盐，以及例如也可使用已知的培养基如DMEM或它的改进的培养基，或者其他市售可获得的培养基。可以加入通常被加到ES细胞或iPS细胞的培养基的、用于维持多能性的成分，例如生长因子如白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)或纤毛神经营养因子(CNTF)或其他细胞因子。此外，可加入血清或血浆。另外，将上述的各种成分加到培养基，使得培养基中的蛋白质的最终总量在0-0.5％(w/v)的范围内，优选在0-0.3％(w/v)的范围内，更优选在0-0.1％(w/v)的范围内。

当使用不含有除蛋白质以外的各成分当中的某种指定成分或者该指定成分的浓度降低的营养饥饿培养基时，如前述的蛋白质饥饿培养基的情况一样，制备不含该成分的培养基或者该成分的浓度比正常培养基低的培养基；此外也可按照公知的培养基制备方法制备，然后可用这种培养基培养已与核程序重编因子接触的体细胞。另外，该成分可以是单一成分，或者是多种成分。或者，可除去蛋白质饥饿培养基中的别的成分(其他的成分)，或可降低其浓度。

在营养饥饿条件下的处理可这样进行：在使已与核程序重编因子接触的体细胞例如(1)中描述的步骤中获得的体细胞与饲养细胞进行共培养后，更换上营养饥饿培养基并继续进行培养。这种培养基更换可通过一次操作来进行，或者培养基用营养饥饿培养基替代可通过逐步降低营养成分的浓度来进行。之后，可通过更换上其中进行与饲养细胞的共培养的培养基来继续进行培养。或者，从培养的开始用营养饥饿培养基培养如上的(1)中描述的步骤中获得的体细胞，之后可通过更换上其中进行与饲养细胞的共培养的培养基来继续进行培养。用营养饥饿培养基处理并不限于通过培养基更换进行的处理，然而所述处理也可以是在基本同等的条件下进行处理的其他方法。例如，营养饥饿状态可通过诸如以下的操作方法获得：将蛋白酶加到培养基以降低蛋白质浓度的方法，或者加入脂肪酶以降低脂肪浓度的方法，等等。

另外，对本文所指的饲养细胞没有具体限定，只要它能供应对于诱导的多能干细胞的生长有效成分，不过优选使用诸如成纤维细胞(例如胚胎成纤维细胞)等的细胞。

对要接种在饲养细胞上的、在(1)中描述的步骤中获得的体细胞的数目(本文中也称为接种数目)没有具体限定，只要它是能使多能干细胞得到有效诱导的细胞数目，但当不导入c-MYC基因时，通常接种大约9,000个细胞/cm²。在本发明中，通过降低要接种的体细胞的细胞数目，多能干细胞可进一步得到有效诱导。例如，细胞数目适宜为100-5000个细胞/cm²，优选250-5000个细胞/cm²。

也可使用胞外基质蛋白质或其片段来代替饲养细胞。优选的是，该蛋白质或其片段以固定在适当的固相(例如培养用的容器等)上的状态使用。

也就是说，本发明的生产含有多能干细胞的细胞群体的方法的特征是包括这样的步骤：在培养已与核程序重编因子接触的体细胞的整个期间或者在该期间的任意部分时间中，在营养饥饿条件下处理细胞。任何包括在营养饥饿条件下培养已与核程序重编因子接触的体细胞的方法，无论培养时间多长，都包括在本发明中。在本发明的一个优选方面，在培养已与核程序重编因子接触的体细胞的步骤的期间，将体细胞暴露于营养饥饿条件至少12小时或更长，优选18小时或更长。处理时间没有具体的上限，但从细胞存活的角度，将体细胞处理8天以内的时间，优选6天以内的时间。

另外，在本发明中，可以使用能够使细胞周期停滞的物质处理体细胞的步骤，取代在营养饥饿条件下处理的步骤。对能够使细胞周期停滞的物质没有具体限定，但可使用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如丁内酯I、奥罗莫星(olomoucine)、roscovitine、PurvalanolA、PurvalanolB、DRB(5，6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷)、SU9516、NU6102、NU6140、JNJ-7706621、CDK1/2抑制剂II、夫拉平度(flavopiridol)、PD0332991或CDK2抑制肽(TAT-LFG和TAT-LDL)，抗癌剂，如丝裂霉素、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、羟基脲、盐酸伊立替康、阿霉素、放线菌素D、依托泊苷、紫杉醇或博来霉素、DHCP(4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮)或其衍生物或者雷帕霉素。能够使细胞周期停滞的物质的量可根据所用的物质适当确定。

此外，在本发明中，可同时进行在营养饥饿条件下处理的步骤和用能够使细胞周期停滞的物质处理的步骤两者。

另外，在培养周期的一部分中，可使用细胞死亡抑制剂。对细胞死亡抑制剂没有具体限定，但可使用Y-27632[(R)(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐]等。

对培养已与核程序重编因子接触的体细胞的条件没有具体限定，无论它是营养饥饿条件、用能够使细胞周期停滞的物质处理的条件还是正常条件，但可使用正常的细胞培养条件。例如，可采用在90-98％的湿度、3-7％的CO₂浓度和30-40℃下进行培养。当然，可在适当的时间更换上新鲜培养基。

通过上述方法获得的多能干细胞可基于其形态学特征与其他细胞区别开来。或者，也可通过作为未分化状态的指标的标志分子的表达来确认该细胞，所述标志分子例如碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原(SSEA，例如SSEA-4等)、肿瘤排斥抗原(TRA)-1-60、TRA-1-81、OCT4或NANOG。这种分子的表达可用例如能识别这种分子的抗体来确认。对于碱性磷酸酶，其表达可基于其酶活性来确认。

进一步地，将多能干细胞从通过上述方法获得的细胞群体中分离出来，从而可获得与其他细胞分离开来的多能干细胞。可通过已知的方法将这样分离的多能干细胞建立为细胞株系。即，在本发明的一个方面提供了生产多能干细胞的方法，该方法包括生产含有本发明的多能干细胞的细胞群体的方法的步骤，和将多能干细胞从所得的细胞群体中分离出来的步骤。

因此，根据本发明，可以以比常规的产生多能干细胞(例如iPS细胞)的方法更高的频率诱导和生长多能干细胞，从而改进多能干细胞的产率。

实施例

下面通过实施例对本发明作具体的描述，但本发明丝毫不局限于以下实施例的范围。

制备实施例1.核程序重编因子基因的克隆

(1)pDON-AI-2-Neo-SOX2和pDON-AI-2-Neo-KLF4质粒的构建

由NCBI数据库登录号NM_03106.2的序列信息，分别合成了具有SEQIDNo.：1或2所示的核苷酸序列的用于扩增SOX2基因的合成引物hSOX2-F和hSOX2-R。另外，由NCBI数据库登录号NM_004235.3的序列信息，分别合成了具有SEQIDNo.：3或4所示的核苷酸序列的用于扩增KLF4基因的合成引物hKLF4-F和hKLF4-R。

分别用hSOX2-F和hSOX2-R引物对和hKLF4-F和hKLF-R引物对，用PrimeSTAR(注册商标)MAXPreMix(TAKARABIOINC.制造)，并采用由HumanBrainPolyA+RNA(Clonetech制造)合成的cDNA作为模板，进行了PCR。反应完成后，将反应溶液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，提取并纯化了涉及SOX2基因的约1kbpDNA片段和涉及KLF4基因的约1.5kbpDNA片段。然后，将所得的DNA片段用限制性内切核酸酶NotI(TAKARABIOINC.制造)和SalI(TAKARABIOINC.制造)消化并进行纯化，以得到SOX2片段和KLF4片段。

将SOX2片段和KLF4片段分别与已用NotI-SalI类似地进行消化的pDON-AI-2NeoDNA(TAKARABIOINC.制造)混合，并使用DNA连接试剂盒<MightyMix>(TAKARABIOINC.制造)进行连接。用此反应产物转化大肠杆菌JM109(TAKARABIOINC.制造)以获得转化株。

从由该转化株制备的质粒选出其中***了目的DNA片段的质粒，以获得重组质粒pDON-AI-2-Neo-SOX2和pDON-AI-2-neo-KLF4。这个pDON-AI-2-Neo-SOX2是包含NM_003106.2中所含的编码SOX2多肽的开放阅读框的质粒。而pDON-AI-2-Neo-KLF4是包含NM_004235.3中所含的编码KLF4多肽的序列的质粒。

(2)pDON-AI-2-Neo-OCT4、pDON-AI-2-Neo-LIN28和pDON-AI-2-Neo-NANOG质粒的构建

基于NCBI数据库登录号NM_002701.4、NM_024674.4和NM024865.2的序列信息，分别合成了分别编码多肽OCT4、LIN28和NANOG的人工合成基因。这些人工合成基因除了编码每个多肽的开放阅读框的核苷酸序列以外，还在5’末端具有紧接在CDS之前的三个核苷酸的序列和限制性内切核酸酶NotI的识别序列，以及在3’末端具有限制性内切核酸酶SalI的识别序列。如在制备实施例1-(1)中，利用NotI和SalI的识别序列，将三种人工合成基因与pDON-AI-2Neo连接，以获得其中***各个基因的重组质粒pDON-AI-2-Neo-OCT4、pDON-AI-2-Neo-LIN28和pDON-AI-2-Neo-NANOG。

制备实施例2.反转录病毒载体的制备

(1)向pDON-AI-2和pDON-5质粒载体中的转移

分别用限制性内切核酸酶NotI和SalI处理制备实施例1所制备的PDON-AI-2-Neo-OCT4、pDON-AI-2-Neo-SOX2、pDON-AI-2-Neo-KLF4、pDON-AI-2-Neo-LIN28和pDON-AI-2-Neo-NANOG，并将所产生的片段进行1.0％琼脂糖电泳从而在凝胶上分离。从凝胶提取和纯化含有编码各个多肽的开放阅读框的片段，将每个片段与已用NotI-SalI类似地进行消化的pDON-5DNA(TAKARABIOINC.制造)混合，并用DNA连接试剂盒<MightyMix>(TAKARABIOINC.制造)连接。从这样制备的重组质粒中选出其中正确***了每个基因的质粒，将它们分别命名为pDON-5-OCT4、pDON-5-SOX2、pDON-5-KLF4、pDON-5-LIN28和pDON-5-NANOG。

对于OCT4、KLF4和LIN28的三个基因，通过相同的操作分别制备了其中这些基因***到pDON-AI-2DNA(TAKARABIOINC.制造)中的重组质粒，将它们分别命名为pDON-AI-2-OCT4、pDON-AI-2-KLF4和pDON-AI-2-LIN28。

(2)IRES片段的制备

合成了SEQIDNo.：5和6所示的用于扩增IRES序列的合成引物IRES-F-SalI和IRES-R-NotI。为了扩增IRES序列，用IRES-F-SalI和IRES-R-NotI作为引物，用pIRES2-ZsGreen1(Clonetech制造)作为模板DNA，并采用PrimeSTAR(注册商标)DNA聚合酶(TAKARABIOINC.制造)，进行了PCR。反应完成后，将反应溶液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，提取并纯化了约0.6kbpDNA片段。然后，将此DNA片段用限制性内切核酸酶SalI和NotI消化并进行纯化，以获得IRES片段。

(3)SOX2、LIN28和NANOG片段的制备

用限制性内切核酸酶NotI和HpaI处理制备实施例2-(1)中制备的pDON-5-SOX2、pDON-5-LIN28和pDON-5-NANOG质粒，并将所产生的片段进行1.0％琼脂糖电泳从而在凝胶上分离。从凝胶提取和纯化出含有SOX2、LIN28或NANOG各自的基因的片段(分别描述为SOX2片段、LIN28片段和NANOG片段)。

(4)pDON-AI-2-OCT4-IR-SOX2、pDON-AI-2-LIN28-IR-NANOG、pDON-5-OCT4-IR-SOX2、pDON-5-LIN28-IR-NANOG和pDON-5-NANOG-IR-LIN28质粒的构建

将用限制性内切核酸酶SalI和HpaI消化制备实施例2-(1)中制备的pDON-AI-2-OCT4、pDON-AI-2-LIN28、pDON-5-OCT4、pDON-5-LIN28和pDON-5-NANOG而获得的片段，与(2)中制备的IRES片段及(3)中制备的SOX2片段、LIN28片段和NANOG片段按表1中的组合进行混合，并用DNA连接试剂盒<MightyMix>(TAKARABIOINC.制造)进行连接。

[表1]

用于构建质粒的各个片段的组合

从这样制备的重组质粒中选出其中正确***了每个基因的质粒，并命名为pDONAI-2-OCT4-IR-SOX2、pDON-AI-2-LIN28-IR-NANOG、pDON-5-OCT4-IR-SOX2、pDON-5-LIN28-IR-NANOG或pDON-5-NANOG-IR-LIN28。pDON-AI-2-OCT4-IR-SOX2是其中OCT4基因、IRES和SOX2基因从pDON-AI-2的5’末端一侧按顺序***pDON-AI-2中所得的质粒。pDON-AI-2-LIN28-IR-NANOG是其中LIN28基因、IRES和NANOG基因从pDON-AI-2的5’末端一侧按顺序***pDON-AI-2中所得的质粒。pDON-5-OCT4-IR-SOX2是其中OCT4基因、IRES和SOX2基因从pDON-5的5’末端一侧按顺序***pDON-5中所得的质粒。pDON-5-LIN28-IR-NANOG是其中LIN28基因、IRES和NANOG基因从pDON-5的5’末端一侧按顺序***pDON-5中所得的质粒。pDON-5-NANOG-IR-LIN28是其中NANOG基因、IRES和LIN28基因从pDON-5的5’末端一侧按顺序***pDON-5中所得的质粒。

(5)反转录病毒载体的产生

将G3T-hi细胞(TAKARABIOINC.制造)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen制造)和1％青霉素/链霉素(NACALAITESQUE，INC.制造)的10F-DMEM[D-MEM(Sigma制造)]中，将4mL的悬浮液接种在包被胶原的6cm平皿(IWAKICO.，LTD制造)上，并在CO₂培养箱中于37℃温育24小时。

将10μL的TransIT(注册商标)-293(TAKARABIOINC.制造)混合到500mL的OPTI-MEM(Invitrogen制造)中，让混合物于室温静置5分钟。加入2μg的pGP质粒(TAKARABIOINC.制造)、1μg的pE-Ampho质粒(TAKARABIOINC.制造)并分别加入2μg的制备实施例2-(1)和(4)中制备的每种重组质粒，将它们混合，然后再让混合物于室温静置15分钟。将此混合的溶液加到G3T-hi细胞，继续进行培养，24小时后更换上4mL的10F-DMEM。再培养24小时后，回收含有病毒的培养基，用0.45μm过滤器过滤，以制备含有反转录病毒载体的病毒溶液。再加入10F-DMEM，继续进行培养，24小时后回收含有病毒的培养基，用0.45μm过滤器过滤，以制备病毒溶液，将其也用于实验。当病毒溶液在制备后不立即使用时，将其于-80℃冷冻保藏，使用时通过解冻进行使用。从各个重组质粒获得的反转录病毒载体的名称中表2中示出。

[表2]

反转录病毒载体的名单

制备实施例3.表达荧光蛋白的反转录病毒载体的制备

(1)质粒载体的制备

将AcGFP1基因从pAcGFP1(Clonetech制造)转移到pDON-AI-DNA(TAKARABIOINC.制造)中以制备pDON-AI-AcGFP1。类似地，将mStrawberry基因从pmStrawberry载体(Clonetech制造)转移到pDON-AI-2NeoDNA中以制备pDON-AI-2-Neo-mStrawberry。

(2)反转录病毒载体的产生

按与制备实施例2-(5)同样的方法，从pDON-AI-AcGFP1制备反转录病毒载体DON-am-AcGFP1，以及从pDON-AI-2-Neo-mStrawberry制备反转录病毒载体DONAI2-am-mStrawberry。

制备实施例4.小鼠ES细胞的培养基的制备

(1)100×LIF的制备

向0.5mL的10⁶单位/mL白血病抑制因子(LIF；ESGRO，Invitorgen制造)加入8.5mL的敲除DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基，Invitorgen制造)和1.5mL的敲除血清替代品(Invitrogen制造)以制备100×LIF。

(2)小鼠ES细胞的培养基的制备

通过将75mL的敲除血清替代品(Invitrogen制造)、5mL的100×非必需氨基酸混合物(NEAA混合物，Lonza制造)、5mL的100mM丙酮酸钠(Lonza制造)、5mL的200mML-谷氨酰胺(Lonza制造)、0.91mL的55mM2-巯基乙醇(Invitrogen制造)和5mL的(1)中制备的100×LIF加到425mL的敲除DMEM中，制备小鼠ES细胞的培养基。

实施例1.多能干细胞的诱导

(1)固定Retronectin在培养板上

向未处理的6孔培养板(Becton，DickinsonandCompany制造)的每个孔加入2mL用磷酸盐缓冲水溶液(PBS)稀释的Retronectin(注册商标，TAKARABIOINC.制造)溶液，20-25μg/mL，并于4℃进行固定过夜或者于室温进行固定2小时。之后，从每个孔除去溶液，用PBS洗涤一次，在4℃保藏以备进行每个实验。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

将制备实施例2中制备的病毒溶液700μL按表3的组合加到(1)中制备的固定有Retronectin的培养板的每个孔，然后于32℃和2,000×g离心2小时。

[表3]

反转录病毒载体的组合

之后，从每个孔除去上清液，用PBS洗涤一次，将2mL悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL的成人皮肤成纤维细胞(Lonza制造)在各孔上接种。在于32℃和500×g下离心10分钟后，在CO₂培养箱中于37℃开始培养(培养的第0天)。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

在培养的第1天进行第二次基因转移。将制备实施例2所制备的病毒溶液700μL按表3的组合进行混合，然后加入聚凝胺(海美溴铵；Aldrich制造)至8μg/mL的最终浓度，以制备反转录病毒载体混合溶液。从已在(2)中培养的培养板除去上清液，加入此反转录病毒载体混合溶液。在CO₂培养箱中于37℃培养4小时后，加入2mL的10F-DMEM。再培养2天后，除去上清液，加入2mL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)接种在饲养细胞上

将终浓度为1mg/mL的明胶(Sigma制造)水溶液加到10cm平皿(IWAKICO.，LTD.制造)，在室温中固定1小时或者于4℃固定过夜，然后洗涤以制作固定有明胶的平皿。向其中接种用终浓度为12μg/mL的丝裂霉素C(NACALAITESQUE，INC.制造)处理的SNL76/7细胞(DSPharma制造)1×10⁶个细胞，然后将其在CO₂培养箱中于37℃培养过夜，从而制得饲养细胞。

回收在(3)中制备的在培养的第7天导入了基因的细胞，并悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL。将10mL的此悬浮液接种在饲养细胞上，继续进行培养。

(5)蛋白质饥饿或甲基化抑制剂处理

在培养的第8天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，除去上清液，在蛋白质饥饿处理条件下加入10mL的不含血清的DMEM(0F-DMEM：通过将胎牛血清从10F-DMEM去除而获得)。另一方面，在甲基化抑制剂处理条件下，加入10mL的ES细胞培养基[灵长类动物ES细胞(ReproCELLIncorporated制造)的培养基，含有1％青霉素/链霉素、4ng/mLbFGF(R&Dsystems制造)]，再加入5-氮杂-2’-脱氧胞苷(Sigma制造)至1μM的终浓度。另外，每个处理在实施例1-(2)中描述的条件A、B和C下进行。

在开始蛋白质饥饿处理或甲基化抑制处理后2天(自培养开始第10天)，除去上清液，向每个平皿加入10mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能细胞集落的计数

在培养的第28天，对在条件A、B和C下进行的蛋白质饥饿处理或甲基化抑制剂处理的多能干细胞(iPS细胞)数目进行计数。其结果在表4中示出。

[表4]

在培养的第28天iPS细胞集落的数目

如表4所示，在反转录病毒载体的任何组合中，蛋白质饥饿处理组的多能干细胞集落的数目远多于甲基化抑制剂处理组。其揭示：通过在诱导多能干细胞的过程中进行蛋白质饥饿处理，大大提高了多能干细胞的诱导效率。

另外，在蛋白质饥饿处理组中，在任何条件下在培养的第16天都可确认到多能干细胞集落，而在甲基化抑制剂处理组中，则在培养的第26天确认多能干细胞集落。其揭示：通过进行蛋白质饥饿处理，可大大缩短诱导多能干细胞的时间。

(7)培养基中蛋白质浓度的测量

对于以上实施例中使用的10F-DMEM、DMEM和ES细胞培养基，用Bradford方法(CoomassiePlusProteinAssayReagent；Pierce制造)测量它们各自所含的蛋白质的浓度。结果证实，在10F-DMEM、DMEM和ES细胞培养基中分别含有5.5mg/mL、0.633mg/mL和24.1mg/mL(均为牛血清白蛋白当量)的蛋白质。

实施例2.蛋白质饥饿条件的研究

(1)固定Retronectin在培养板上

按照与实施例1-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例1-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过在细胞接种后不进行离心。另外，按反转录病毒载体DON5-am-OCT4-IR-SOX2、DON5-am-LIN28-IR-NANOG和DONAI2-am-KLF4的组合分别进行基因转移。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例2-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第6天，按照与实施例1-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，并继续进行培养，不过饲养细胞(丝裂霉素C处理的SNL76/7细胞或STO细胞(DainipponPharmaCo.，Ltd制造))各接种1.5×10⁶个细胞。另外，导入了基因的细胞各接种2.5×10⁵个细胞。

(5)蛋白质饥饿处理

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从平皿除去上清液，将细胞在表5所示的条件下进行处理。在该表中，0.5F-DMEM表示含有0.5％血清的DMEM。更换上ES细胞培养基后，在各条件下继续进行培养直至培养的第28天，并且在这期间每隔1-2天更换培养基。

[表5]

蛋白质饥饿条件

(6)多能干细胞的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表6中示出。

[表6]

在培养的第28天iPS细胞集落的数目

条件	iPS细胞集落数
		对照	10
条件A	54
		条件B	30
条件C	78
		条件D	98
条件E	33
		条件F	52
条件G	98
		条件H	14
条件I	64

如表6所示，蛋白质饥饿处理组中的多能干细胞集落数远多于对照组(未处理)。其揭示：通过在诱导多能干细胞的过程中进行蛋白质饥饿处理，大大提高了多能干细胞的诱导效率。另外揭示出，通过加入Y27632[(R)(+)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐](抑制蛋白质饥饿处理期间的细胞死亡的物质之一)，稳定地获得了多能干细胞集落。

实施例3.细胞周期停滞剂的研究

(1)固定Retronectin在培养板上

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例1-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过用含有1.5％人血清白蛋白的PBS洗涤板，并且在细胞接种后不进行离心。另外，按反转录病毒载体DON5-am-OCT4-IR-SOX2、DON5-am-LIN28-IR-NANOG或DON5-am-KLF4的组合进行基因转移。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例3-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第7天，按照与实施例1-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养。

(5)细胞周期停滞剂处理

在培养的第8天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从平皿除去上清液，更换上ES细胞培养基，然后设定出加入PurvalanolA(Sigma制造)至终浓度为0.1μM、0.5μM或2μM的组和加入羟基脲(Sigma制造)至终浓度为10μM或100μM的组。另外，所述试剂没有加到对照组。培养2天后，更换上ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第22天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第22天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表7中示出。

[表7]

在培养的第22天iPS细胞集落数

条件	iPS细胞集落数
		对照	2
Purvalanol A 0.1μM	28
		Purvalanol A 0.5μM	19
Purvalanol A 2μM	19
		羟基脲10μM	26
羟基脲100μM	13

如表7所示，细胞周期停滞剂处理组中的多能干细胞集落数目远多于对照组(未处理)。即其揭示：通过在诱导多能干细胞的过程中进行使细胞周期停滞的处理，大大提高了多能干细胞的诱导效率。

实施例4.导入了基因的细胞的接种数目的研究

(1)固定Retronectin在培养板上

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例2-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)。另外，按反转录病毒载体DON5-am-OCT4-IR-SOX2、DON5-am-LIN28-IR-NANOG或DON5-am-KLF4的组合进行基因转移。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

在第二次基因转移中，在培养的第一天，将病毒溶液700μL按实施例4-(2)的组合进行混合，加入聚凝胺至8μg/mL的终浓度以制备反转录病毒载体混合溶液，从培养了细胞的板中除去上清液，加入此反转录病毒载体混合溶液。培养1天后，除去上清液，加入2mL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第6天，按照与实施例2-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，并继续进行培养，不过设定出各接种0.62×10⁵、1.25×10⁵、2.5×10⁵或5×10⁵个导入了基因的细胞的组。

(5)蛋白质饥饿处理

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从平皿除去上清液，加入10mL的0F-DMEM。培养2天后，除去上清液，向每个平皿加入9mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。另外，按(iPS细胞集落数目÷导入了基因的细胞的接种数目)×100来计算iPS细胞的诱导效率(％)。其结果在表8中示出。

[表8]

在培养的第28天iPS细胞集落的数目

如表8所示，导入了基因的细胞的接种数目越少，多能干细胞集落的诱导效率越高。即，其揭示：在诱导多能干细胞的过程中通过降低导入了基因的细胞的接种数目，提高了多能干细胞的诱导效率。

实施例5.蛋白质饥饿条件的研究-2

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

在培养的第1天，按照与实施例5-(2)同样的方法进行第二次基因转移。

(4)饲养细胞的接种

在培养的第6天，按照与实施例2-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养，不过将6孔培养板(Coming制造)用作培养容器，饲养细胞各接种2.5×10⁵个细胞。另外，导入了基因的细胞各接种2×10⁴个细胞。

(5)蛋白质饥饿处理

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，将细胞在表9所示的条件下进行处理。另外，在更换上ES细胞培养基后，在各条件下继续进行培养直至培养的第28天，在此期间每隔1-2天更换培养基。

[表9]

蛋白质饥饿条件

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表10中示出。表中的数字表示N＝2的平均值。

[表10]

培养的第28天的iPS细胞集落数

条件	iPS细胞集落数
		对照	17.5
条件A	21.0
		条件B	20.5
条件C	32.5
		条件D	32.0
条件E	28.0
		条件F	19.5
条件G	29.0
		条件H	27.5
条件I	26.5
		条件J	26.5
条件K	33.5
		条件L	27.0
条件M	28.0
		条件N	38.5
条件O	37.5

如表10所示，蛋白质饥饿处理组的多能干细胞集落的数目远多于对照组(未处理)。即，其揭示：通过在诱导多能干细胞的过程中进行蛋白质饥饿处理，大大提高了多能干细胞的诱导效率。另外揭示出，通过加入Y27632[(R)(+)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐](抑制蛋白质饥饿处理期间的细胞死亡的物质之一)，稳定地获得了多能干细胞集落。

实施例6.导入了基因的细胞的接种数目的研究-2

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

在培养的第1天，按照与实施例6-(2)同样的方法进行第二次基因转移。

(4)饲养细胞的接种

在培养的第6天，按照与实施例5-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，并继续进行培养，不过设定出各接种2.5×10³、5×10³、1×10⁴、2×10⁴、4×10⁴或8×10⁴个导入了基因的细胞的组。

(5)蛋白质饥饿处理

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，加入2mL的0F-DMEM或ES细胞培养基(对照)。培养2天后，除去上清液，向每个孔加入2mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。另外，按(iPS细胞集落数目÷导入了基因的细胞的接种数目)×100来计算iPS细胞诱导效率(％)。其结果在表11和表12中示出。表11显示对照组的结果，表12显示蛋白质饥饿组的结果。

[表11]

培养的第28天的iPS细胞集落的数目(对照组)

[表12]

培养的第28天iPS细胞集落的数目(蛋白质饥饿组)

如表11和12所示，与对照组(未处理)相比，在蛋白质饥饿处理组中，导入了基因的细胞的接种数目越少，多能干细胞集落的诱导效率越高。即，其揭示：通过在诱导多能干细胞的过程中进行蛋白质饥饿处理以降低导入了基因的细胞的接种数目，提高了多能干细胞的诱导效率。

实施例7.基因导入方法的研究

对于用反转录病毒载体进行基因转移，使用Retronectin或聚凝胺进行了一次或两次导入，并进行了多能干细胞的诱导，然后进行比较。设定的条件在表13中示出。

[表13]

条件	处理方法
		条件A	用Retronectin进行基因转移一次，不进行蛋白质饥饿处理
条件B	用Retronectin进行基因转移一次，进行蛋白质饥饿处理
		条件C	用聚凝胺进行基因转移一次，不进行蛋白质饥饿处理
条件D	用聚凝胺进行基因转移一次，进行蛋白质饥饿处理
		条件E	用Retronectin进行基因转移两次，不进行蛋白质饥饿处理
条件F	用Retronectin进行基因转移两次，进行蛋白质饥饿处理
		条件G	用聚凝胺进行基因转移两次，不进行蛋白质饥饿处理
条件H	用聚凝胺进行基因转移两次，进行蛋白质饥饿处理

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

对于用Retronectin进行基因转移，按照与实施例4-(2)同样的方法进行基因转移。如下实施用聚凝胺进行的基因转移。即，在前一天在6孔培养板的每个孔上分别接种2mL悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL的人皮肤成纤维细胞，然后培养1天。将制备实施例2中制备的病毒溶液各700μL按表3的条件C的组合进行混合，加入聚凝胺至8μg/mL的终浓度以制备反转录病毒载体混合溶液，从培养了细胞的板中除去上清液，加入此反转录病毒载体混合溶液，开始进行培养(培养的第0天)。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

对于其中进行第二次基因转移的组，在培养的第1天，按照与实施例4-(2)同样的方法实施用Retronectin进行的基因转移。按照与实施例7-(2)的用聚凝胺进行的基因转移同样的方法，实施用聚凝胺进行的基因转移。即，从已培养了细胞的板中除去上清液，加入类似地制备的反转录病毒载体混合溶液，继续进行培养。培养1天后，除去上清液，加入2mL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第6天，按照与实施例5-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养，不过导入了基因的细胞各接种1.75×10⁴个细胞。

(5)蛋白质饥饿处理

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，加入2mL的0F-DMEM或ES细胞培养基(非蛋白质饥饿处理组)。培养2天后，除去上清液，向每个孔加入2mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表14中示出。表中的数字表示N＝2的平均值。

[表14]

培养的第28天iPS细胞集落数

条件	IPS细胞集落数
		条件A	9.5
条件B	25.5
		条件C	1.0
条件D	7.0
		条件E	26.0

条件F	30.0
		条件G	0.5
条件H	1.0

如表14所示，用Retronectin进行基因转移与用聚凝胺进行基因转移相比，多能干细胞的诱导效率要高得多。另外揭示出，通过进行蛋白质饥饿处理，进一步提高了诱导效率。

实施例8.多重基因转移时的基因导入方法的比较

在多能干细胞诱导时，在某些情况下使用多种反转录病毒载体来进行基因转移。于是，作为用多种反转录病毒载体进行基因转移的方法，比较了Retronectin和聚凝胺的基因转移效率。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定，不过使用未经处理的24孔培养板(Becton，DickinsonandCompany制造)，且向每个孔中各加入500μL的Retronectin溶液。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移

按照与实施例3-(2)同样的方法实施用Retronectin进行基因转移，不过反转录病毒载体是DON-am-AcGFP1和DONAI2-am-mStrawberry的组合，且基因转移是通过将病毒溶液各250μL进行混合来进行。此外，还设定了混合250μL的用10F-DMEM稀释50倍的病毒溶液的组。另外，将细胞悬浮于培养基中成4×10⁴个细胞/mL，向每个孔加入500μL。

按照与实施例7-(2)用聚凝胺进行基因转移同样的方法，按与反转录病毒载体相同的组合实施用聚凝胺进行基因转移，不过将细胞悬浮于培养基中成4×10⁴个细胞/mL，且向24孔培养板(Corning制造)的每个孔加入500μL。另外，将病毒溶液250μL进行混合，加入聚凝胺至4μg/mL的终浓度以制备反转录病毒载体混合溶液。培养1天后，除去上清液，加入500μL的10F-DMEM，继续进行培养。

(3)基因转移效率的测量

自基因转移操作起3天后回收细胞，用流式细胞仪(CytomicsFC500，BeckmannCoulterInc.制造)测量AcGFP1阳性和mStrawberry阳性细胞。其结果在表15中示出。表15显示每种基因转移方法中双阳性细胞的比例。

[表15]

双阳性细胞的比例

如表15所示，当使用两种反转录病毒载体进行基因转移时，用Retronectin进行基因转移与用聚凝胺进行基因转移相比，两种基因导入的细胞的比例要高得多。即，由于当诱导多能干细胞时，在许多情况中使用到两种或更多种反转录病毒载体，因此认为通过使用Retronectin，多个基因的导入的比例变得较高，结果是多能干细胞的诱导效率得到提高。另外认为，当实施用Retronectin进行基因转移时，通过将病毒溶液加以稀释来使用，基因转移效率进一步得到提高，结果是有可能进一步提高多能干细胞的诱导效率。

实施例9.多重基因导入时的基因转移方法的比较-2

对使用多种反转录病毒载体以Retronectin或聚凝胺进行基因转移的效率作进一步的比较。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例8-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移

按照与实施例8-(2)同样的方法进行基因转移，不过设定了其中病毒溶液用10F-DMEM稀释10倍或100倍的组。

(3)基因转移效率的测量

按照与实施例8-(3)同样的方法测量基因转移效率，不过用流式细胞仪进行的测量是在基因转移操作后5天进行。其结果在表16中示出。表16显示每种基因转移方法中双阳性细胞的比例。

[表16]

双阳性细胞的比较

基因转移方法	双阳性细胞的比例
		用Retronectin进行基因转移	33.9
用聚凝胺进行基因转移	7.7
		用Retronectin进行基因转移，病毒10倍稀释	55.4
用聚凝胺进行基因转移，病毒10倍稀释	36.0
		用Retronectin进行基因转移，病毒100倍稀释	67.6
用聚凝胺进行基因转移，病毒100倍稀释	8.4

如表16所示，当基因转移是使用两种反转录病毒载体来进行时，与用聚凝胺进行的基因转移相比，通过在Retronectin存在下进行基因转移时，两种基因导入的细胞的比例明显更高。即，由于当诱导多能干细胞时，在许多情况中使用到两种或更多种反转录病毒载体，因此通过使用Retronectin，多个基因的导入的比例变得较高，从而认为结果是多能干细胞的诱导效率得到提高。另外认为，当实施用Retronectin进行基因转移时，通过将病毒溶液加以稀释来使用，基因转移效率得到提高，结果是有可能进一步提高多能干细胞的诱导效率。

实施例10.基因转移方法的研究-2

对于用反转录病毒载体进行的基因转移，在分别使用Retronectin或聚凝胺的条件下进一步改变反转录病毒的量，进行多能干细胞的诱导，然后进行比较。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例7-(2)同样的方法进行基因转移，不过设定了其中病毒溶液用10F-DMEM稀释10倍或100倍的组。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例7-(3)同样的方法进行第二次基因转移，不过对于病毒稀释组，使用如实施例10-(2)所述进行稀释的病毒溶液。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例7-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养，不过导入了基因的细胞各接种2×10⁴个细胞。

(5)培养

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，加入2mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表17中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表17]

在培养的第28天iPS细胞集落的数目

基因转移方法	IPS细胞集落数
		用Retronectin进行基因转移	6.5
用聚凝胺进行基因转移	0.0
		用Retronectin进行基因转移，病毒10倍稀释	12.0

用聚凝胺进行基因转移，病毒10倍稀释	1.5
		用Retronectin进行基因转移，病毒100倍稀释	17.5
用聚凝胺进行基因转移，病毒100倍稀释	0.0

如表17所示，用Retronectin进行基因转移与用聚凝胺进行基因转移相比，多能干细胞的诱导效率要高得多。另外揭示出，当实施用Retronectin进行基因转移时，通过将病毒溶液加以稀释来使用，基因转移效率进一步得到提高，结果是多能干细胞的诱导效率进一步得到提高。

实施例11.基因转移方法的研究-3

将待导入的基因限定于OCT4、SOX2和KLF4这三种，进行了与实施例10相同的实验。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例10-(2)同样的方法进行基因转移，不过使用制备实施例2中制备的反转录病毒载体DON5-am-OCT4-IR-SOX2和DON5-am-KLF4作为反转录病毒载体。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例10-(3)同样的方法进行第二次基因转移，不过所用的反转录病毒载体与实施例11-(2)相同。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例10-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养。

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法进行培养。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表18中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表18]

在培养的第28天iPS细胞集落数

基因转移方法	IPS细胞集落数
		用Retronectin进行基因转移	13.0
用聚凝胺进行基因转移	5.5
		用Retronectin进行基因转移，病毒10倍稀释	28.0
用聚凝胺进行基因转移，病毒10倍稀释	6.0
		用Retronectin进行基因转移，病毒100倍稀释	32.0
用聚凝胺进行基因转移，病毒100倍稀释	4.0

如表18所示，即使当仅导入OCT4、SOX2和KLF4这三种基因时，用Retronectin进行基因转移与用聚凝胺进行基因转移相比，多能干细胞的诱导效率也要高得多。另外，当用Retronectin进行基因转移时通过将病毒溶液加以稀释来使用，基因转移效率得到进一步提高，结果是多能干细胞的诱导效率变得更高，这对于仅导入三种基因的情况也是如此。

实施例12.多重基因导入时的基因转移方法的比较-3

对使用多种反转录病毒载体以Retronectin或聚凝胺进行基因转移的效率作进一步的比较。将衍自四种不同供体的人皮肤成纤维细胞作为目标，与多能干细胞诱导实验一样，使用进行两次基因转移的方法，进行荧光蛋白基因的导入。在本实施例中，细胞A表示衍自一名28岁白人女性，细胞B表示衍自一名42岁白人女性，细胞C表示衍自一名51岁白人女性，细胞D表示衍自一名48岁黑人女性(均由Lonza制造)。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例8-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过设定了其中病毒溶液用10F-DMEM稀释10倍、100倍或1000倍的组。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

在培养的第1天按照与实施例12-(2)同样的方法进行第二次基因转移，不过在用聚凝胺进行基因转移时，在培养的第2天除去上清液，加入500μL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)基因转移效率的测量

按照与实施例8-(3)同样的方法，在培养的第6天测量基因转移效率。其结果在表19中示出。表19显示在每种基因转移方法中，每孔双阳性细胞的比例。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表19]

双阳性细胞的比例

基因转移方法	细胞A	细胞B	细胞C	细胞D
					Retronectin，病毒原液	42.5	35.9	42.1	38.4
聚凝胺，病毒原液	17.9	16.3	17.1	16.5
					Retronectin，病毒10倍稀释	55.9	49.7	54.6	54.2
聚凝胺，病毒10倍稀释	40.1	39.2	36.0	44.1
					Retronectin，病毒100倍稀释	61.6	57.7	60.2	63.2
聚凝胺，病毒100倍稀释	9.7	9.7	11.6	14.4
					Retronectin，病毒1000倍稀释	51.9	48.7	46.4	51.0
聚凝胺，病毒1000倍稀释	0.3	0.3	0.4	0.6

如表19所示，首先揭示，在用Retronectin进行基因转移时，观察到成人皮肤成纤维细胞的供体对基因转移效率的影响极小。即一般认为，当用Retronectin诱导多能干细胞时，不管供体的来源如何，稳定的基因转移都是有可能的。

在用两种反转录病毒载体进行基因转移时，通过在Retronectin存在下进行基因转移，与用聚凝胺进行基因转移相比，两种基因导入的细胞的比例高。即，由于当诱导多能干细胞时，在许多情况中使用到两种或更多种反转录病毒载体，因此认为通过在诱导时使用Retronectin，多个基因的导入的比例得到提高，结果是多能干细胞的诱导效率得到提高。

另外，如表19所示，即使当在用Retronectin进行基因转移时将病毒溶液稀释100倍或1000倍来使用，也有可能高效率地进行基因转移。即提示，通过在诱导多能干细胞时使用Retronectin，即使是用低滴度的病毒或少量的病毒，也可能以高的诱导效率诱导多能干细胞。

实施例13.供体之间的差异的研究

对于用反转录病毒载体进行的基因转移，如实施例12一样将四种成人皮肤成纤维细胞作为目标，使用Retronectin或聚凝胺进行多能干细胞诱导，然后进行比较。设定的条件在表20中示出。

[表20]

条件	处理方法
		条件A	用Retronectin进行基因转移，细胞A
条件B	用聚凝胺进行基因转移，细胞A
		条件C	用Retronectin进行基因转移，细胞B
条件D	用聚凝胺进行基因转移，细胞B
		条件E	用Retronectin进行基因转移，细胞C
条件F	用聚凝胺进行基因转移，细胞C
		条件G	用Retronectin进行基因转移，细胞D
条件H	用聚凝胺进行基因转移，细胞D

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定，不过使用未经处理的12孔培养板(Becton，DickinsonandCompany制造)，且向每个孔加入1mL的Retronectin溶液。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例7-(2)同样的方法，进行基因转移(培养的第0天)，不过在用聚凝胺进行基因转移时使用了细胞培养用的12孔板(Corning制造)。向每个孔加入1mL的病毒溶液，该病毒溶液是用10F-DMEM将三种载体等量混合所得的溶液稀释10倍而成。将悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL的成人皮肤成纤维细胞1mL接种在每个孔上。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例13-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移，不过在用聚凝胺进行基因转移时，在培养的第2天除去上清液，加入1mL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第6天，按照与实施例5-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养。

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行在饲养细胞上的培养直至培养的第25天。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第25天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)的数目进行计数。其结果在表21中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表21]

在培养的第25天iPS细胞集落数

条件	IPS细胞集落数
		条件A	81.0
条件B	22.0
		条件C	6.5
条件D	3.0

条件E	114.0
		条件F	22.0
条件G	44.5
		条件H	12.5

如表21所示，在所有的条件下都确认到多能干细胞的形成，且在任何供体衍生的细胞中，用Retronectin进行基因转移与用聚凝胺进行基因转移相比，多能干细胞的诱导效率明显更高。

实施例14.导入的基因的研究

对于用反转录病毒载体进行的基因转移，通过改变导入的基因的组合，使用Retronectin进行多能干细胞诱导，然后进行比较。设定的组合在表22中示出。

[表22]

反转录病毒载体的组合

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例13-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法，进行基因转移。向每个孔加入1mL的病毒溶液，该病毒溶液是按表22的组合将等量的各个溶液混合，然后用10F-DMEM稀释100倍而成。在每个孔上各接种1mL悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL的成人皮肤成纤维细胞。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例14-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

(5)培养

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第25天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表23中示出。另外，表中的数字表示N＝4的平均值。

[表23]

在培养的第25天iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		条件A	28.3
条件B	2.0
		条件C	82.5

条件D	41.8
		条件E	84.3

如表23所示，即使按各种基因的组合，通过使用Retronectin也确认到多能干细胞的形成。

实施例15.多能干细胞克隆的建立

挑取用Retronectin进行基因转移而诱导的多能干细胞(iPS细胞)集落，建立用于各种测定的iPS细胞克隆。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例2-(2)同样的方法，进行基因转移。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例2-(3)同样的方法，进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例2-(4)同样的方法，进行导入了基因的细胞在饲养细胞上的接种，不过导入了基因的细胞各接种4×10⁵个细胞。

(5)培养

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从平皿除去上清液，然后在对照条件(ES细胞培养基)或蛋白质饥饿处理条件(在用0F-DMEM培养2天后，更换上ES细胞培养基)下进行培养。更换培养基后，在各条件下继续培养直至培养的第29天，在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)选择

在立体显微镜(SZ61；Olympus公司制造)下，挑取在培养的第29天在各条件下在10cm平皿上形成的多能干细胞(iPS细胞)集落。将挑取的iPS细胞集落转移到事先加入了100μL的ES细胞培养基的96孔培养板各孔中，用移液管吸上吸下数次，将各集落传代培养到已接种了5.4×10⁴个饲养细胞/孔的24孔培养板上。传代培养后，每日进行培养基更换，对变得足够大的iPS细胞集落任意进行传代培养，从而建立了iPS细胞克隆。另外，建立了克隆#1、#4、#5、#6和#10，作为进行蛋白质饥饿处理而获得的iPS细胞克隆，而在对照条件下建立了克隆#3作为iPS细胞克隆。

实施例16.***到iPS细胞克隆的基因组中的原病毒的拷贝数的定量

进行了***到iPS细胞克隆的基因组中的原病毒的拷贝数的定量。作为对照，同样分析了在日本京都大学建立的iPS细胞克隆“253G1”[Nakagawa，M.等人，Nat.Biotechnol.]，第26卷第1期第11-106页，2008]。

(1)基因组提取

用ES细胞剥离溶液将实施例15中建立的每个融合的iPS细胞克隆(克隆#1、#3、#4、#5、#6或#10)或者253G1各自回收到6孔板的一个孔中，用PUREGENEDNA纯化试剂盒(QIAGEN制造)进行基因组提取。

(2)实时PCR

用CycleavePCRCoreKit试剂盒(TAKARABIOINC.制造)通过实时PCR计算***到iPS细胞克隆的基因组中的原病毒的拷贝数。使用人原病毒拷贝数检测引物组(实时PCR用)(TAKARABIOINC.制造)附带的引物组和DNA对照模板，分别计算实施例16-(1)中提取的每200ng基因组DNA的原病毒拷贝数和人IFNγ拷贝数，按(反转录病毒拷贝数)/(人IFNγ拷贝数)×2来计算每个细胞***的反转录病毒拷贝数。另外，所有定量均按N＝2进行，并计算平均值。

结果得出，作为对照的253G1为约19.3个拷贝，克隆#1为约6.4个拷贝，克隆#3为约10.2个拷贝，克隆#4为约7.1个拷贝，克隆#5为约11.4个拷贝，克隆#6为约5.7个拷贝，克隆#10为约13.3个拷贝。由此，用基于pDON-5载体制备的反转录病毒实施用Retronectin进行的基因转移，可证实在所有制备的iPS细胞克隆中，尽管反转录病毒***拷贝数远小于用聚凝胺导入基因而制备的253G1，但通过上述方法可更有效地制备iPS细胞。

实施例17.ES细胞标志基因的表达的确证

通过RT-PCR确证了所建立的每个iPS细胞克隆是否表达ES细胞的标志基因。另外，对克隆#1、克隆#3的iPS细胞克隆和作为对照的253G1的iPS细胞克隆进行了确证。

(1)RNA提取

每种iPS细胞集落回收了数十个，并通过FastPure(注册商标)RNA试剂盒(TAKARABIOINC.制造)回收总RNA。所用方法遵循试剂盒随附的关于从培养的细胞提取总RNA的方案。

(2)cDNA的合成

采用实施例17-(1)中提取的总RNA，进行了cDNA的合成。使用PrimeScript(注册商标)RTReagentKit试剂盒(PerfectRealTime)(TAKARABIOINC.制造)，按照SYBRGreenAssay的情况中的方案制备预混合物，并加入200ng的总RNA。使用TaKaRaPCRThermalCyclerDiceGradient(TAKARABIOINC.制造)，于37℃反应15分钟，于85℃反应5秒，以获得cDNA。

(3)PCR反应

首先，用DNA合成仪合成了具有序列表SEQIDNo.：7-10中所述的核苷酸序列的合成引物和具有参考文献[Takahashi，K等人，Cell，第131卷第861-872页，2007]中所述的核苷酸序列的合成引物，并通过常规方法进行纯化。

在实施例17-(2)所获得的cDNA当中，使用总RNA量中的20ng作为模板以进行PCR。加入5μL的5×PrimeSTARGXL缓冲液(TAKARABIOINC.制造)、2μL的dNTP混合物(各2.5mM)(TAKARABIOINC.制造)、5pmol的正向引物、5pmol的反向引物和0.5μL的PrimeSTAR(注册商标)GXLDNA聚合酶(1.25U/μL)(TAKARABIOINC制造)，并加入无菌蒸馏水至25μL的总量。将反应溶液设定在TaKaRaPCRThermalCyclerDiceGradient，进行30个循环的反应，98℃10秒，60℃15秒和68℃15秒为一个循环。

(4)通过琼脂糖凝胶电泳确证

反应完成后，使5μL的反应溶液进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，对扩增的DNA片段进行确证。结果在图1中示出。由图1可见，在原始成人皮肤成纤维细胞(NHDF-Ad)中没有得到确证的每种ES细胞标志，在克隆#1、克隆#3和253G1中得到确证。即确证，所建立的iPS细胞克隆表现出与ES细胞相同的基因表达模式。

实施例18.iPS细胞克隆的多能性的体内评估

为了确证所建立的iPS细胞克隆和人ES细胞一样具有多能性，将克隆#1移植到SCID小鼠的睾丸中，对畸胎瘤形成能力进行了评估。

(1)iPS细胞悬浮液的制备

用ES细胞剥离溶液(20％敲除血清替代品、1mMCaCl₂、0.1mg/mL胶原酶IV、0.25％胰蛋白酶)回收所培养的iPS细胞克隆(克隆#1)，用其中一部分进行细胞计数。将iPS细胞悬浮液离心后，除去上清液，用HANKS’BALANCEDSALTSOLUTION(HANKS氏平衡盐溶液)(Sigma制造)将细胞调整成5×10⁶个细胞/mL。

(2)将iPS细胞悬浮液给予到SCID小鼠的睾丸

将实施例18-(1)中制备的iPS细胞悬浮液以2.5×10⁵个细胞/50μL给予到SCID小鼠的睾丸。

(3)所形成的畸胎瘤的冷冻切片的制备

在给予iPS细胞后，在第10周进行验尸，从SCID小鼠取出畸胎瘤，包埋在TISSUEMOUNT(ChibaMedical制造)中以制备冻结块。将冻结块保藏在-80℃备用。用恒冷箱制作冷冻切片，通过标准的方法进行HE染色，并进行镜检。其结果在图2中示出。由于如图2所示，可观察到衍自三胚层的组织，因此通过用Retronectin进行基因转移而建立的iPS细胞克隆经评估具有多能性。

实施例19.每种基因转移方法的基因转移效率和多能干细胞(iPS细胞)集落数目的比较

作为指示其中***了每个反转录病毒载体以及编码核程序重编因子(iPS细胞诱导因子)基因的细胞的存在率的指标，进行了AcGFP1基因的基因转移，并比较了用Retronectin进行的基因转移方法(Retronectin方法)和用聚凝胺进行的基因转移方法(聚凝胺方法)的多能干细胞(iPS细胞)诱导效率和AcGFP1阳性细胞率。另外，对于一部分条件，对***到基因组中的反转录病毒载体的拷贝数进行了定量，并进行了拷贝数和多能干细胞(iPS细胞)诱导效率的比较。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法，进行了Retronectin在培养板上的固定，不过对于用Retronectin包被的板，使用未经处理的12孔板，并向每个孔加入1mL的Retronectin溶液(25μg/mL)。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

将制备实施例2和制备实施例3中制备的病毒溶液按表24的组合以等量进行混合，对于条件A，制备了其中病毒溶液用10F-DMEM稀释10倍和100倍的溶液；对于条件B，制备了其中病毒溶液稀释10倍的溶液，将这些溶液用于基因转移。按照与实施例7-(2)同样的方法进行基因转移，不过在Retronectin方法中将1mL的PBS用于板的PBS洗涤，用于通过Retronectin方法和聚凝胺方法进行感染的细胞数目为4×10⁴个细胞/孔，反转录病毒载体溶液为1mL/孔。

[表24]

反转录病毒载体的组合

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例19-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)在饲养细胞上的接种和AcGFP1阳性细胞率的测量

按照与实施例10-(4)同样的方法，进行导入了基因的细胞在饲养细胞上的接种，不过使用没有接种在饲养细胞上的剩余细胞以流式细胞仪测量AcGFP1阳性细胞率。

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行在饲养细胞上的培养，不过在条件A下在培养的第11天从一部分的孔回收细胞，进行基因组提取，并定量反转录病毒载体的***数目。

(6)多能干细胞(iPS细胞)集落的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。

实施例19-(4)、(5)和(6)的结果在表25中示出。

[表25]

各条件下的AcGFP1阳性率、***拷贝数和iPS细胞集落数目的结果

如表25所示，即使在AcGFP1阳性率和***拷贝数差异很小的条件下，也确认到iPS细胞集落的差异。具体而言，在条件A的反转录病毒10倍稀释的条件下，Retronectin方法和聚凝胺方法之间AcGFP阳性率没有差异，尽管Retronectin方法在***拷贝数上仅多出0.9个拷贝，但确认到在iPS细胞集落数目上差异在3倍或以上。另外，当将条件A的Retronectin方法100倍稀释和聚凝胺方法10倍稀释进行比较时，Retronectin方法的***拷贝数高约2倍，但iPS细胞集落数目则要高得多，为9倍。虽然对于条件B也是两种方法在AcGFP1阳性率上没有差异，但Retronectin方法的iPS细胞集落数目高2倍。据此证实，在Retronectin方法中基因转移效率得到提高，但显然仅由此解释多能干细胞诱导效率高是有困难的，首次揭示出Retronectin除了具有增强基因转移效率的功能以外，还具有增强多能干细胞诱导效率的功能。

实施例20.反转录病毒载体制备批次之间的差异的研究

使用通过五次系列制备操作获得的具有不同生产批次的五种反转录病毒载体(下文分别表示为病毒1-5)，实施了用Retronectin进行的基因转移，并比较了多能干细胞诱导效率。病毒1在制备和回收后立即进行实验，而病毒2-5在制备后进行冷冻和保藏，将解冻的病毒进行实验。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过向每个孔加入2mL的病毒溶液，该病毒溶液是用10F-DMEM将三种载体等量混合所得的溶液稀释10倍而成。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例20-(2)同样的方法，在培养的第1天进行基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

(5)培养

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第25天，对多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表26中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表26]

在培养的第25天iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		病毒1(未冷冻)	34.5
病毒2(冷冻和解冻)	32.5
		病毒3(冷冻和解冻)	38.0
病毒4(冷冻和解冻)	33.5
		病毒5(冷冻和解冻)	33.5

如表26所示，在多能干细胞诱导时，可见由病毒载体的生产批次造成的影响极小。另外还可见，病毒载体在冷冻保藏后解冻再使用时，集落数目与未冷冻时相当。这揭示出，当用Retronectin来诱导多能干细胞时，尽管病毒溶液的滴度有一定变动，且无论有无进行冷冻与解冻，都有可能稳定地诱导多能干细胞。

实施例21.通过静置感染法对基因转移中的Retronectin和天然纤连蛋白进行比较

使用包被Retronectin的板和包被天然纤连蛋白的板进行基因转移，并进行多能干细胞诱导。另外，使用了以下实施例21-(1)中制作的板、事先包被Retronectin的35mm平皿市售产品(T110A，TAKARABIOINC.制造)和事先包被天然纤连蛋白的35mm平皿市售产品(354457，FALCON制造)作为板。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法进行Retronectin在培养板上的固定，不过使用未经处理的35mm平皿(IWAKICO.，LTD制造)作为培养容器。另外，市售的事先包被有Retronectin和天然纤连蛋白的平皿(下文也称为Retronectin平皿和纤连蛋白平皿)不进行这些固定操作。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

将制备实施例2中制备的病毒溶液按表27的组合以等量进行混合，并用10F-DMEM稀释10倍，向实施例21-(1)中制备的固定有Retronectin的培养平皿或者事先包被Retronectin或天然纤连蛋白的平皿各加入2mL，让它们在CO₂培养箱中于32℃静置4-6小时。

[表27]

反转录病毒载体的组合

然后，从每个平皿除去上清液，用PBS洗涤平皿一次，在每个平皿上各接种2mL悬浮于10F-DMEM中成5×10⁴个细胞/mL的成人皮肤成纤维细胞，在CO₂培养箱于37℃开始培养(培养的第0天)。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例21-(2)同样的方法，在培养的第1天进行基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行在饲养细胞上的培养至培养的第27天。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第27天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。结果在表28中示出。另外，表中的数字表示N＝3的平均值。

[表28]

在培养的第27天iPS细胞集落的数目

如表28所示，在其中病毒吸附到Retronectin上时不进行离心操作的静置感染法中，也有可能用Retronectin诱导iPS细胞。相反，对于天然纤连蛋白，不管什么反转录病毒组合，根本不能获得多能干细胞集落。这揭示出在iPS细胞诱导方面Retronectin优于天然纤连蛋白。

实施例22.病毒混合比例的研究

为了提高多能干细胞诱导效率，对最大病毒载体混合比例进行了研究。另外，使用了OCT4、SOX2和KLF4这三种基因用于诱导。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例11-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例11-(2)同样的方法进行基因转移，不过如表29所示，改变了病毒混合比例。另外，基因转移方法为Retronectin方法，且将病毒溶液稀释100倍用于感染。

[表29]

反转录病毒载体混合比例

条件	DON5-am-OCT4-IR-SOX2∶DON5-am-KLF4
		条件A	1∶1
条件B	1∶2
		条件C	2∶1

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例22-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例11-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养。

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行在饲养细胞上的培养。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第27天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)的数目进行计数。结果在表30中示出。另外，表中的数字表示N＝3的平均值。

[表30]

各条件下iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		条件A	10.0
条件B	12.0
		条件C	19.3

如表30所示，使用将DON5-am-OCT4-IR-SOX2和DON5-am-KLF4以2∶1的比例混合而获得的病毒溶液，iPS细胞诱导效率大大提高，从而揭示出可通过优化病毒混合比例来进一步提高iPS细胞诱导效率。

实施例23.反转录病毒载体向小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的导入效率

在Retronectin方法和聚凝胺方法之间，比较了使用反转录病毒载体将基因导入MEF中的效率。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法进行Retronectin在培养板上的固定，作为其上包被有Retronectin的板，使用未经处理的12孔板(Becton，DickinsonandCompany制造)，并向每个孔加入1mL的Retronectin溶液(25μg/mL)。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移

按照与实施例19-(2)和(3)同样的方法进行基因转移。反转录病毒载体按照与制备实施例3同样的方法进行制备，并且使用pE-Eco质粒(TAKARABIOINC.制造)代替pE-Ampho质粒制备的DON-eco-AcGFP1。每个所制备的反转录病毒载体为原液，通过用10F-DMEM稀释原液10倍至100000倍获得的溶液用于进行感染。另外，使用MEF(Millipore制造)作为靶细胞。

(3)培养基更换

在基因转移后的第2天，更换上10F-DMEM培养基。

(4)基因转移效率的测量

在基因转移操作后四天回收细胞，用流式细胞仪测量AcGFP1阳性细胞率。其结果在表31中示出。

[表31]

感染效率的比较

如表31所示，通过Retronectin方法的基因转移效率比聚凝胺方法的基因转移效率明显要高。这证明，由Retronectin方法进行的基因转移方法对小鼠成纤维细胞如同对人成纤维细胞一样有效，且提示了可促进iPS细胞的有效诱导。

实施例24.用人iPS细胞诱导因子由MEF进行的iPS细胞诱导

iPS细胞诱导因子的氨基酸序列在人和小鼠之间非常相似，故推测在功能上是高度保守的。于是，研究了使用人iPS细胞诱导因子是否可由MEF诱导小鼠iPS细胞

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移

按照与实施例23-(2)相同的Retronectin方法进行基因转移。用于诱导的反转录病毒载体的组合在表32中示出。另外，反转录病毒载体按照与制备实施例2同样的方法制备，且使用pE-Eco质粒代替pE-Ampho质粒制备的反转录病毒载体。

[表32]

反转录病毒载体的组合

(3)培养基更换

在基因转移的第2天和第3天，更换上10F-DMEM培养基。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例10-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养，不过传代培养日是自基因转移起的第4天，且设定了各接种2×10⁵、5×10⁴或1×10⁴个细胞的组。

(5)培养

在培养的第5天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，加入2mL的制备实施例4所制备的小鼠ES细胞培养基。继续进行培养直至培养的第19天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第19天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表33中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表33]

如表33所示，揭示出通过使用携带人iPS细胞诱导因子的病毒载体，也可从MEF诱导小鼠iPS细胞。由此可见，使用Retronectin的iPS细胞诱导***不仅可用于人，而且可用于小鼠。

实施例25.通过EB(胚状体)的分化诱导确证iPS细胞的多能性

iPS细胞的定义之一是多能性，且多能性可通过EB的分化诱导进行体外确证。于是，出于评估所制备的iPS细胞的多能性的目的，进行了实验。

(1)iPS细胞的悬浮细胞培养

按照与实施例15-(6)同样的方法并使用饲养细胞和ES细胞培养基，用ES细胞剥离溶液回收了已在6孔培养板中培养的iPS细胞克隆(克隆#3)，悬浮于EB形成培养基(80％DMEM/F12、20％敲除血清替代品、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA混合物)，并在未经处理的6孔培养板中进行悬浮培养。另外，隔天进行培养基更换。

(2)粘附到明胶包被板上

在培养的第8天，将全部EB接种在前一天已用明胶包被的24孔板上，使EB粘附于板，继续培养8天。另外，隔天进行培养基更换。

(3)免疫染色

在培养的第16天，将细胞于室温用4％多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤两次，于室温与1％BSA/PBS反应1小时进行封闭。之后，加入用1％BSA/PBS将小鼠抗βIII-微管蛋白抗体(Millipore制造)或小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(DAKO制造)稀释50倍获得的溶液，然后于4℃温育过夜。第2天，用PBS洗涤三次后，通过于室温与1％BSA/PBS反应1小时进行封闭。加入用1％BSA/PBS将山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体的AlexaFluor594F(ab’)₂片段(Invitrogen制造)稀释1000倍获得的溶液，然后于4℃温育过夜。第2天，用PBS洗涤三次后，用荧光显微镜进行观察。

其结果在图3中示出。由图3可见，通过本发明方法制备的iPS细胞可分化成βIII-微管蛋白阳性细胞(其为外胚层细胞)和分化成α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞(其为中胚层细胞)，从而证明具有多能性。

实施例26.从基因转移后直到传代到饲养细胞中的培养基的研究

一般认为小牛血清所具有的分化诱导因子量小于FBS(胎牛血清)的分化诱导因子量，且认为小牛血清可能更适合于iPS细胞诱导。于是，研究了从基因转移后直到向饲养细胞中的传代培养为止所用的培养基中的血清成分对iPS细胞诱导效率的影响。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例11-(2)同样的方法，用已稀释了100倍的溶液通过Retronectin方法进行基因转移。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例11-(3)同样的方法，进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

按照与实施例11-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养，不过将从第二次基因转移的第2天直到接种在饲养细胞上为止的培养基中的血清成分变化如表34所示。

[表34]

条件

血清种类(浓度)

条件A	FBS(10％)
		条件B	小牛血清(2％)
条件C	小牛血清(5％)
		条件D	小牛血清(10％)
条件E	小牛血清(20％)

(5)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行在饲养细胞上的培养。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第27天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)的数目进行计数。其结果在表35中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表35]

条件	IPS细胞集落的数目
		条件A	61.0
条件B	48.0
		条件C	63.5
条件D	72.5
		条件E	81.0

如表35所示，iPS细胞诱导效率的增加依赖于小牛血清的浓度，与对照组的条件A的诱导效率相比高出5％、10％和20％。由此证实，小牛血清在iPS细胞诱导时具有扩大(extending)细胞的效果。

实施例27.细胞周期停滞剂的研究-2

对于作为细胞周期停滞剂的PurvalanolA，在实施例3中确证了其促进多能干细胞诱导的作用，这里研究了其物质处理期的延长和其与Y-27632[(R)(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐](其为抑制细胞死亡的物质之一)的组合使用。

(1)Retronectin在培养板上的固定

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例3-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过向每个孔加入2mL的病毒溶液，该病毒溶液是用10F-DMEM将三种载体等量混合所得的溶液稀释10倍而成。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例27-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

(5)细胞周期停滞剂处理和培养

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，更换上ES细胞培养基，如表36所示进行物质处理。物质处理期结束后，更换上ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第26天。在此期间每隔1-2天更换培养基。对于进行物质处理4天-6天的条件，在物质处理期间中也每两天更换培养基，且每次都是以相同的浓度加入所述物质。

[表36]

物质处理条件

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第26天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。结果在表37中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表37]

在培养的第26天iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		对照	15.5
条件A	26.0
		条件B	25.5
条件C	18.5
		条件D	24.5
条件E	36.0
		条件F	24.5

如表37所示，揭示出通过将PurvalanolA物质处理期延长到4天，多能干细胞的诱导效率得到进一步提高。另外揭示出，当PurvalanolA物质处理期延长时，通过加入作为抑制细胞死亡的物质之一的Y27632，可稳定地获得多能干细胞集落。

实施例28.细胞周期停滞剂的研究-3

在多能干细胞的诱导培养时，进行了NU610(其为细胞周期停滞剂之一，ALEXISBIOCHEMICALS制造)的物质处理，研究了对诱导效率的影响。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法进行Retronectin在培养板上的固定，不过使用了未经处理的12孔培养板(Becton，DickinsonandCompany制造)，且向每个孔加入1mL的Retronectin溶液。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法进行基因转移(培养的第0天)，不过向每个孔加入1mL的病毒溶液，该病毒溶液是用10F-DMEM将三种载体等量混合所得的溶液稀释100倍而成。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例28-(2)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(4)接种在饲养细胞上

(5)细胞周期停滞处理和培养

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，更换上ES细胞培养基，并设定分别加入NU6140至0.1μM和1μM终浓度组。另外，对照组中不加入所述物质。培养2天后，更换上ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞的计数

在培养的第28天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表38中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表38]

在培养的第28天iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		对照	21.5
NU6140 0.1μM	22.5
		NU6140 1μM	28.0

如表38所示，NU6140物质处理组与对照组(未处理)相比，多能干细胞的数目变得更多。即再次确证，通过在诱导多能干细胞的过程中使细胞周期停滞，诱导效率得到提高。

实施例29.DHCP的研究

在诱导培养多能干细胞时，用化合物DHCP和GM进行了物质处理，其中DHCP是通过加热衍自动物和植物的糖醛酸化合物而生成(国际公开号98/13328小册子)，GM是谷胱甘肽加到DHCP而生成(国际公开号98/39291小册子)，研究了对诱导效率的影响。

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例28-(1)同样的方法，进行Retronectin在培养板上的固定。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例4-(2)同样的方法，进行基因转移(培养的第0天)，不过向每个孔加入1mL的病毒溶液，该病毒溶液是用10F-DMEM将三种载体等量混合所得的溶液稀释10倍而成。

(3)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

(4)接种在饲养细胞上

(5)物质处理和培养

在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，从6孔培养板除去上清液，更换上ES细胞培养基，并设定分别加入DHCP和GM至10μM终浓度组。另外，对照组中不加入物质。培养2天后，更换上ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第28天。在此期间每隔1-2天更换培养基。

(6)多能干细胞集落的计数

在培养的第26天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表39中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表39]

培养的第26天iPS细胞集落的数目

条件	IPS细胞集落的数目
		对照	14.0
DHCP 10μM	23.5
		GM 10μM	18.5

如表39所示，DHCP和GM物质处理组与对照组(未处理)相比，多能干细胞集落的数目变得更多。即揭示出，DHCP和GM(为DHCP的衍生物)具有促进多能干细胞的作用。

实施例30.通过静置感染法对Retronectin和天然纤连蛋白的基因转移进行比较-2

如在实施例21中，用包被Retronectin的板和包被天然纤连蛋白的板进行基因转移，并进行多能干细胞诱导。同时，实施用聚凝胺进行的基因转移，还研究了病毒溶液的稀释倍率。另外，使用了事先包被Retronectin的35mm平皿市售产品(T110A，TAKARABIOINC.制造)和事先包被纤连蛋白的35mm平皿市售产品(354457，FALCON制造)作为板。

(1)用反转录病毒载体进行基因转移，第一次

按照与实施例21-(2)同样的方法，用包被Retronectin的平皿和包被天然纤连蛋白的平皿进行基因转移。用聚凝胺进行的基因转移按以下方法实施。在前一天，在35mm细胞培养平皿(IWAKICO.，LTD.制造)上接种悬浮于10F-DMEM至5×10⁴个细胞/mL的人皮肤成纤维细胞2mL，并培养1天。在制备了其中已加入聚凝胺至4μg/mL的终浓度的反转录病毒载体混合溶液后，从已培养细胞的平皿除去上清液，加入此反转录病毒载体混合溶液，在CO₂培养箱于37℃开始培养(培养的第0天)。在任何方法中，病毒溶液都是按与实施例21-(2)相同的组合以等量进行混合，并设定出其中混合溶液原样使用的组和其中病毒混合溶液用10F-DMEM稀释10倍或100倍的组。

(2)用反转录病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例30-(1)同样的方法，在培养的第1天进行第二次基因转移。

(3)接种在饲养细胞上

(4)培养

按照与实施例10-(5)同样的方法，进行培养直至培养的第25天。

(5)多能干细胞的计数

在培养的第25天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表40中示出。另外，表中的数字表示N＝2的平均值。

[表40]

培养的第25天iPS细胞集落的数目

如表40所示，使用包被Retronectin的平皿(在表中表示为Retronectin平皿)通过静置感染法进行基因转移，相比于用聚凝胺进行的基因转移，多能干细胞诱导效率明显更高。在通过包被Retronectin的平皿进行基因转移时，即使当病毒溶液经稀释来使用时，多能干细胞也可稳定地诱导，而在用包被天然纤连蛋白的平皿(在表中表示为纤连蛋白平皿)进行基因转移时，根本没有形成多能干细胞集落。这再次确证了在多能干细胞诱导方面Retronectin优于天然纤连蛋白。

制备实施例5.慢病毒载体的制备

(1)向pLenti6.3质粒载体中的转移

用限制性内切核酸酶NotI消化制备实施例2-(1)所制备的pDON-5-KLF4，用DNA平端化试剂盒(TAKARABIOINC.制造)作出平端，进一步用限制性内切核酸酶XhoI消化以获得KLF4片段。用限制性内切核酸酶NotI消化制备实施例2-(4)所制备的pDON-5-OCT4-IR-SOX2，用DNA平端化试剂盒作出平端，进一步用BlnI消化以获得OCT4-IR-SOX2片段1。类似地，用限制性内切核酸酶BlnI和XhoI消化pDON-5-OCT4-IR-SOX2以获得OCT4-IR-SOX2片段2。另外，用NotI消化制备实施例2-(4)所制备的pDON-5-LIN28-IR-NANOG，用DNA平端化试剂盒作出平端，进一步用XbaI消化，从而获得LIN28-IR-NANOG片段1。类似地，用限制性内切核酸酶XbaI和XhoI消化pDON-5-LIN28-IR-NANOG，从而获得LIN28-IR-NANOG片段2。用限制性内切核酸酶EcoRV和XhoI消化pLenti-6.3/V5-TOPO质粒(Invitrogen制造)，以获得pLenti6.3片段。将上述各个片段进行1.0％琼脂糖电泳，提取和纯化具有目标大小的DNA片段。将pLenti6.3片段分别与KLF4片段、OCT4-IR-SOX2片段1和2或者LIN28-IR-NANOG片段1和2进行混合，用DNA连接试剂盒<MightyMix>进行连接。

从这样制备的重组质粒中选出其中正确地***了每个基因的重组质粒，分别命名为pLenti6.3-KLF4、pLenti6.3-OCT4-IR-SOX2和pLenti6.3-LIN28-IR-NANOG。

(2)慢病毒载体的产生

如在制备实施例2-(5)中，将G3T-hi细胞接种，并培养24小时。将10μL的TransIT(注册商标)-293(TAKARABIOINC.制造)混合到500μL的OPTI-MEM中，让此混合物于室温静置5分钟，分别加入4μg的ViraPower慢病毒包装混合物(Invitrogen制造)和1μg制备实施例5-(1)所制备的每种重组质粒，混合，然后于室温静置混合物15分钟。将此混合溶液加到G3T-hi细胞，继续进行培养，24小时后，更换上4mL的10F-DMEM培养基。再继续培养24小时后，回收含有病毒的培养基，用0.45μm过滤器过滤，以回收含有慢病毒载体的病毒溶液。从每种重组质粒获得的慢病毒载体的名称在表41中示出。将三种病毒溶液以等量进行混合，用于感染。在1份混合病毒中加入数量占病毒溶液的三分之一的Lenti-XConcentrator(Clonetech制造)进行混合，然后于4℃静置1小时。之后，在1,500×g下离心后，除去上清液，新加入10F-DMEM，制备20倍浓缩的病毒溶液。浓缩前或浓缩后的病毒溶液当制备后不立即使用时先冷冻和保藏于-80℃，病毒溶液要用时通过解冻来使用。

[表41]

慢病毒载体的列表

实施例31.用慢病毒载体诱导多能干细胞

(1)Retronectin在培养板上的固定

按照与实施例1-(1)同样的方法进行Retronectin在培养板上的固定，不过使用未经处理的12孔板作为要用Retronectin包被的板，并向每个孔加入1mL的Retronectin溶液(25μg/mL)。

(2)用慢病毒载体进行基因转移，第一次

将制备实施例5所制备的每种混合病毒溶液500μL加到12孔Retronectin固定培养板或者12孔培养板，再向每个孔加入500μL悬浮于10F-DMEM中成1×10⁵个细胞/mL的成人皮肤成纤维细胞。对于聚凝胺感染条件，加入聚凝胺至8μg/mL的终浓度。将这些板在32℃和1,000×g下离心30分钟，在CO₂培养箱中于37℃开始培养(培养的第0天)。设定的条件在表42中示出。

[表42]

基因转移条件

条件	处理方法
		条件A	用Retronectin进行基因转移，使用未经浓缩的病毒
条件B	用Retronectin进行基因转移，使用20倍浓缩的病毒
		条件C	用聚凝胺进行基因转移，使用未经浓缩的病毒
条件D	用聚凝胺进行基因转移，使用20倍浓缩的病毒

(3)用慢病毒载体进行基因转移，第二次

按照与实施例31-(2)同样的方法在培养的第1天进行第二次基因转移。此外，在培养1天后，除去上清液，加入1mL的10F-DMEM，继续进行培养。

(4)接种在饲养细胞上

在培养的第6天，按照与实施例5-(4)同样的方法，将导入了基因的细胞接种在饲养细胞上，继续进行培养。在培养的第7天(自接种在饲养细胞上培养1天后)，除去上清液，加入2mL的ES细胞培养基，继续进行培养直至培养的第32天。在此期间每2天更换培养基。

(5)多能干细胞集落的计数

在培养的第32天，对各条件下的多能干细胞(iPS细胞)集落的数目进行计数。其结果在表43中示出。另外，对于条件A，仅示出一个孔的结果。

[表43]

条件	孔1	孔2
			条件A	5	-
条件B	3	2
			条件C	0	0
条件D	0	0

如表43所示，只有当感染是用Retronectin进行时，无论是否进行了浓缩，都能获得多能干细胞集落。即揭示出，同样当使用慢病毒载体时，通过用Retronectin进行基因转移，可比用聚凝胺进行基因转移更有效地诱导多能干细胞。

产业适用性

根据本发明，提供了以比常规生产方法更高的频率产生多能干细胞的方法。由于通过本发明获得的细胞群体中所含的多能干细胞可通过已知的方法分化成所需的细胞，所以本发明方法非常适用于制备移植入活的接受体体内的细胞或者用于基础研究。

序列表独立文本

SEQIDNO：1；引物hSOX2-F，用于扩增SOX2基因。

SEQIDNO：2；引物hSOX2-R，用于扩增SOX2基因。

SEQIDNO：3；引物hKLF4-F，用于扩增KLF4基因。

SEQIDNO：4；引物hKLF4-R，用于扩增KLF4基因。

SEQIDNO：5；引物IRES-F-SalI，用于扩增IRES序列。

SEQIDNO：6；引物IRES-R-NotI，用于扩增IRES序列。

SEQIDNO：7；引物OCT4EndoqP-F1，用于扩增内源OCT4基因。

SEQIDNO：8；引物OCT4EndoP-R1，用于扩增内源OCT4基因。

SEQIDNO：9；引物SOX2EndoP-F2，用于扩增内源SOX2基因。

SEQIDNO：10；引物SOX2EndoP-R2，用于扩增内源SOX2基因。

Claims

1.一种用于诱导多能干细胞的方法，所述方法包括在具有肝素-II结合区域的纤连蛋白片段存在下，用携带编码核程序重编因子的基因的反转录病毒载体感染体细胞的步骤，其中所述纤连蛋白片段是CH-296。

2.权利要求1的方法，其中所述体细胞用携带编码选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG和LIN28的核程序重编因子的基因的反转录病毒载体进行感染。