CN109652409A - 一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法。该方法包括如下步骤：先用裂解细菌菌体的试剂、溶菌酶和葡萄球菌酶裂解细菌菌体，并采用玻璃粉进行物理破壁，使金黄色葡萄球菌菌体充***解，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；高速离心分离，取上清液转移至吸附柱中，进行吸附离心，富集质粒DNA；加入漂洗液进行脱盐离心，加入超纯水洗脱离心，得到质粒DNA。本发明的方法同时采用物理和化学方法提高了金黄色葡萄球菌的破壁效率，节约成本，提高了质粒提取过程中质粒的回收率。

Description

一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法。

背景技术

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位。一般包括超螺旋、开环和线性三种结构，以环状构型为主，存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒的长度一般在2-20kbp，分子量一般在106以上。

质粒DNA是基因工程最常见的运载体。有些质粒含有某种抗药基因，有一些质粒携带的基因可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。它可以把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达，且一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成果与否起着关键的作用。

目前，市面上可购买到的质粒提取试剂盒主要都是针对革兰氏阴性菌中质粒的抽提，对于革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌中质粒的抽提并没有专用的试剂盒。但是金黄色葡萄球菌作为重要的病原菌，可引起许多严重的感染，若其中存在抗性质粒则会对动物甚至人类造成巨大危害。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提出一种对金黄色葡萄球菌质粒进行提取的方法，基于已有的质粒提取试剂盒中化学破壁裂解方法，将化学和物理裂解方法相结合，并对整个金黄色葡萄球质粒提取流程进行优化，达到基于现在市面上已有的质粒提取试剂盒能成功将金黄色葡萄球菌中的质粒抽提出来，用于进一步的研究。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

本发明提供的一种金黄色葡萄球菌的质粒提取方法，包括如下步骤：

（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液（BHI）/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；

（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至100-150mL脑心浸出液（BHI）/抗生素培养基中，接种量为1-3mL，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；

（3）将60mL-100mL步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；

（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；

（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；

（6）将500-520微升步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；

（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，得到混合液；

（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，然后室温静置10-15分钟，其间每隔2-3分钟颠倒混匀5-10次得到含蛋白酶K的混合液；

（9）将420-450微升快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10-15次，得到悬浊液；

（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；

（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；

（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置3-5分钟，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（14）重复步骤（13）；

（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；

（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的容积为1.5mL离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在容积为1.5mL的离心管中得到洗脱液，洗脱液中含有所述目的质粒；

（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在容积为1.5mL的离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；

（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液（含高纯度目的质粒DNA的洗脱液）；

（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液（含高纯度质粒DNA的洗脱液）保存于冰箱中冷藏保存。

进一步地，步骤（1）中所述目的质粒为野生型质粒，所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；所述摇床培养的温度为37℃，培养的时间为10-12小时。

进一步地，步骤（1）中所述目的质粒为野生型质粒，所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；步骤（1）中所述摇床培养的温度为37℃，摇床培养的时间为10-12小时；步骤（2）中所述初级菌液的用量为1-3mL，即接种量为1-3mL；步骤（2）中所述脑心浸出液/抗生素培养基的用量为100-150mL；步骤（2）中所述摇床培养的温度为37℃，培养时间为12-16小时。

进一步地，步骤（3）中所述次级菌液的体积为60mL-100mL；步骤（3）中所述常温离心分离的速率为6000-8000转/分钟，离心分离的时间为10-15分钟。

进一步地，步骤（4）中所述溶菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加5-8mg；所述溶葡萄球菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加1-3mg。

进一步地，步骤（5）中所述解金黄色葡萄球菌的混合液的加入量为3-5mL；步骤（5）中所述恒温浴处理的温度为37摄氏度；恒温浴处理的时间为20-30分钟；

进一步地，步骤（6）中所述重悬液的用量为500-520微升；步骤（6）中所述玻璃粉的粒径为0.1-0.6mm，所述玻璃粉使用前需高温灭菌，所述玻璃粉的加入量为180-200mg；步骤（6）中所述涡旋混匀的涡旋时间为8-10分钟，涡旋混匀的涡旋速率为2600-2800转/分钟；步骤（7）中所述碱裂解液的加入量为500-520微升。

进一步地，步骤（8）中所述蛋白酶K为一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶；蛋白酶K的浓度为20-25mg/mL，蛋白酶K的加入量为10-12微升。

进一步地，步骤（9）中所述快速沉淀缓冲液的加入量为420-450微升；步骤（10）中所述常温离心分离的速率为12000-13000转/分钟，常温离心分离的时间为10-15分钟；步骤（11）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。

进一步地，步骤（11）所述吸附柱与收集管是一对一的数量关系，本发明提供的提取方法优选6个吸附柱与6个收集管。

进一步地，步骤（12）中所述漂洗液1的加入量为600-630微升；步骤（12）中所述常温静置的时间为3-5分钟；步骤（12）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒；步骤（13）中所述漂洗液2的加入量为620-650微升；步骤（13）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。

进一步地，步骤（15）中所述常温离心的离心转速为12000-13000转/分钟，离心的时间为3-5分钟；步骤（16）中所述洗脱缓冲液或者灭菌水的加入量为60-100微升；步骤（16）与步骤（17）所述静置的时间为1-3分钟；步骤（16）与步骤（17）所述常温离心处理的速率为12000-13000转/分钟，离心的时间为1-2分钟；步骤（19）中所述冷藏保存的温度优选为20℃。

进一步地，步骤（4）中所述裂解细菌菌体的试剂、步骤（7）中所述碱裂解液、步骤（9）中所述快速沉淀缓冲液、步骤（11）中所述吸附柱、步骤（12）中所述漂洗液1、步骤（13）中所述漂洗液2以及步骤（16）中所述洗脱缓冲液均来源于质粒提取试剂盒。

进一步地，本发明所述裂解细菌菌体采用了化学试剂裂解和玻璃粉物理裂解相结合的办法，得到破壁完全的金黄色葡萄球菌裂解液。

进一步地，所述碱裂解后需加入蛋白酶K，使膜蛋白降解，DNA充分游离。

进一步地，本发明提供的方法利用洗脱缓冲液或灭菌水反复洗脱多个吸附柱，获得高纯度的质粒DNA。

本发明的提取方法提取的质粒含抗-抗生素基因，这是本发明对现有提取方法的优化，一方面所述抗-抗生素基因可以作为目的质粒的标记，另一方面所述抗-抗生素基因可以帮助我们筛分出金黄色葡萄球菌。我们知道所提取的质粒大小，使得我们在后期检测中能快速检测出目的质粒，节省实验时间，在短时间就可以验证本发明提供的提取方法的成效；其次，抗-抗生素基因可以帮助金黄色葡萄球菌在含抗生素的培养基中存活下来，而不含抗-抗生素基因的杂菌无法存活，这样避免了本发明实验过程中出现杂菌污染导致进度缓慢或结果受到干扰的情况，提高了本发明提供的提取方法的准确性。因此，所述抗-抗生素基因只是本发明提供的提取方法中的一个工具，只要确保提取对象是金黄色葡萄球菌，本发明提供的提取方法也适用于提取不含抗-抗生素基因质粒。

本发明提供的提取方法在考虑到吸附柱承载能力的基础上，为尽可能多的收集质粒DNA、提高质粒提取浓度，因此选用了6个吸附柱同时工作，这是本发明对现有技术的优化。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明提出的一种对金黄色葡萄球菌质粒进行提取的方法，采用了化学试剂裂解和玻璃粉物理裂解相结合的办法，使金黄色葡萄球菌细胞壁可以裂解得更完全，减少了溶菌酶和溶葡菌酶的用量，从而节约了实验成本，并且可以大幅度地缩短实验时间。因此使金黄色葡萄球菌质粒的核糖核酸的提取过程具有高效、快速、简洁的特点。

（2）本发明提出的在提取金黄色葡萄球菌质粒过程中加入蛋白酶K，使膜蛋白降解，DNA充分游离，提高产物稳定性；所提质粒核糖核酸可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

（3）本发明提供的提取方法在考虑到吸附柱承载能力的基础上，为尽可能多的收集质粒DNA、提高质粒提取浓度，可以优选6个吸附柱同时工作，提高了提取效率，减少了提取时间，是本发明对现有技术的进一步优化。

附图说明

图1是本发明实施例1从80毫升金黄色葡萄球菌培养液中提取得到质粒的电泳检测图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。

实施例1

采用Magen公司生产的质粒DNA微量提取试剂盒（HiPure Plasmid Micro kit C），货号：P1001-02C，具体组成：RNase A、Buffer P1 Plus、Buffer P2 Plus、Buffer P3、BufferPW1、Buffer PW2、Buffer TE、HiPure DNA Mini Column Ⅱ、2 ml Collection Tube。

（1）将含目的质粒（所述目的质粒含抗-卡那霉素基因）的金黄色葡萄球菌接种于5ml 含有15μg/ml 卡那霉素（KAN）的BHI培养基中，37℃摇床培养10小时小量扩增菌液；

（2）在250ml培养瓶中加入100ml含15μg/ml KAN的BHI培养液中，接种2ml步骤（1）的初级菌液至培养瓶中，37℃摇床培养12小时扩增菌液；

（3）收集80ml步骤（2）的金黄色葡萄球菌菌液进行常温离心分离，离心分离的转速为6000转/分钟，离心分离的时间为10分钟，倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸吸尽残液；

（4）取3ml裂解细菌菌体的试剂Buffer P1 Plus/RNase A于含有溶菌酶和葡萄球菌酶的5ml离心管中，使溶菌酶的浓度为5mg/ml，葡萄球菌酶的浓度为1mg/ml（溶菌酶和溶葡萄球菌酶均购买于Keyinbio公司，货号分别为12650-88-3和9011-93-2；）。

（5）取3ml步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬，离心管中无沉淀，37℃温浴20分钟；

（6）分别转移500微升步骤（5）重悬液至新的2mL离心管中，分别加入200mg玻璃粉（粒径为0.1-0.6mm，使用前已高温灭菌），2600转/分钟，涡旋混匀8分钟，旋涡混合器输入功率为1.2W，输出功率为0.8W，使金黄色葡萄球菌的细胞壁完全破裂；

（7）在步骤（6）中的每个离心管中加入500微升碱裂解液Buffer P2 Plus，颠倒离心管5次，使步骤（6）中所得到的菌体裂解；

（8）取10微升20mg/ml蛋白酶K(购买于Merck KGaA公司，货号：39450-01-6)至步骤（7）所得的裂解液中，颠倒混匀离心管5次，室温静置10分钟，其间每隔2分钟颠倒混匀6次得到含蛋白酶K的混合液；

（9）取420微升快速沉淀缓冲液Buffer P3至步骤（8）所得的裂解液中，颠倒混匀10次让溶液彻底中和；

（10）将步骤（9）所得悬浊液进行常温离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为10分钟；

（11）将6个吸附柱（实施例1中使用的吸附柱为HiPure DNA Mini Column Ⅱ）置于6个收集管（2 ml Collection Tube）中，分别转移步骤（10）所得的上清液于吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的时间为30秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（12）取600微升漂洗液1 Buffer PW1于步骤（11）的吸附柱中，静置3分钟，常温离心分离，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的时间为30秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（13）取620微升漂洗液2 Buffer PW2于步骤（12）的吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的时间为30秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（14）重复步骤（13）；

（15）常温离心分离步骤（14）所得的吸附柱，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的时间为3分钟，干燥吸附柱去除乙醇；

（16）把步骤（15）中的一个吸附柱套在灭菌的1.5ml的离心管中，取60微升洗脱缓冲液Buffer TE至吸附柱的膜中央，静置1分钟，常温离心洗脱DNA，离心洗脱的转速为12000转/分钟，离心分离的时间为1分钟；

（17）将步骤（16）洗脱的产物转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，操作步骤与步骤（16）相同；

（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到高纯度质粒DNA；

（19）弃去（18）中的吸附柱，把（18）所得的洗脱液保存于-20℃。

（20）检测：将洗脱的质粒DNA产物采用质量百分比浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为TAE 缓冲液（TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成的缓冲液）、电压为1000V的条件下电泳90min，结果见于图1所示，提取金黄色葡萄球菌质粒DNA结果，从左至右的电泳条带依次为：质粒DNA（质粒的英文名称为plasmid）、标记物Marker（购买自博迈德生物技术有限公司，货号：MD106-01）。

实施例2

采用TIANGEN公司生产的质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit），货号：DP103，具体组成：RNase A、Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3、Buffer PD、Buffer PW、Buffer EB、Spin Columns CP3、2 ml Collection Tube。

（1）将含目的质粒（所述质粒含抗-卡那霉素基因）的金黄色葡萄球菌接种于5ml含有15μg/ml 卡那霉素（KAN）的BHI培养基中，37℃摇床培养11小时小量扩增菌液；

（2）在250ml培养瓶中加入100ml含15μg/ml KAN的BHI培养液中，接种1ml步骤（1）的初级菌液至培养瓶中，37℃摇床培养14小时扩增菌液；

（3）收集100ml步骤（2）的金黄色葡萄球菌菌液进行常温离心分离，离心分离的转速为6000转/分钟，离心分离的时间为13分钟，倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸吸尽残液；

（4）取3ml裂解细菌菌体的试剂Buffer P1/RNase A于含有溶菌酶和葡萄球菌酶的5ml离心管中，使溶菌酶的浓度为5mg/ml，葡萄球菌酶的浓度为1mg/ml（溶菌酶和溶葡萄球菌酶均购买于Keyinbio公司，货号分别为12650-88-3和9011-93-2）；

（5）取4ml步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬，离心管中无沉淀，37℃温浴25分钟；

（6）分别转移510微升步骤（5）重悬液至新的2mL离心管中，分别加入200mg玻璃粉（0.1-0.6mm，已高温灭菌），2700转/分钟，涡旋混匀9分钟，旋涡混合器输入功率为1.2W，输出功率为0.8W，使金黄色葡萄球菌的细胞壁完全破裂；

（7）在步骤（6）中的每个离心管中加入510微升碱裂解液Buffer P2，颠倒离心管5-10次，使步骤（6）中所得到的菌体裂解；

（8）取11微升22mg/ml蛋白酶K(购买于Merck KGaA公司，货号：39450-01-6)至步骤（7）所得的裂解液中，颠倒混匀离心管7次，室温静置10分钟，其间每隔2分钟颠倒混匀6次得到含蛋白酶K的混合液；

（9）取420微升快速沉淀缓冲液Buffer P3至步骤（8）所得的裂解液中，颠倒混匀13次让溶液彻底中和；

（10）将步骤（9）所得悬浊液进行常温离心分离，离心分离的转速为12500转/分钟，离心分离的时间为12分钟；

（11）将6个吸附柱（实施例2中使用的吸附柱为Spin Columns CP3）置于6个收集管（2ml Collection Tube）中，分别转移步骤（10）所得的上清液于吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为45秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（12）取620微升漂洗液1 Buffer PD于步骤（11）的吸附柱中，静置4分钟，常温离心分离，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为45秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（13）取640微升漂洗液2 Buffer PW于步骤（12）的吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为40秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（14）重复步骤（13）；

（15）常温离心分离步骤（14）所得的吸附柱，离心分离的转速为12500转/分钟，离心分离的时间为4分钟，干燥吸附柱去除乙醇；

（16）把步骤（15）中的一个吸附柱套在灭菌的1.5ml的离心管中，取80微升洗脱缓冲液Buffer EB至吸附柱的膜中央，静置1分钟，常温离心洗脱DNA，离心洗脱的转速为12500转/分钟，离心分离的时间为2分钟；

（17）将步骤（16）洗脱的产物转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，操作步骤与步骤（16）相同；

（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到高纯度质粒DNA；

（19）弃去（18）中的吸附柱，把（18）所得的洗脱液保存于-20℃。

（20）检测：将洗脱的质粒DNA产物采用质量百分比浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为TAE 缓冲液（TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成的缓冲液）、电压为1000V的条件下电泳90min，结果可参照图1，提取金黄色葡萄球菌质粒DNA结果，从左至右的电泳条带依次为：质粒DNA（质粒的英文名称为plasmid）、标记物Marker（购买自博迈德生物技术有限公司，货号：MD106-01）。

实施例3

采用QIAGEN公司生产的质粒小提试剂盒（QIAGEN Plasmid Mini Kit），货号：12143，具体组成：RNase A、Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3、Buffer QC、Buffer QF、QIAGEN-tip、2ml Collection Tube。

（1）将含目的质粒（所述目的质粒含抗-卡那霉素基因）的金黄色葡萄球菌接种于5ml 含有15μg/ml 卡那霉素（KAN）的BHI培养基中，37℃摇床培养12小时小量扩增菌液；

（2）在250ml培养瓶中加入150ml含15μg/ml KAN的BHI培养液中，接种3ml步骤（1）的初级菌液至培养瓶中，37℃摇床培养16小时扩增菌液；

（3）收集100ml步骤（2）的金黄色葡萄球菌菌液进行常温离心分离，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的时间为15分钟，倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸吸尽残液；

（4）取5ml裂解细菌菌体的试剂Buffer P1/RNase A于含有溶菌酶和葡萄球菌酶的10ml离心管中，使溶菌酶的浓度为5mg/ml，葡萄球菌酶的浓度为1mg/ml。溶菌酶和溶葡萄球菌酶均购买于Keyinbio公司，货号分别为12650-88-3和9011-93-2；

（5）取5ml步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬，离心管中无沉淀，37℃温浴30分钟；

（6）分别转移500微升步骤（5）重悬液至新的2mL离心管中，分别加入200mg玻璃粉（0.1-0.6mm，已高温灭菌），2800转/分钟，涡旋混匀10分钟，旋涡混合器输入功率为1.2W，输出功率为0.8W，使金黄色葡萄球菌的细胞壁完全破裂；

（7）在步骤（6）中的每个离心管中加入500微升碱裂解液Buffer P2，颠倒离心管10次，使步骤（6）中所得到的菌体裂解；

（8）取12微升20mg/ml蛋白酶K(购买于Merck KGaA公司，货号：39450-01-6)至步骤（7）所得的裂解液中，颠倒混匀离心管10次，室温静置10分钟，其间每隔2分钟颠倒混匀6次得到含蛋白酶K的混合液；

（9）取450微升快速沉淀缓冲液Buffer P3至步骤（8）所得的裂解液中，颠倒混匀15次让溶液彻底中和；

（10）将步骤（9）所得悬浊液进行常温离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为10-15分钟；

（11）将6个吸附柱（实施例3中使用的吸附柱为QIAGEN-tip）置于6个收集管（2 mlCollection Tube）中，分别转移步骤（10）所得的上清液于吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为10000转/分钟，离心分离的时间为30-60秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（12）取630微升漂洗液1 Buffer QC于步骤（11）的吸附柱中，静置5分钟，常温离心分离，离心分离的转速为10000转/分钟，离心分离的时间为30-60秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（13）取650微升漂洗液2 Buffer QF于步骤（12）的吸附柱中，常温离心分离，离心分离的转速为10000转/分钟，离心分离的时间为60秒，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（14）重复步骤（13）；

（15）常温离心分离步骤（14）所得的吸附柱，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为5分钟，干燥吸附柱去除乙醇；

（16）把步骤（15）中的一个吸附柱套在灭菌的1.5ml的离心管中，取100微升灭菌水至吸附柱的膜中央，静置3分钟，常温离心洗脱DNA，离心洗脱的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为2分钟；

（17）将步骤（16）洗脱的产物转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，操作步骤与步骤（16）相同；

（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到高纯度质粒DNA；

（19）弃去（18）中的吸附柱，把（18）所得的洗脱液保存于-20℃。

（20）检测：将洗脱的质粒DNA产物采用质量百分比浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为TAE 缓冲液（TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成的缓冲液）、电压为1000V的条件下电泳90min，结果可参照图1所示，提取金黄色葡萄球菌质粒DNA结果，从左至右的电泳条带依次为：质粒DNA（质粒的英文名称为plasmid）、标记物Marker（购买自博迈德生物技术有限公司，货号：MD106-01）。

另外，本发明三个实施例除了电泳跑胶检测以外，还用分光光度计检测了提取得到的质粒DNA的纯度。其中，实施例1提取的质粒DNA的OD260/OD280值为1.88，实施例2提取的质粒DNA的OD260/OD280值为1.83，实施例3提取的质粒DNA的OD260/OD280值为1.85。三个实施例提取得到质粒DNA的OD260/OD280均在1.8附近，表示提取纯度很高（其序列如序列表1）。

三个实施案例均可成功提取出金黄色葡萄球菌质粒，所用时间相近，通过电泳结果（图1）可知，该方法可以成功提取出目标质粒并且可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

与现有技术相比，本发明提供的提取方法由于结合了物理破壁的方法，溶葡萄球菌酶的用量减少了三分之一，化学破壁时间缩短一小时，在短时间内即可达到较好的裂解细胞壁的效果，迅速地将质粒DNA从金黄色葡萄球菌释放出来，有很好的提取效果。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7777

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)

<400> 1

actagcaggc tgcggattag acgttaccga atgaacagaa ttgggcgaac aagccgttaa 60

tgtcagcaat aataatgtgc cgatttttaa cttatttaac ataaattatc ctttgatttt 120

actaaataaa tttcttttca ggcagcctga aacgtacatt gcgcggaaat tcggataatt 180

tgtttgtaga acaaaaaaac agattttggc gaatttaagc gcaaaagtct agcaatttag 240

ccttataaaa cagaaaaagg caatgatatt tctatcactg cctttttcct ttagcggtct 300

atgccgataa ataaaataag cggtctaagc cgaacaactt cattatatgg ctttatggtt 360

cattattcaa gctatcaagt attcttttac cactcacggc aataagcact tttttctgaa 420

tgtttgtaac tacgtcatca ggcaattttt gatttagttt tttgccatta tcaaaaatgt 480

aatacagacg ttttttactt acacagcgga cgtgttcagt cttaacccat cgttctcttt 540

tctcatagaa gctagtttct tggatcagtt caggctttaa atactcgtga aaagtggcta 600

aacgtccgta ggcttttgta gatgaaatag gggcaacaac cacgctataa ccgtcaatat 660

cgccatttag cacaaccaca aggcggcgtt tacgcatttc aggtggaata tgtccgttta 720

ctgtttcagg ttcagaccat tgcccgaaat cacattccaa cagttcgcca actttggggc 780

ggtggttaat tgccattttt actgctcctt agtaccacgt ttgtacatca ttctaacgtt 840

atcttccgtc atattcagca tttcggcaat tctagcccac ttcacaggcg gataagtatt 900

tcgtaatgtt tgaatctcgt gcaataaacg agctttttca tctttcaaag tgccgtgttc 960

ttttcggatt tggcttgcat aggttgaaat agttttttca gctacttcaa atttttcagt 1020

taaaaggatt ctttctgcct tgctgtattt atgattcggt ccgtatgtgt ctaacatata 1080

cgtttttatt tggttcattt tgtctagtct ccgctgttgg taacttggat atttacagac 1140

taattcattt ctgaaacagt atttgacaat gcttctaatc attgctttta cttcgttttc 1200

aggtagtcca atctctctat ttttactgtt cgctacattg aacaggtatg taaaaaattc 1260

ttttgtcgct ttggtttcca catattcaga gcttacttca taggcaagta accgcatttc 1320

atcaaataat tggcaattac gagaattttc atcgtattta taatgctcat ttggttctac 1380

ttcggtcaaa atgtgatttt ctatatcagt aaaatctaca tcagcaaatt taggattgta 1440

tctatccgca aaagctcgat taaataattc atcaaccgag taagggggaa gttcagtcca 1500

cgcaacagcc ccaacttccg tagcaaaaaa aggatttttg gcattatgta acttgaaatt 1560

tgtatcgcca ttaaataatt cattcagtct tatcactgtt tcaatgaatt ttatctgttt 1620

agattggtta tctagtggta acggctcgcc atttttatcc aattttctat aatcaaaaaa 1680

atctttatct tctagcttaa atactggtgt agcaaggaca tagccaactt gtagggactt 1740

ttgtttttta ggatttctaa tcaaataatt aggcgttagg tcaaacttct caaaaacgct 1800

gtaatcaccg tcaaaatcat caatatcaac gattaaaaca gggaataatt ccgtagcgtt 1860

gttgtatcta tcggtaaatt taacggtaaa agtgaagtgt gtatattctg aaaacgccct 1920

tccccagttc ttactatttg aatagatttt tacaaattta ctaaatgagc cgtctttttg 1980

ctttcctgta ctggcacgca aaacagttct attcataaaa ttagaaaata attttgcaca 2040

agtttcatta ttaaaaatat gagtattatt ttgaataatt ggactataca aacttaatgg 2100

gtttctagcg ttgtggaagc gttgttcttc cattgtgatg aagtcaaaat actttacttt 2160

aaagtaaagt tcgggtatta tttgtttcat aaattcagtg aacccttaga ttgtgtctag 2220

tcgccaaact taacagtcta ggggttttct ttttggttaa tttttagttg tcgggcagtg 2280

tatcacattt agaaaaagcg aacaatatcc ataaatttaa cactgtttat tttttgaaca 2340

aaaccgaaca aaccaccctt actatcatat atatactttt ggctctcttc tgccgtccgt 2400

tttttgtctc tgttttcgtg tccttctctc tgtatttccg aacattcttt ccttgcttct 2460

tagcgtgatg tagttccgtt cgttcagttc gtaaactcgg tcgtaaatcc actgctgaac 2520

gcagtgtctt tgctcccttg tttgctcact tctctcactc ttgtttttgg ttgttttttg 2580

atctacactt gtattcagta ttttaagcga gcatagattt gtacgttact tcgtaacaac 2640

aaatcgctcg taaagggtgg tgctacgccc ccctttaatc ccccagtttt agatcggagc 2700

atttaatcaa tggcaaagaa aggtattaaa cgtggtgtat ctagtcgttt agagattcga 2760

ttaccagtag aaacaaaaca gaaattactt gatatgtgtg gggatcactt ttctacgtct 2820

gaaatgttaa ggcagattat tgagcgtggt gaagttcctg atttaaccgc tacatcttgt 2880

attagagaga aaaaagccac tcttgagcct ttgattattg agcttgctag ggttggcaat 2940

aacttaaatc agataacaaa ggcttctaat gctacattgc ggtttttcaa tcattacaat 3000

acgcaagaca ttgataaatc agcattaggg ttagttgcat tacagcggtt aaatgatgaa 3060

atggctagtt tatttgaaac tagaaaatca ttgaatcgtt tgatttctga tttagttaaa 3120

tggagtaata gcaatgctag ttaaattttt taatactgga aagggatcag ctaggcacgc 3180

atttgattac ttactgaata atgaatgtgt taaaaacggt acagcaaagc tagttaaagg 3240

taatcctgat gtaattacgt ttctaacaga gcaacgaatg aaagagccta gttatagggg 3300

gggagctttg tacacatcag gggtactgtc gttttcgcct gaagaatcta agtctttgac 3360

tgattctaat ctcggtgcaa tcattgggcg atttgaggct actatattcc ctaaattaga 3420

tataactagg tttaatattg cttgggttct tcataaagat aaggatcgta cagaattgca 3480

ttttgtgatt cagaattttg atttagagac taaaaaagca tttacgcctt ttgttgccga 3540

ccgtgattta tcaagggtaa atcaattcaa agataaggtt aatgctgatt ttaatttaag 3600

tgatcctaat ttggtaaaat cacattacca cgttaaaggt ttgaaacggt tatcggaaga 3660

acaaaaatca ttttatcgtg aattgaataa agcctatgcc caatatgttg aagaaagaga 3720

aaatccatct ttcataaaac aagctaaggg cattttatcc aaaataatgg ggcaaaatga 3780

gccacaggca cacgatttac attcaaatga agataagtac gcctttttgc aaaaattcat 3840

tacagagcgt tttaaggggc ttaaaatcaa tcgctcatct gataaatatg catcggttga 3900

ttttaacggt tcaaaaatgc gtttattcta tgaaaaattc gtggttaaag agcttgatga 3960

cgcttttaaa attaaagttg agcagaacaa agaaaaagga ttattgccgg tagatagcgg 4020

acctattttt gcagagttac ttcaatcata tcgccaagca attcaacagg caaaagctga 4080

aaaagaacgc ttaaaacgtg cggaagaaga agcagaaaaa gagcgtttac gccttgtagc 4140

acttgagaaa cagaaagaat tagagaataa atttagagca attttgaatg gttcaaaaga 4200

tgtatttatt gaaaaagtta tcaaaaaggt tattgatcag gactataaga cacgttgcaa 4260

tgagttatta gagcctacat ggatggggac taataaaatt cacaatttta tttgttactc 4320

taaagagctt tcttctgatg atttgaacgc tgaaatgaat aaaattaaac aggcagtaga 4380

acaagaattt ggaaaaacac gtttagatga gcttgaagtt aaaggatttt tcaatcttca 4440

atctgctatt tctaaattag aaactatgca agaaactaca ttagtcaaat tgaaagatgt 4500

gtacattgat ttttataaaa aggtagatac agctagattt aataagttta aagcagaagt 4560

tgatgaatat aaatcaactc atagaagtaa cgctgttatg cttgaatata gagattatgc 4620

aacagccttt ttaaatgatt tattaccaag aatggaacgt tctctaactg tttcaaatcc 4680

tagcgtggaa gcagaaaaga caagtgttta tcaaccacag ccacaagcga agccgaacgc 4740

accaaaattc agaatgtagg gggactgaat acggagaacg ggaatcaaat ccccccacgt 4800

tttagccgca gaaaaatcct gatatttgct cttgaattgt caaaccaagt ccttgaattg 4860

tcaaaccaag tgcaacgatt ttttgaagta aacttcataa ggtgttttcc aacctaaaca 4920

tttacgtggt cgtaaattca gtttattgat cacctgttga atatcaactt cgctccactg 4980

attgatgtct tggtgcttcg gaaagtattc acgaagtaac ccatttgtat tttcattcgt 5040

tcagctcgcg agaaatggtg ctggagctac gtcccagtgc tttggcaatt tctgcttgtt 5100

ttttgccctg tgcgagtaaa atcattatct tttctcgctc gtttattgta agatgtcggt 5160

aggaagtact catcatttgg aagtggtttt tgtgtggaaa caaaattata ttctagttga 5220

tgagtacttc tttttttgtt gcacttggat tgtaaattca gccatttttt taaactattt 5280

aatactaatg tcttttataa tagcttttca tatattatat aatcaatctt tataagtcct 5340

tttataaatt tcttttctac cattttcgat aaattcctgt ttaatatttt taattccata 5400

aacaatagtt tcaataggat aatattcttc aactatatct tgatattctt ttgctttctc 5460

aatatctata tttccataca ttcttaatat atcttctcca aaatttgttc ctatttcttc 5520

ttcactatct tcaagtaagt atataaaatc acaatattca tctataattc cagaatctcc 5580

aaaatcaatt attccagtta atctattatt gccatctaac aatagatgat tacaactaaa 5640

atcattatgg cataaacact ttttaccctc aaaaactgtt gttgcattta gtctttccat 5700

aaaactttct atataatctt tttctatatc agttaaatca ttataaatag tttcacgcaa 5760

caatatatac tcttctaata cattttgttt attatcaata gtacattcac taatatctgt 5820

ataatctaaa ccgtgcattt gtcttaaaaa actggcaata tctcgtttta acaaattttg 5880

ttcttcttct gacatagtag aataaatttc tggtgttaaa aaagttcctt taatttcttt 5940

ataacctagt atagataatt catcactaat atacgaatat tcaatattag gaatttttac 6000

attagtttct aaatttgtat ttaaaaaatt atatattgct ttttcttttg cataaccttt 6060

tttcttatta gtactaaatt ttgttttaaa aatgtattca ttattaacta aatatgccac 6120

actatcataa ccactaccga ttatttcaat actatctact ttgaaattat caaagtaatg 6180

ctcaattaaa tatttcattg ccttaacatt tgtggcatta tcatcatatc tatattccat 6240

taaataacaa tcttcttttt tgccctcgtg taattcatgt tctggcaaat cttcaataat 6300

tctaaaacca gatttttggt atgcccttat tgctcttgga ttatttttat gagggtctaa 6360

aataactgca ttagcatttc tttctttttt caaaaattca aaaatcaatt taatatatct 6420

tgtaccaatt cctttactcc aataatttgg ctctcctata aattgatcca taccatagac 6480

tatctcatca gtttttggat aatgataatc agtatataac tcatcataca ttttatatat 6540

ttgtccatat ccaataggaa cattgttata ttcaataatt actctaaaaa cttcatcttc 6600

ccaaggctct gtataatgtt tttttaatga ttctaatgta tattttttat ctctaccacc 6660

ataaaattct aatactcttt catcagttaa ccattttaac atcaaaggaa aatcatcatc 6720

tattaaagtt cttatacata tttcattttc aactatattc atttatttat cacctttttc 6780

ataatcatat acatatacta tttcatcttt ataatcattt ttaccaccta atttttcata 6840

tacatggcaa gctctaggat tacctttatc agttattaaa aacatttcag aacaaccaat 6900

ctctttagaa tattccttaa taaaaggctg aattttcact ttttctaaca aaatgaattt 6960

gttagttgag ctgtaaagta tgaaatactt gctttgctgc atcttctact aatttattgt 7020

tgaatttggc ttcttcggta aattgcgtac tcatgattgc catcacaatc ggtttgcgat 7080

ttggtatgcg aaccaccgca atatcattgc gtacaccata tttacccgcc ccgcttttat 7140

cgtacacttt ccacgatgtt ggcgtagcag cgcgaatcaa tggattgcct gttgcgttat 7200

tgtccaacca attccacaaa atcgtttttt gcgattcggt taatgtgttg cccaataaat 7260

acgcatttaa attcatcgcc atttgtttgg gtgtactcgt atcacgaata tcgttgggtt 7320

tggcttgatt taaatcgggt tctagccgat tggtatgggt tacgttatcg cctaattgtc 7380

gcaaaatacg ttgatattgt tccacgccac ccaattcttt gagcagcaaa ttggtcgcgc 7440

tgttgtcgct aaaccgcacg gctgcttcac ataattgggc aatcgtcatg cctttgccaa 7500

cgtatttttg ggtttcggga gaataactaa ccaaatcttt ttggctatat gaaatggtac 7560

gatttaaatc tttttcaggc agcgattgca acaccgcccc agccaacaac gccttgaaag 7620

tggacgcata agcaaagcgt tcatctgcac gataagacaa agaatgtccc gtttctgtat 7680

cccatacata aacgccaatt cgggcttgat actgctgttc caaattcgcc aaagtctgtt 7740

gaaaggtggc ttgtgtggct gattgttgca caggcgc 7777

Claims (10)

1.一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；

（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；

（3）将步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；

（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；

（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；

（6）将步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；

（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，得到混合液；

（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，然后室温静置10-15分钟，其间每隔2-3分钟颠倒混匀5-10次得到含蛋白酶K的混合液；

（9）将快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10-15次，得到悬浊液；

（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；

（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；

（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；

（14）重复步骤（13）；

（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；

（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到一次洗脱液，一次洗脱液中含有所述目的质粒；

（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；

（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液；

（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液放在冰箱中冷藏保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；步骤（1）中所述摇床培养的温度为37℃，摇床培养的时间为10-12小时；步骤（2）中所述初级菌液的用量为1-3mL，即接种量为1-3mL；步骤（2）中所述脑心浸出液/抗生素培养基的用量为100-150mL；步骤（2）中所述摇床培养的温度为37℃，培养时间为12-16小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述次级菌液的体积为60mL-100mL；步骤（3）中所述常温离心分离的速率为6000-8000转/分钟，离心分离的时间为10-15分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述溶菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加5-8mg；步骤（4）中所述溶葡萄球菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加1-3mg；步骤（5）中所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液的加入量为3-5mL；步骤（5）中所述恒温浴处理的温度为37摄氏度；恒温浴处理的时间为20-30分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中所述重悬液的用量为500-520微升；步骤（6）中所述玻璃粉的粒径为0.1-0.6mm，所述玻璃粉使用前需高温灭菌，所述玻璃粉的加入量为180-200mg；步骤（6）中所述涡旋混匀的涡旋时间为8-10分钟，涡旋混匀的涡旋速率为2600-2800转/分钟；步骤（7）中所述碱裂解液的加入量为500-520微升。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（8）中所述蛋白酶K为一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶；蛋白酶K的浓度为20-25mg/mL，蛋白酶K的加入量为10-12微升。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（9）中所述快速沉淀缓冲液的加入量为420-450微升；步骤（10）中所述常温离心分离的速率为12000-13000转/分钟，常温离心分离的时间为10-15分钟；步骤（11）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（12）中所述漂洗液1的加入量为600-630微升；步骤（12）中所述常温静置的时间为3-5分钟；步骤（12）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒；步骤（13）中所述漂洗液2的加入量为620-650微升；步骤（13）所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（15）中所述常温离心的离心转速为12000-13000转/分钟，离心的时间为3-5分钟；步骤（16）中所述洗脱缓冲液或者灭菌水的加入量为60-100微升；步骤（16）与步骤（17）所述静置的时间为1-3分钟；步骤（16）与步骤（17）所述常温离心处理的速率为12000-13000转/分钟，离心的时间为1-2分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述裂解细菌菌体的试剂、步骤（7）中所述碱裂解液、步骤（9）中所述快速沉淀缓冲液、步骤（11）中所述吸附柱、步骤（12）中所述漂洗液1、步骤（13）中所述漂洗液2以及步骤（16）中所述洗脱缓冲液均来源于质粒提取试剂盒。