CN109652298A - 一种基于微流控芯片的液滴pcr扩增检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，该装置包括液滴微流控芯片、XYZ运动单元、PCR扩增单元、检测单元。含有DNA分子的液滴生成后，通过移液枪导入液滴微流控芯片中，将芯片置于液滴PCR扩增单元中进行PCR扩增反应，同时经由液滴检测单元中的LED灯与滤光片激发液滴中的荧光染料，控制照相机拍摄荧光液滴图片，包括通过自动聚焦算法与Z运动平台的控制完成液滴图片聚焦，通过芯片标记与XY运动平台的控制完成芯片的不同位置图像获取；将拍摄到的多幅图像进行拼接得到芯片液滴区域图像完整信息进而完成液滴PCR扩增检测。该装置操作简单、试剂消耗少、液滴稳定性好、检测准确性高等优点，能够高效完成PCR扩增诊断分析。
Description
技术领域
本发明涉及生命医学检测、诊断领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增、液滴检测于一体的检测装置。
背景技术
在传统PCR扩增技术之前，先对样品进行微滴化处理，即将反应体系样品分散到直径微米级的大量液滴中，使每个液滴包含一个或不包含靶基因，再进行PCR扩增，有荧光信号判读为1，没有荧光信号为0，然后根据泊松分布与阳性液滴个数比例即可得出靶基因的起始拷贝数和浓度，此种新的核酸检测和定量方法为微液滴数字PCR技术。跟传统扩增技术相比微液滴PCR不依赖于标准曲线和参照样本，准确性强、灵敏度高、能够实现绝对定量，在单细胞基因表达、拷贝数变异、突变检测、二代测序结果验证等方面具有显著优势。
一般的液滴PCR方法往往涉及到诸多手工步骤，例如将液滴用一定的方式(如十字交叉法)生成后导入PCR管中，然后将PCR管置于PCR仪中反应扩增，反应完成后再以一定的方式导入芯片，最后将芯片置于显微镜下观察荧光液滴，此方法不利于实现基因分子诊断的自动化，过程繁琐，且过程中多次导入导出芯片、PCR管会存在试剂损失情况，降低了液滴的稳定性，影响准确率；同时一般的液滴PCR扩增技术无法实时观察PCR扩增过程中液滴的荧光情况，而基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置将液滴的反应扩增、实时检测结合一体，不用进行频繁的导入导出过程而损耗试剂、降低精度，其自动化程度高、扩增效率好、出错概率小，操作简单，可以实时记录PCR扩增过程液滴荧光情况。因此，构建将液滴扩增、液滴实时检测一体化的基于微流控芯片的液滴PCR扩增***，能够显著降低液滴PCR扩增检测***的操作复杂度，提高效率，为实现更加方便快捷、操作简单的一体化高通量单分子诊断分析打下坚实的基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种集液滴PCR扩增反应、荧光液滴实时检测一体的高通量核酸分析装置，该装置能够实现实时PCR扩增荧光检测，灵敏度高，能够较好的完成单分子诊断检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为集基于微流控芯片技术、微液滴技术与PCR扩增技术、液滴检测技术一体的***分析装置***，***设计如图2所示。本发明上位机为平板电脑通过USB连接并控制荧光相机，通过USART连接下位机STM32，并由上位机向下位机发放指令进而控制XY运动平台、Z平台、半导体制冷器、光源LED等，以此完成液滴PCR扩增控制过程并实现自动聚焦、实时采集液滴扩增图片、液滴检测。
一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，该装置包括微流控芯片(1)、XYZ运动单元(2)、PCR扩增单元(3)和检测单元(4)。微流控芯片(1)放置于PCR扩增单元(3)中，进行扩增反应。PCR扩增单元(3)固定在XYZ运动单元(2)上，以达到三维控制PCR扩增单元运动进而控制微流控芯片位置的目的，检测单元(4)固定于装置一侧，其检测镜头正对微流控芯片进而实现实时微流控芯片(1)图像获取。
微流控芯片(1)包括注样孔(1-1)、盖片(1-2)、结构片(1-3)、底片(1-4)、液滴扩增反应室(1-5)、出样孔(1-6)、盖片注样孔(1-7)、盖片出样孔(1-8)以及芯片位置标记(1-9)。由常用生成液滴方法(如十字交叉法)收集液滴到离心管中，并用移液枪吸取到微流控芯片(1)中，微流控芯片采用三明治结构，上下分别为盖片(1-2)和底片(1-4)，中间夹着结构片(1-3)，三者通过双面胶进行连接粘连。结构片(1-3)中镂空的六边形部分即为液滴扩增反应室(1-5)。盖片(1-2)高度设计大于1mm，以加大微流控芯片(1)的整体硬度与质量，使微流控芯片有一定的刚性，不易弯折，便于与注样出样孔相连；同时，为减少热量损失，结构片(1-3)、底片(1-4)的厚度小于0.2mm。在盖片(1-2)上与结构片(1-3)六边形区域的两端对齐的位置分别打了直径范围0.5mm-1mm的盖片注样孔(1-7)和盖片出样孔(1-8)，注样孔(1-1)、出样孔(1-6)位于盖片(1-2)的上面，与注样孔(1-7)和盖片出样孔(1-8)相连，高度3-6mm，方便移液枪枪尖能够顺利***。液滴通过注样孔(1-1)注入结构片(1-3)的液滴扩增反应室(1-5)中，液滴扩增反应室(1-5)采用六边形结构利于排气，注完液滴后，将注样孔(1-1)、出样孔(1-6)注入矿物油即可封住芯片进行扩增反应，提高加热效率。同时在结构片(1-3)上印有芯片位置标记(1-9)，此标记可与荧光相机(4-1)、XYZ运动单元(2)相互配合，实现多次不同位置拍照，完成芯片液滴存储区域的图像完整获取。
XYZ运动单元(2)包括高精度Z方向运动平台(2-1)、Z相机转接板(2-2)、Y轴电机(2-3)、Y轴主动轮(2-4)、Y轴从动轮(2-5)、Y轴皮带(2-6)、Y轴导轨(2-7)、微小光耦a(2-8)、Y轴滑块(2-9)、X轴电机(2-10)、X轴主动轮(2-11)、X轴从动轮(2-12)、X轴导轨(2-13)、微小光耦b(2-14)、卡位开关a(2-15)、卡位开关b(2-16)、X轴滑块(2-17)、装置底板(2-18)、X轴皮带(2-19)。采用图像检测方法进行检测，采用20倍放大倍数下，实际的拍摄范围仅有2mm2，液滴的直径范围为50-200微米，一次拍摄图像内液滴数量过少，为了能够准确得到完整扩增室液滴反应图像，本发明采用控制XYZ运动单元(2)运动，多次拍摄反应腔不同位置图像，再将多幅图像进行图像拼接完成较大面积范围内的图像获取的方法。
本发明设计了两套电机驱动装置用于实现前后左右运动，一套基于X轴方向，另一套基于Y轴方向。其中，将X轴电机(2-10)固定于装置底板(2-18)上，X轴电机(2-10)将带动与之连接的X轴主动轮(2-11)通过X轴皮带(2-19)使位于X轴方向另一侧的X轴从动轮(2-12)运动，X轴导轨(2-13)平行于X轴皮带(2-19)放置，通过X轴滑块(2-17)相连，由微小光耦a(2-8)、微小光耦b(2-14)实现运动定位。将Y轴方向电机驱动装置的底板固定在X轴驱动装置X轴滑块(2-17)上，完成二维平面的前后左右运动目标；再将Y轴电机(2-3)固定于Y轴方向电机驱动装置的底板上，Y轴电机(2-3)将带动与之连接的Y轴主动轮(2-4)通过Y轴皮带(2-6)使位于Y轴方向另一侧的Y轴从动轮(2-5)运动，Y轴导轨(2-7)平行于Y轴皮带(2-6)放置，通过Y轴滑块(2-9)相连，由卡位开关a(2-15)、卡位开关b(2-16)实现运动定位。而Y轴滑块(2-9)则与PCR扩增单元(3)相连，以完成不同芯片区位置的采集需要。Z轴方向运动采用高精度Z方向运动平台(2-1)控制，应用高精度WN04VA5平台，平行于X轴方向置于装置底板(2-18)一侧。固定在高精度Z方向运动平台(2-1)上的Z相机转接板(2-2)将与检测单元相机支撑架(4-5)相连完成图像拍照，并与自动聚焦算法配合，实现聚焦自动化。
PCR扩增单元(3)包括PCR扩增底板(3-1)、散热片(3-2)、底板(3-3)、压板(3-4)、压片a(3-5)、压片b(3-6)、涡轮风扇a(3-7)、涡轮风扇b(3-8)、半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)、热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)、导热铝板(3-13)和芯片保温盖(3-14)。PCR扩增底板(3-1)固定于XYZ运动单元(2)上，以完成PCR扩增单元(3)运动控制。整个PCR扩增单元(3)分为散热区、温控区以及芯片区。散热区的散热片(3-2)固定在PCR扩增底板(3-1)上，散热片一侧放有涡轮风扇a(3-7)、涡轮风扇b(3-8)，两个涡轮风扇的风口对准散热片，完成***散热降温需求。散热片(3-2)通过底板(3-3)连接温控区的半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)，并在上面分别放置了测温元件热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)进行测温。为能起到良好的控温导热效果，将导热铝板(3-13)置于半导体制冷器上，并用压板(3-4)固定，导热铝板(3-13)上即可放置芯片区的微流控芯片(1)，再使用压片a(3-5)、压片b(3-6)固定微流控芯片(1)，进行芯片控温。同时，在PCR扩增单元(3)的散热区、温控区、芯片区之间的缝隙中涂抹填充导热硅脂，代替空气导热，可以加快升降温速度。此外，为减少芯片与空气中的热量交换，设计了芯片区保温盖(3-14)，在实验过程中，将保温盖(3-14)置于芯片区上，用锡箔纸包裹再使用，这样还可以起到避光作用。
检测单元(4)包括荧光相机(4-1)、长筒镜头(4-2)、滤光片(4-3)、物镜(4-4)、相机支撑架(4-5)、光源支撑架(4-6)、LED散热片(4-7)、LED灯(4-8)、滤光片(4-9)、非球面透镜(4-10)。荧光相机(4-1)与长筒镜头(4-2)相连、并在长筒镜头(4-2)与物镜(4-4)之间配置了滤光片(4-3)，再将物镜(4-4)对准芯片区，他们彼此在一条直线上。本发明固定相机的相机支撑架(4-5)直接与XYZ运动单元(2)相连，通过拍照、软件控制完成自动聚焦过程。在PCR扩增底板(3-1)一侧固定光源支撑架(4-6)，并在光源支撑架(4-6)上放置装置的激发光源LED灯(4-8)，为避免传统拍摄方法中出现的图片背景均一、光斑不明显、产生暗区等影响图像后续处理的情况，本发明对LED点光源进行了优化，采用非球面透镜(4-10)，将LED灯(4-8)近似的看作点光源放置于非球面透镜(4-10)的焦点处，使得LED灯(4-8)经过滤光片(4-3)发出的点光源经过非球面透镜(4-10)进行准直形成平行光，映射在装置芯片区；同时，为保护光源，在LED灯(4-8)后面配置了LED散热片(4-7)，提高散热效果。
自动聚焦与图像拼接实现：
由于液滴信号微弱，在对PCR扩增微流控芯片进行图像采集时，相机须进行长时间曝光，导致采集的图像噪声很高。本发明针对液滴图像的特性设计了具有良好的单锋性液滴聚焦评价函数与改进的爬山算法配合控制XYZ单元中的高精度Z平台运动完成自动聚焦过程。具体步骤如下先对图像进行高通滤波，然后对图像做统一背景处理，减去固定背景值后再使用中值滤波，达到对图片噪点的去除效果，以确定用于聚焦判断的聚集评价函数形式：
其中，x,y表示像素点的坐标,f(x,y)是该点的值，Q表示原图像进行高通滤波后，对图像减去固定背景值后再使用中值滤波后的图像。
爬山算法的主要思想是将两个相邻位置的聚焦评价结果进行比较，选择最优值，并作为推断下一次移动方向和距离的依据。但是其仅利用相邻两个位置的信息进行比较导致其可能出现局部最优解。由此本发明的自动聚焦算法在此基础上增加了推断下一步运动状态所需的位置点数，根据三个相邻位置点的聚焦评价结果变化趋势及三个位置点的运动方向进行双重判断进而推断下一步运动状态。改进后的算法可以对清晰度曲线的锯齿波动进行很好的滤除。通过观察，聚焦函数在对焦区域内的清晰度曲线成一个完整的波峰。选取合适的运动初始步长，既可保证Z方向运动平台进入聚焦区域，同时也可以提高聚焦速度。步长选取准则为：式中，n为初始设定步长，width为清晰度曲线波峰宽度所对应的运动距离。
三位置点爬山算法通过连续的三个位置点的聚焦评价结果和运动方向进行下一次运动推测，为方便描述，三个位置点依次为x0,x1,x2，其聚焦评价结果依次为f(x0),f(x1),f(x2)，运动方向依次为m0,m1,m2，控制过程中分为以下几种情况：三个位置点运动方向相同，且评价结果逐步增大，f(x0)<f(x1)<f(x2)，保持步长与方向不变继续运动；
a)三个位置点运动方向相同，且评价结果逐步减小，f(x0)>f(x1)>f(x2)，聚焦点处于与运动方向相反的极限位置和x1位置之间，改变运动方向，步长减半，继续运动；
b)三个位置点运动方向相同，但评价结果变化趋势不统一，如：f(x0)≥f(x1)且f(x2)≥f(x1)或者f(x0)≤f(x1)且f(x2)≤f(x1)，保持步长与方向不变继续运动；c)三个位置点运动方向不同，保持步长与方向不变继续运动；
d)符合b情况，但设定步长小于最小运动步长，此时认为已进入最佳聚焦区域，聚焦点位置为(x0+x1)/2处。
通过情况c)配合初始步长n的选择，可降低噪声对聚焦的影响，避免局部最优解，获取较好的聚焦效果。聚焦运动控制算法流程图如图7所示。
本发明拍照时，应保证在黑色、避光环境下拍照，针对液滴直径小，放大好显示拍照区域受限等问题，设计了多次拍照图像拼接图像来解决的方法。当相机聚好焦后，针对本发明微流控芯片的不同标记处，进行多位置图像拍摄，将采集的图像在程序中通过OpenCV中Stitch函数进行逐次图像拼接，完成整个芯片液滴区域图像获取。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
1、本发明将微流控芯片、PCR扩增技术与液滴检测相结合，实现了核酸的微液滴扩增技术与检测技术一体化过程。操作简单、方便，避免了传统液滴PCR技术在扩增与检测之间多次导入导出试剂浪费、液滴环境不稳定的问题，提高了核酸扩增、检测的效率。
2、本发明在液滴扩增过程中，根据需要可以应用软件控制实时拍照，得到不同扩增阶段的液滴图像数据，观察液滴扩增发生荧光实时情况。
3、本发明对传统的LED激发光源进行了优化，增加非球面透镜，将LED近似的看作点光源放置于透镜的焦点处，使得LED发出的点光源经过透镜进行准直形成平行光，映射在装置芯片区，起到良好的激发效果。
4、本发明针对液滴图像特点，设计了自动聚焦算法控制Z平台对液滴图像进行自动聚焦采集，在芯片设计上进行了位置标记，完成XY运动平台多幅图像位置采取过程，进而图像拼接获得完整液滴信息图像。芯片、XYZ运动平台、自动聚焦算法、图像拼接算法作为一个***的整体各个环节配合使用，高效、准确完成液滴检测过程。
附图说明
图1为本发明微流控液滴扩增检测装置一个实施例示意图。
图2为本发明装置的***设计图。
图3a本发明的微流控芯片结构图。
图3b本发明的微流控芯片结构图
图4为本发明XYZ运动单元结构示意图。
图5a为本发明PCR扩增单元结构示意图
图5b为本发明PCR扩增单元局部结构示意图
图6为本发明检测单元结构示意图
图7为本发明自动聚焦算法流程图
图8为本发明另一实例示意图
图中：1微流控芯片、1-1注样孔、1-2盖片、1-3结构片、1-4底片、1-5液滴扩增反应室、1-6出样孔、1-7盖片注样孔、1-8盖片出样孔、1-9芯片位置标记、2XYZ运动单元、2-1高精度Z方向运动平台、2-2Z相机转接板、2-3Y轴电机、2-4Y轴主动轮、2-5Y轴从动轮、2-6Y轴皮带、2-7Y轴导轨、2-8微小光耦a、2-9Y轴滑块、2-10X轴电机、2-11X轴主动轮、2-12X轴从动轮、2-13X轴导轨、2-14微小光耦b、2-15卡位开关a、2-16卡位开关b、2-17X轴滑块、2-18装置底板、2-19X轴皮带、3PCR扩增单元、3-1PCR扩增底板、3-2散热片、3-3底板、3-4压板、3-5压片a、3-6压片b、3-7涡轮风扇a、3-8涡轮风扇b、3-9半导体制冷器a、3-10半导体制冷器b、3-11热敏电阻a、3-12热敏电阻b、3-13导热铝板、3-14芯片保温盖、4检测单元、4-1荧光相机、4-2长筒镜头、4-3滤光片、4-4物镜、4-5相机支撑架、4-6光源支撑架、4-7LED散热片、4-8LED灯、4-9滤光片、4-10非球面透镜。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
如图1所示，将该装置置于黑色、避光环境中，先用移液枪往芯片注样孔(1-1)中注入矿物油排除芯片空气，为液滴存储创造环境，然后用移液枪把液滴缓慢通过注样孔(1-1)注入微流控芯片(1)中，再用矿物油注满注样孔(1-1)出样孔(1-6)，完成芯片封层。
将装好液滴的微流控芯片(1)置于PCR扩增单元(3)芯片区中，用压片a(3-5)、压片b(3-6)固定好。半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)为控温元件、热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)位测温元件，两者构成闭环温度控制回路。同时，半导体制冷器上方放置导热铝块(3-13)，通过压板(3-4)固定，下方通过底板(3-3)与散热片(3-2)相连，散热片一侧配有侧向的涡轮风扇，以此配合完成温度的升温与降温。
X轴电机(2-10)带动X轴主动轮(2-11)、X轴从动轮(2-12)通过X轴皮带(2-19)完成X轴运动，X轴通过微小光耦a(2-8)、微小光耦b(2-14)控制X轴电机(2-10)位置。Y轴电机(2-3)带动Y轴主动轮(2-4)、Y轴从动轮(2-5)通过Y轴皮带(2-6)完成Y轴运动，Y轴通过卡位开关a(2-15)、卡位开关b(2-16)控制电机位置。以此XY方向运动通过使PCR扩增单元运动实现，Z方向运动通过使相机运动实现，整体实现了三维运动照相控制。
本实例的LED灯(4-8)通过滤光片(4-9)经过非球面透镜(4-10)形成光源映射到微流控芯片(1)上，通过滤光片(4-3)、物镜(4-4)、长筒镜头(4-2)、荧光相机(4-1)完成拍照。
本实例拍照得出一幅图像，根据自动聚焦算法对图像进行聚焦评价判断得出图像向上或者向下运动，完成图像聚焦过程，再根据微流控芯片(1)上的位置标记(1-9)进行XY方向运动完成多幅图像拍摄，再用软件进行图像拼接完成芯片液滴整个区域的图像采集过程。
如图8所示，为本发明另一实施用例。将该装置置于黑色、避光环境中，先用移液枪往芯片注样孔(1-1)中注入矿物油排除芯片空气，为液滴存储创造环境，然后用移液枪把液滴缓慢通过注样孔(1-1)注入微流控芯片(1)中，再用小片PC材料同孔顶层用乙腈粘粘封住注样孔、出样孔，完成芯片封层。
将装好液滴的微流控芯片(1)置于PCR扩增单元(3)芯片区中，用压片a(3-5)、压片b(3-6)固定好。半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)为控温元件，热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)为测温元件，控温元件和测温元件构成闭环温度控制回路。同时，半导体制冷器上方放置导热铝块(3-13)，通过压板(3-4)固定，下方通过底板(3-3)与散热片(3-2)相连，散热片(3-2)一侧配有侧向的涡轮风扇，以此配合完成温度的升温与降温。在不需要实时采集图像时将芯片保温盖(3-14)用锡纸包裹置于芯片区上方，减少热量散发，防止荧光损失。
本实例将Y轴运动平台底板置于X轴运动滑块上，实现XY平面运动。X轴电机(2-10)带动X轴主动轮(2-11)、X轴从动轮(2-12)通过X轴皮带(2-19)完成X轴运动，X轴通过微小光耦a(2-8)、微小光耦b(2-14)控制电机位置。Y轴电机(2-3)带动Y轴主动轮(2-4)、Y轴从动轮(2-5)通过Y轴皮带(2-6)完成Y轴运动，Y轴通过卡位开关a(2-15)、卡位开关b(2-16)控制电机位置。Y轴滑块(2-9)上放置PCR扩增底板(3-1)。Z轴运动通过高精度Z方向运动平台(2-1)实现。
本实例在液滴扩增过程中，如不想观察液滴情况，可以用平板电脑控制将LED灯(4-8)关闭，避免长时间激发荧光消失，当有需求时再将LED灯(4-8)打开。
本实例拍照得出一幅图像，根据自动聚焦算法对图像进行聚焦评价判断得出图像向上或者向下运动，完成图像聚焦过程，再根据微流控芯片(1)上的位置标记(1-9)进行XY方向运动完成多幅图像拍摄，再用软件进行图像拼接完成芯片液滴整个区域的图像采集过程。
Claims (10)
1.一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：该装置包括微流控芯片(1)、XYZ运动单元(2)、PCR扩增单元(3)和检测单元(4)；微流控芯片(1)放置于PCR扩增单元(3)中，进行扩增反应；PCR扩增单元(3)固定在XYZ运动单元(2)上，以达到三维控制PCR扩增单元运动进而控制微流控芯片位置的目的，检测单元(4)固定于装置一侧，其检测镜头正对微流控芯片进而实现实时微流控芯片(1)图像获取，并进行自动聚焦与图像拼接。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：微流控芯片(1)包括注样孔(1-1)、盖片(1-2)、结构片(1-3)、底片(1-4)、液滴扩增反应室(1-5)、出样孔(1-6)、盖片注样孔(1-7)、盖片出样孔(1-8)以及芯片位置标记(1-9)；由生成液滴方法收集液滴到离心管中，并用移液枪吸取到微流控芯片(1)中，微流控芯片采用三明治结构，上下分别为盖片(1-2)和底片(1-4)，中间夹着结构片(1-3)，三者通过双面胶进行连接粘连；结构片(1-3)中镂空的六边形部分即为液滴扩增反应室(1-5)；盖片(1-2)高度设计大于1mm，以加大微流控芯片(1)的整体硬度与质量，使微流控芯片有一定的刚性，不易弯折，便于与注样出样孔相连；同时，为减少热量损失，结构片(1-3)、底片(1-4)的厚度小于0.2mm；在盖片(1-2)上与结构片(1-3)六边形区域的两端对齐的位置分别打了直径范围0.5mm-1mm的盖片注样孔(1-7)和盖片出样孔(1-8)，注样孔(1-1)、出样孔(1-6)位于盖片(1-2)的上面，与注样孔(1-7)和盖片出样孔(1-8)相连，高度3-6mm，方便移液枪枪尖能够顺利***；液滴通过注样孔注入结构片(1-3)的液滴扩增反应室(1-5)中，腔室采用六边形结构利于排气，注完液滴后，将注样孔(1-1)、出样孔(1-6)注入矿物油即可封住芯片进行扩增反应；同时在结构片(1-3)上印有芯片位置标记(1-9)，此标记与荧光相机(4-1)、XYZ运动单元(2)相互配合，实现多次不同位置拍照，完成芯片液滴存储区域的图像完整获取。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：XYZ运动单元(2)包括高精度Z方向运动平台(2-1)、Z相机转接板(2-2)、Y轴电机(2-3)、Y轴主动轮(2-4)、Y轴从动轮(2-5)、Y轴皮带(2-6)、Y轴导轨(2-7)、微小光耦a(2-8)、Y轴滑块(2-9)、X轴电机(2-10)、X轴主动轮(2-11)、X轴从动轮(2-12)、X轴导轨(2-13)、微小光耦b(2-14)、卡位开关a(2-15)、卡位开关b(2-16)、X轴滑块(2-17)、装置底板(2-18)、X轴皮带(2-19)；采用图像检测方法进行检测，在20倍放大倍数下，采用控制XYZ运动单元(2)运动，多次拍摄反应腔不同位置图像，再将多幅图像进行图像拼接完成大面积范围内的图像获取。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：设计两套电机驱动装置用于实现前后左右运动，一套基于X轴方向，另一套基于Y轴方向；X轴电机(2-10)带动X轴主动轮(2-11)、X轴从动轮(2-12)通过X轴皮带(2-19)完成X轴运动，X轴通过微小光耦a(2-8)、微小光耦b(2-14)控制X轴电机(2-10)位置；Y轴电机(2-3)带动Y轴主动轮(2-3)、Y轴从动轮(2-5)通过Y轴皮带(2-6)完成Y轴运动，Y轴通过卡位开关a(2-15)、控制电机位置(2-16)；将Y轴方向电机驱动装置的底板固定在X轴驱动装置X轴滑块(2-17)上，完成二维平面的前后左右运动目标；而X轴滑块(2-17)则与PCR扩增单元(3)相连，完成不同芯片区位置的采集需要；Z轴方向运动采用高精度Z方向运动平台(2-1)控制，XY方向运动通过使PCR扩增单元运动实现，Z方向运动通过使相机运动实现，整体实现三维运动照相控制。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：PCR扩增单元(3)包括PCR扩增底板(3-1)、散热片(3-2)、底板(3-3)、压板(3-4)、压片a(3-5)、压片b(3-6)、涡轮风扇a(3-7)、涡轮风扇b(3-8)、半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)、热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)、导热铝板(3-13)和芯片保温盖(3-14)；PCR扩增单元(3)分为温控区、芯片区以及散热区；在芯片区外侧设计了一圈螺纹孔，根据芯片的情况固定并使用多个压片，将微流控芯片(1)与温控区的导热铝板(3-13)紧密结合；散热区由散热片(3-2)和涡轮风扇a(3-7)、涡轮风扇b(3-8)组成，两个涡轮风扇的风口对准散热片，完成***散热降温需求；温控区由测温元件热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)和控温元件半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)组成，左右各一套测温控温元件，同时控制；在芯片区、散热区与温控区之间的缝隙中涂抹填充导热硅脂，代替空气导热，加快升降温速度；为减少热量交换，设计了芯片区保温盖(3-14)，在实验过程中，将保温盖用锡箔纸包裹再使用。
6.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：检测单元(4)包括荧光相机(4-1)、长筒镜头(4-2)、滤光片(4-3)、物镜(4-4)、相机支撑架(4-5)、光源支撑架(4-6)、LED散热片(4-7)、LED灯(4-8)、滤光片(4-9)、非球面透镜(4-10)；荧光相机(4-1)与长筒镜头(4-2)相连、并在长筒镜头(4-2)与物镜(4-4)之间配置了滤光片(4-3)，再将物镜(4-4)对准芯片区，他们彼此在一条直线上；固定相机的相机支撑架(4-5)直接与Z运动平台相连，通过拍照、软件控制完成自动聚焦过程；采用非球面透镜(4-10)，将LED灯(4-8)近似的看作点光源放置于透镜的焦点处，使得LED灯(4-8)发出的点光源经过透镜进行准直形成平行光，映射在装置芯片区。
7.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：自动聚焦与图像拼接实现过程如下，
由于液滴信号微弱，在对PCR扩增微流控芯片进行图像采集时，相机须进行长时间曝光，导致采集的图像噪声很高；针对液滴图像的特性设计了具有良好的单锋性液滴聚焦评价函数与改进的爬山算法配合控制XYZ单元中的高精度Z平台运动完成自动聚焦过程；先对图像进行高通滤波，然后对图像做统一背景处理，减去固定背景值后再使用中值滤波，达到对图片噪点的去除效果，以确定用于聚焦判断的聚集评价函数形式：
其中，x,y表示像素点的坐标,f(x,y)是该点的值，Q表示原图像进行高通滤波后，对图像减去固定背景值后再使用中值滤波后的图像；
自动聚焦算法在此基础上增加了推断下一步运动状态所需的位置点数，根据三个相邻位置点的聚焦评价结果变化趋势及三个位置点的运动方向进行双重判断进而推断下一步运动状态；改进后的算法对清晰度曲线的锯齿波动进行很好的滤除；通过观察，聚焦函数在对焦区域内的清晰度曲线成一个完整的波峰；选取合适的运动初始步长，既可保证Z方向运动平台进入聚焦区域，同时也可以提高聚焦速度；步长选取准则为：式中，n为初始设定步长，width为清晰度曲线波峰宽度所对应的运动距离；
三位置点爬山算法通过连续的三个位置点的聚焦评价结果和运动方向进行下一次运动推测，为方便描述，三个位置点依次为x0,x1,x2，其聚焦评价结果依次为f(x0),f(x1),f(x2)，运动方向依次为m0,m1,m2，控制过程中分为以下几种情况：三个位置点运动方向相同，且评价结果逐步增大，f(x0)<f(x1)<f(x2)，保持步长与方向不变继续运动；
a)三个位置点运动方向相同，且评价结果逐步减小，f(x0)>f(x1)>f(x2)，聚焦点处于与运动方向相反的极限位置和x1位置之间，改变运动方向，步长减半，继续运动；
b)三个位置点运动方向相同，但评价结果变化趋势不统一，如：f(x0)≥f(x1)且f(x2)≥f(x1)或者f(x0)≤f(x1)且f(x2)≤f(x1)，保持步长与方向不变继续运动；
c)三个位置点运动方向不同，保持步长与方向不变继续运动；
d)符合b)情况，但设定步长小于最小运动步长，此时认为已进入最佳聚焦区域，聚焦点位置为(x0+x1)/2处。
8.根据权利要求2所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：操作过程为先用移液枪往芯片注样孔(1-1)中注入矿物油排除芯片空气，为液滴存储创造环境，然后用移液枪把液滴缓慢通过注样孔(1-1)注入微流控芯片(1)中，再用矿物油注满注样孔(1-1)出样孔(1-6)，完成芯片封层。
9.根据权利要求5所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：将装好液滴的微流控芯片(1)置于PCR扩增单元芯片区中，用压片a(3-5)、压片b(3-6)固定好；半导体制冷器a(3-9)、半导体制冷器b(3-10)为控温元件、热敏电阻a(3-11)、热敏电阻b(3-12)位测温元件，两者构成闭环温度控制回路；同时，半导体制冷器上方放置导热铝块(3-13)，通过压板(3-4)固定，下方通过底板(3-3)与散热片(3-2)相连，散热片一侧配有侧向的涡轮风扇，以完成温度的升温与降温。
10.根据权利要求6所述的一种基于微流控芯片的液滴PCR扩增检测装置，其特征在于：LED灯(4-8)通过滤光片(4-9)经过非球面透镜(4-10)形成光源映射到微流控芯片(1)上，通过滤光片(4-3)、物镜(4-4)、长筒镜头(4-2)、荧光相机(4-1)完成拍照。
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