CN107478629A - 一种大面积数字pcr微滴荧光高通量检测装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿荧光检测光路，数字PCR芯片受激发光产生的荧光依次经物镜装置、聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，载物台还设有温控装置，温控装置实时控制数字PCR芯片反应的循环温度。本发明公开了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测方法，可获得更高的检测效率和大面积高通量检测的准确性。本发明可以实现高通量、高灵敏度、高特异性的实时数字qPCR检测，对于提高数字PCR检测仪器性能、精度和通量具有重要意义。

Description

一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置和方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验领域核酸检测领域，特别涉及一种能够实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置和方法。
背景技术
在肿瘤早期诊断筛查、血液病毒分型及载量分析、无创产前诊断等领域，都需要对超低浓度的核酸进行高速高灵敏度高特异性的检测，常规的PCR已越来越无法满足需求。为实现此功能，人们在PCR基础上，发展了一种数字PCR技术，将检测灵敏度提高了1～2个数量级。
微滴式数字PCR采用的“分而治之”(divide and conquer)的检测策略，将样品、PCR试剂混合物作为分散相，将油作为连续相，利用微流控技术，将样品混合物形成一个个液滴悬浮于连续相中。进而，将一个标准PCR扩增分配至大量微滴(纳升至皮升)中，每个微滴中仅包含0个或1个拷贝的目标分子(DNA模板)。对每个微滴进行独立PCR扩增，扩增结束后，检测每个微滴的荧光，对阳性信号的微滴进行计数，从而得到样品模板的绝对拷贝数和核酸浓度。微滴的尺寸和数量决定了数字PCR的检测灵敏度和下限，现有的数字PCR微滴数在2万～1000万之间。
现有的商用微滴式数字PCR技术操作如下：在专用的微滴制备芯片上制备液滴；通过移液器将微滴转移至离心管中，使用常规的PCR仪进行温度循环扩增；扩增完成后，利用流式技术依次对每个微滴进行荧光激发与探测，计算结果。这样的检测方式存在以下问题：
(1)流式检测速度较慢，检测速度在200～500个/s，检测过程耗时久，通量低；
(2)只能对单个微滴进行终点法检测,不能实时qPCR，降低了特异性和灵敏度；
(3)光路硬件复杂，难以实现多重数字PCR检测(4重以上)；
(4)两次液滴的转移过程将导致微滴损失，以及可能引来的外界污染；
(5)常规PCR扩增仪的加热块热惯量大，热循环时间长(2小时左右)。
为解决上述五个问题，申请人已提出了一体式数字PCR芯片，并已申请发明专利(申请号201510961967.0)。参见附图1，一体式数字PCR芯片包括本体1，位于其上的连续相注入孔11、样品注入孔12、单层微滴平铺腔体15、真空接入孔16、用于生成微滴的“+字型”微结构13，以及用于连接连续相注入孔11和“+字型”微结构13的液路14、用于连接样品注入孔12和“+字型”微结构13的第一液路17、用于连接“+字型”微结构13和单层微滴平铺腔体15的第二液路18。通过MEMS工艺将所述所有微结构制作于一片聚合物基板上，随后与另一块聚合物平板相键合而形成封闭的微流道***，在连续相注入孔11、样品注入孔12、真空接入孔16三处开孔，用于注入样品和施加负压。
参照图2，其基本原理为：在连续相注入孔11注入油、样品注入孔12注入样品后，在真空接入孔16施加真空负压，样品、连续相将在负压的作用下，通过流道14和17到达“+字型”微结构13。在此处，样品将因连续相的剪切而形成一个个纳升级微滴20，随后经过流道18进入单层微滴平铺腔体15，平铺成微滴单层19。
该技术方法具有以下优势：微滴单层19适用于使用CCD进行图像化荧光拍照检测，具有较高的通量和速度；通过连续荧光图像检测可以获得微滴荧光随循环此时的变化曲线，进行单液滴qPCR检测，具有较高灵敏度和特异性；通过增加激发光源和滤光片，可轻易实现多重数字PCR；整个过程一体化完成，不存在微滴损失和外界的污染。最后，单层微滴将具有较大的温控面积和较小的热惯量，可以将PCR循环扩增时间降低至半小时以内。
为了利用该数字PCR芯片进行核酸检测，一方面需要对该数字PCR微流控芯片进行温度循环扩增，另一方面需要对数字PCR液滴单层进行实时激光激发和荧光成像探测。每温度循环一次，便进行一次液滴荧光图像检测，以获得每个液滴的荧光连续变化曲线。为提高通量，在一块芯片上，可集成多个一体式数字PCR微流控结构，形成32个、48个甚至96个样品的同时检测(参照图3)，以便提高通量，这样便需要芯片可以进行一维或二维的运动，以便可以通过扫描方式进行大面积图像采集。另外，为提高检测效率，采用一种新算法，先通过小倍率进行粗略大视场观看，发现可能存在液滴荧光点后，切换成高倍率精细小视场观测的方式，以提高效率。但现有的检测装置如荧光显微镜等，无法满足上述检测要求。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其通过***光路的设计以及分割检测区域的连续扫描，能够实现数字PCR的高通量、实时和精准定量检测，此外，通过大小扫面视场的切换可实现液滴荧光点的快速定位和检测。
本发明还有一个目的是通过一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测方法，可获得更高的检测效率和大面积高通量检测的准确性。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，包括荧光激发光路和荧光检测光路；
沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；
沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；
其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。
优选的是，其中，所述载物台固定设于光路路径上，或至少具有一个平移自由度，以满足大面积图像采集的需要。
优选的是，其中，所述物镜装置包括：
一个物镜，其固定设于光路中；
或若干个不同倍率的物镜，其以可切换的形式分别被配置至光路中，从而实现不同倍率的数字PCR微滴荧光成像。
优选的是，其中，所述物镜的倍率选自2X、4X、5X或10X。
优选的是，其中，所述光源装置包括：
光源组件，其提供平行混合光源；
光源滤光片组件，其具有：
一个光源滤光片，其固定设于所述荧光激发光路中，或
若干个光源滤光片，其以可切换的形式分别被配置至所述荧光激发光路中。
光源滤光片可用于对混合光源进行滤光处理，以提供可用于激发PCR微滴染料所需的单色光源。本方案中采用混合光源和滤光片来产生单色光源，可以以较低的成本提供多个波长的单色激发光源，实现多重数字PCR功能。
优选的是，其中，所述光源装置包括若干个单色光源组；
沿光路前进方向，所述单色光源组依次包括：单色光源、快门和光源透镜；其中，所述快门通断控制所述荧光激发光路。
优选的是，其中，所述光源装置包括：
至少两个单色光源组，以提供较强的激发光源；；
若干个第一分色镜，其将所述单色光源组的发射光路合束并导入所述荧光激发光路。
分色镜可用于将两路激发光源合并成一束，利用多个二色镜可以将所有的激发光源合并成一束，从而提供多个不同波长的激发光源，实现多重数字PCR功能。
优选的是，其中，聚焦装置包括：
第二分色镜，其反射光源装置发射的激发光同时透过所述数字PCR芯片受激产生的荧光。
优选的是，其中，聚焦装置还包括：
第一聚焦透镜组件，其设于所述光源装置与所述第二分色镜之间，用于整形和扩束所述激光，从而获得较好的激发光。
优选的是，其中，聚焦装置还包括：
第二聚焦透镜组件，其设于所述第二分色镜与所述成像装置之间，用于整形和扩束所述荧光，从而获得较好的成像质量。
优选的是，其中，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括荧光滤除组件和荧光成像透镜；
优选的是，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括单个荧光滤光组件和荧光成像透镜；
其中，所述荧光滤光组件固设于所述荧光检测光路，所述荧光滤光组件具有：
光源阻光片，其滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
荧光滤光片，其滤除非所述荧光波长的杂散光。
优选的是，其中，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括若干个荧光滤光组件和荧光成像透镜；
其中，若干个所述荧光滤光组件包括：
若干个不同波长的光源阻光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
若干个不同波长的荧光滤光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除非所述荧光波长的杂散光。
本技术方案通过光源装置激发光和非所述荧光波长杂散光的滤除，可提高***的信噪比，通过若干个不同波长的光源阻光片和荧光滤光片之间的组合切换，可采集PCR微滴散发的不同波长的荧光图像，实现多重数字PCR功能。
本发明的目的还可以进一步由大面积数字PCR微滴荧光高通量检测的方法来实现，该方法包括如下步骤：
步骤1：将已完成微滴处理的数字PCR芯片放置在载物台，所述数字PCR芯片与温控装置相接；
步骤2：进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3：将物镜装置切换至最低倍率物镜；
步骤4：将光源装置、成像装置切换至第一荧光染料或探针对应的光路；
步骤5：对所述数字PCR芯片的水平两维度进行等分，得到若干矩形或长方形区域，每个区域面积为S，并对每个区域进行微滴荧光图像获取，其中所述S为1mm2～16mm2；
步骤6：将光源装置、成像装置切换至第二荧光染料或探针对应的光路，再次执行所述步骤5，完成第二荧光染料的图像的检测；
步骤7：重复所述步骤6，直至所有荧光染料或探针均已探测完毕；
步骤8：将物镜装置切换至次低倍率物镜，重复所述步骤4、步骤5、步骤6和步骤7；
步骤9：重复所述步骤8，直至物镜的所有倍率的切换完毕，所有荧光染料探测完毕；
步骤10：重复步骤2～步骤9，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N，其中N代表扩增循环次数，所述N为30～40次；
步骤11：完成测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
优选的是，其中，在所述步骤5中，
将所述数字PCR芯片在水平方向上的任一维度进行等分，得到若干宽度为W的长条状检测区域，连续扫描所述长条状检测区域，获取每一条检测区域的连续图像，对数字PCR微流控芯片图像进行连续获取，其中，所述宽度W为1mm～3mm。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明可以实现高通量、高灵敏度、高特异性的实时数字qPCR检测，对于提高数字PCR检测仪器性能和精度、通量具有重要意义。利用本发明技术方案，可以对低浓度的核酸样本进行快速高精度检测，对于癌症肿瘤、传染疾病、产前诊断等具有重要的意义，对于改善人们检测精度和期限、提高医疗检测技术、改进临床检测方法具有很重要的意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为一实例中一体化数字PCR芯片的结构示意图；
图2为另一实例中一体化数字PCR芯片的结构示意图；
图3为另一实例中高通量一体化数字PCR芯片结构示意图(48阵列)；
图4为另一实例中大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构框图；
图5为另一实例中大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图6为另一实例中具有一维运动机构载物台装置的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图7为另一实例中具有两维运动机构载物台装置的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图8为另一实例中具有多个不同倍率物镜切换装置的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图9为具有光源滤光片切换机构的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图10具有多个单色光源组的的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图11为另一实例中具有激发光聚焦透镜组件的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图12为另一实例中具有荧光聚焦透镜组件的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图13为另一实例中同时具有激发光和荧光聚焦透镜组件的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图14为另一实例中具有荧光滤光组件切换机构的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图15为另一实例中数字PCR芯片被两维等分成矩形检测区域的示意图；
图16为另一实例中数字PCR芯片被一维等分成长条状检测区域的示意图；
图17为另一实例中用于两重数字PCR的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图18为另一实例中用于六重数字PCR的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置结构示意图；
图19为另一实例中光源滤光片固定装置的结构示意图；
图20为另一实例中成像装置中荧光滤光片固定装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
参照图4和图5，作为本发明的一种实现形式，大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置包括：
物镜装置200，其位于数字PCR芯片正上方，用于整个数字PCR荧光图像采集的最前端；
光源装置300，用于数字PCR微滴的荧光激发；
聚焦装置400，其一方面将光源装置300发来的光汇聚到数字PCR芯片1上，另一方面将数字PCR芯片1产生的荧光收集，并传向成像光路装置500和图像采集传感器600，从而用于光源照明与荧光成像的耦合；
成像光路装置500，其用于将荧光图像进行整形和滤光，并将之成像与图像采集传感器上600，从而用于数字PCR微滴的荧光成像；
图像采集传感器600，其用于对荧光图像的获取和转换成数字化图像，对数字PCR微滴的荧光图像实时采集。
PCR温控装置700，其用于对数字PCR芯片1进行精确的温度循环控制，实现微滴数字PCR的扩增过程；以及，
载物台装置800，其用于承载数字PCR微滴微流控芯片及其温控装置。
在这种技术方案中，包括荧光激发光路和荧光检测光路；
沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；
沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；
其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。
通过向数字PCR反应体系添加多种荧光染料或探针，配合不同mix、引物，可以实现多重数字PCR。其中，PCR重数与添加的荧光染料或探针的种类相同，譬如，两重PCR，则需要两个荧光染料或探针。
另一种实例中，所述载物台固定设于光路路径上，或至少具有一个平移自由度，以实现一维或二维扫描方式进行图像采集，从而扩大检测区域。
参照图6，在实现载物台一维自由度的一种实施方式中，载物台装置800包括伺服电机803、传动装置802、位置检测装置806，以实现对载物台801的水平X方向上一维精密运动控制。通过对载物台的一维运动，来实现成像***对数字PCR芯片的一维扫描检测，以提高检测范围，实现大面积高通量检测。其中，伺服电机803可以为步进伺服电机、直流伺服电机、交流伺服电机，传动装置802可以为滚珠丝杆传动装置，位置传感器可以为直线光栅编码器、电阻式位移传感器。
参照图7，在实现载物台二维自由度的一种实施方式中，载物台装置800包括一对伺服电机803和805，一对传动装置802和804，一对位置检测装置806和807，以实现对载物台801的水平方向上X、Y两维精密运动控制。通过对载物台的两维运动，来实现成像***对数字PCR芯片的两维扫描检测，以提高检测范围，实现大面积高通量检测。
另一种实例中，所述物镜装置包括一个物镜，其固定设于光路中。
另一种实例中，所述物镜装置包括若干个不同倍率的物镜，其以可切换的形式分别被配置至光路中。
参照图8，可实现不同倍率物镜自动切换的一种实施方式为：物镜装置200包含伺服电机205、传动装置204、转动铰链203、物镜固定板202、一组物镜201和图中没有绘出的控制单元。其中，物镜201在物镜固定板202上以转动铰链203为中心等径分布。伺服电机205通过传动装置204、转动铰链203，可以带动物镜固定板202进行旋转运动，进而可以将所需要的放大倍率物镜切换至光路中聚焦装置400前端。其中，伺服电机205可以为步进伺服电机、直流伺服电机、交流伺服电机，传动装置204可以为带轮传动装置、齿轮传动装置等，转动铰链203可以为旋转轴承。采用这种方案可通过自动化切换实现不同放大倍率的微滴荧光图像获取。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求实施物镜不同的切换态样。
另一种实例中，所述物镜的倍率选自2X、4X、5X或10X。
另一种实例中，参照图9，所述光源装置300包括：
光源组件，其通过混合光源发射部件301和凸镜302，提供平行混合光源；
光源滤光片组件，其具有：
一个光源滤光片303，其固定设于所述荧光激发光路中，或
若干个光源滤光片303，其以可切换的形式分别配置至所述荧光激发光路中。
在该技术方案中，实现不同波长光源滤光片自动切换的实施方式为：光源装置300由卤素灯301、透镜302、一系列滤光片303、滤光片固定板305、转动铰链304、传动装置306、伺服电机307和控制单元(图中未画出)组成。透镜302用于将光源301发出的光进行准直，形成平行光束。伺服电机307通过传动装置306和转动铰链304带动滤光片固定板305做旋转运动，将不同波长的滤光片303切换至透镜302前端，实现光源装置300不同波长的单色光输出。其中，传动装置306可以为带轮传动、齿轮传动，转动铰链304可以为旋转动铰链承。伺服电机可以为步进伺服电机、直流伺服电机或交流伺服电机。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求实施光源滤光片的不同切换态样。
另一种实例中，参照图10，所述光源装置300包括若干个单色光源组；
沿光路前进方向，所述单色光源组依次包括：单色光源301、快门308和光源透镜302；其中，所述快门308通断控制所述荧光激发光路。
另一实例中，所述光源装置300包括：
两个及以上单色光源组；
若干个第一分色镜309，其将所述单色光源组的发射光路合束并导入所述荧光激发光路。
在该实施方式中，光源装置300由多个单色光源301、透镜302、快门308、第一分色镜309组成。其中，每个光源301都对应一个快门308，用于控制该光源的通断。第一分色镜309用于实现两束光的合束，第一分色镜309的数量为光源301数量减1，实现所有光源发出的光的合束。通过快门308控制哪路单色光输出和引入***。光源可以为激光源、LED等，但不限于此。
另一实例中，参照图5，聚焦装置包括：
第二分色镜，其反射光源装置发射的激发光同时透过所述数字PCR芯片受激产生的荧光。
在该实施方式中，聚焦装置400仅包含一个第二分色镜401，第二分色镜401一方面用于将光源***300发来的光反射至数字PCR芯片1上，对数字PCR液滴进行激发；另一方面用于透过数字PCR芯片上液滴产生的荧光，并使之进入成像装置500。
另一实例中，参见图11，聚焦装置400还包括：
第一聚焦透镜组件，其包含透镜402和透镜403，第一聚焦透镜组件设于所述光源装置300与所述第二分色镜401之间，用于将光源装置300发来的光进行准直和扩束，以改变激发光斑尺寸和质量。
另一实例中，参见图12，聚焦装置还包括：
第二聚焦透镜组件，其包含透镜404和透镜405，第二聚焦透镜组件对经过物镜装置200发来的荧光进行准直和扩束，与成像透镜501配合，提高成像质量。
另一实例中，参见图13，聚焦装置还同时包含透镜402、透镜403、透镜404和405，改变激发光斑尺寸，提高成像质量。
另一实例中，沿所述荧光检测光路，所述成像装置500依次包括单个荧光滤光组件和荧光成像透镜501；
其中，所述荧光滤光组件固设于所述荧光检测光路，所述荧光滤光组件具有：
光源阻光片，其滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
荧光滤光片，其滤除非所述荧光波长的杂散光。
另一实例中，参照图14，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括荧光滤光组件和荧光成像透镜501；
其中，所述荧光滤光组件包括：
若干个不同波长的光源阻光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
若干个不同波长的荧光滤光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除非所述荧光波长的杂散光。
在该实施方式中，成像装置500包含多组滤光片(每组滤光片包括一个光源阻光片和一个荧光滤光片)，和用于各组滤光片之间切换的滤光片固定板505、转动铰链504、传动装置506、伺服电机507，和控制单元(图中未画出)。伺服电机507通过传动装置506和转动铰链505带动位于滤光片固定板505上的滤光片502和滤光片503做旋转运动，将所需的任一组滤光片502和滤光片503切换至图像采集传感器700前端，实现激发光的滤除和所需荧光波段的采集。所述的成像装置中各组滤光片502和滤光片503与激发光源发出的各单色光相集合，可以实现不同染料的数字PCR荧光激发与探测，进而实现多重数字PCR。
另一实例中，一种实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测的方法，包括如下步骤：
步骤1)，放置已经完成数字PCR微滴生成的微流控芯片1至载物台801，与PCR温控装置700相接。
步骤2)，进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3)，物镜装置200切换至最低倍率物镜；
步骤4)，光源装置、成像装置切换至第一染料或探针对应的光路。
步骤5)，参见图15，将数字PCR微流控芯片1在水平两垂直方向上X、Y进行等分，为若干矩形或长方形区域101，每个区域具有长L和宽W，并对每个区域进行微滴荧光图像获取。所述长L为1mm～4mm，所述宽W为1mm～4mm；
步骤6)，光源装置300、成像装置500切换至下一染料对应的光路。再次执行步骤5)，完成下一荧光染料或探针的图像的检测；
步骤7)，重复步骤6)，直至所有荧光染料或探针探测完毕；
步骤8)，物镜装置200切换至次低倍率物镜；重复步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤7)；
步骤9)，重复步骤8)，直至所有倍率的物镜切换完毕，所有荧光染料或探针探测完毕；
步骤10)，重复步骤2)～步骤9)，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N；所述N代表扩增循环次数，为30～40；
步骤11)，完成全部测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
另一实例中，一种实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测的方法，包括如下步骤：
步骤1)，放置已经完成数字PCR微滴生成的微流控芯片1至载物台801，与PCR温控装置700相接。
步骤2)，进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3)，物镜装置200切换至最低倍率物镜；
步骤4)，光源装置、成像装置切换至第一染料或探针对应的光路。
步骤5)，参见图16，将数字PCR芯片在水平方向上的一个维度进行等分，等分为一系列宽度为W的长条状检测区域，通过连续扫描方式，获取每一条检测区域的连续图像，对数字PCR微流控芯片图像进行连续获取，所述宽度W为1mm～3mm；
步骤6)，光源装置300、成像装置500切换至下一染料对应的光路。再次执行步骤5)，完成下一荧光染料或探针的图像的检测；
步骤7)，重复步骤6)，直至所有荧光染料或探针探测完毕；
步骤8)物镜装置200切换至次低倍率物镜；重复步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤7)；
步骤9)，重复步骤8)，直至所有倍率的物镜切换完毕，所有荧光染料或探针探测完毕；
步骤10)，重复步骤2)～步骤9)，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N；所述N代表扩增循环次数，为30～40；
步骤11)，完成全部测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
<实例1>
所需检测的数字PCR微流控芯片参数为：实现两重数字PCR，使用第一染料和第二染料，激发波长分别为488nm、532nm，荧光波长分别为515nm和560nm，微滴数字PCR微流控芯片集成有48个单样品检测结构，整体芯片长150mm，宽100mm。
参见图17，针对此芯片，提出一种用于单层平铺的数字PCR液滴的实时荧光图像获取装置，包括：
物镜装置200，包含4X和10X放大倍率的两个物镜2011、2012；
光源装置300，用于数字PCR微滴的荧光激发，包括两个激光器3011、3012，两组快门3081、3082，两组透镜3021、3022，和一二色镜3091；其中，激光器3011波长为488nm，激光器3012波长为532nm，透镜3021、3022具有前端焦距50mm，后端焦距47mm。
聚焦装置400，用于光源照明与荧光成像的耦合，包括二色镜401、两组透镜402、403、404、405；透镜402、403将光源发来的光进行扩束，使之形成直径3mm圆光斑照射至数字PCR微滴微流控芯片上；透镜404、405将从数字PCR微滴微流控芯片上散发的荧光整形，与成像光路相结合，使之成为直径2mm图像照射至图像采集传感器700上。
成像光路装置500，用于数字PCR微滴的荧光成像，包括两组滤光片5021、5031、5022、5032；和汇聚透镜501、滤光片固定板505、转动铰链504、传动装置506、伺服电机507组成。其中，滤除光源波长的滤光片5031、5032分别为长波通滤光片，截止频率分别为500nm、540nm，荧光滤光片5021、5022分别为中心波长515nm、560nm，带宽30nm滤光片，透镜501具有前端焦距50mm，后端焦距47mm；
图像采集传感器600，用于数字PCR微滴的荧光图像实时采集，为面阵CCD图像传感器；
PCR温控装置700，用于数字PCR微滴的温度循环控制，包括温度传感器702、加热的采用帕尔贴作为加热执行器704和降温执行器703、传热快701；其中，701为通过机加工形成的铝合金件，加热执行器704为加热电阻丝、降温执行器703为风扇，温度传感器702为热电偶传感器。
载物台装置，用于承载数字PCR微滴微流控芯片及其温控装置，包括载物台801，伺服电机803、805，传动装置802、804，位置传感器806、807。其中，伺服电机803、805为两相四线步进伺服电机，传动装置802、804为滚珠丝杆结构，行程分别为200mm和150mm，位置传感器806、807为直线光栅编码器，量程为200mm和150mm，精度0.01mm。
具体检测过程如下：
步骤1)，放置已经完成数字PCR微滴生成的微流控芯片至载物台，与PCR温控装置相接。
步骤2)，进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3)，物镜装置切换至最低倍率物镜；
步骤4)，光源装置、成像装置切换至第一染料对应的光路。
步骤5)，将数字PCR微流控芯片在水平两垂直方向上进行等分，为若干矩形或长方形区域，每个区域面积为S，并对每个区域进行微滴荧光图像获取。所述矩形区域为宽2mm的正方形；
步骤6)，光源装置、成像装置切换至下一染料对应的光路。再次执行步骤5)，完成下一荧光染料的图像的检测；
步骤7)，重复步骤6)，直至所有荧光染料均已探测完毕；
步骤8)，物镜装置切换至次低倍率物镜；重复步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤7)；
步骤9)，重复步骤8)，直至所有倍率的物镜切换完毕，所有荧光染料探测完毕；
步骤10)，重复步骤2)～步骤9)，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N；所述N代表扩增循环次数，为30～40；
步骤11)，完成全部测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
<实例2>
所需检测的数字PCR微流控芯片参数为：六重数字PCR，所用染料分别为：
荧光染料1：激发波长390nm，荧光波长420nm；
荧光染料2：激发波长475nm，荧光波长522nm；
荧光染料3：激发波长525nm，荧光波长577nm；
荧光染料4：激发波长572nm，荧光波长628nm；
荧光染料5：激发波长630nm，荧光波长675nm；
荧光染料6：激发波长650nm，荧光波长710nm；
微滴数字PCR微流控芯片集成有48个单样品检测结构，整体芯片长150mm，宽100mm。针对此芯片，参见图18，提出一种用于单层平铺的数字PCR液滴的实时荧光图像获取装置，包括：
物镜装置200，包含4X和10X放大倍率的两个物镜2011、2012；
光源装置300，用于数字PCR微滴的荧光激发，包括卤钨灯光源301，透镜302，滤光片固定板305、转动铰链3041、传动装置306、伺服电机307，和位于滤光片固定板305上的滤光片3031、3032、3033、3034、3035、3036，见图19。滤光片中心波长分别为390nm、475nm、525nm、572nm、630nm、650nm，带宽20nm；其中，透镜302具有前端焦距50mm，后端焦距47mm。伺服电机307为两相四线步进伺服电机，传动装置306为带轮传动机构，转动铰链为转动轴承；
聚焦装置400，用于光源照明与荧光成像的耦合，包括二色镜401、两组透镜402、403、404、405；透镜402、403将光源发来的光进行扩束，使之形成直径3mm圆光斑照射至数字PCR微滴微流控芯片上；透镜404、405将从数字PCR微滴微流控芯片上散发的荧光整形，与成像光路相结合，使之成为直径2mm图像照射至图像采集传感器700上。
成像光路装置500，用于数字PCR微滴的荧光成像，参见图20包括滤除光源波长的带阻滤光片5021、5022、5053、5024、5025、5026，和透过微滴荧光的荧光滤光片5031、5032、5033、5034、5035、5036，汇聚透镜501、滤光片固定板505、转动铰链504、传动装置506、伺服电机507组成。其中，滤除光源波长的带阻滤光片5021、5022、5053、5024、5025、5026中心波长分别为390nm、475nm、525nm、572nm、630nm、650nm，带宽20nm，荧光滤光片5031、5032、5033、5034、5035、5036中心波长分别为420nm、522nm、577nm、628nm、675nm、710nm，带宽20nm滤光片，透镜501具有前端焦距50mm，后端焦距47mm；
图像采集传感器700，用于数字PCR微滴的荧光图像实时采集，为面阵CCD图像传感器；
PCR温控装置700，用于数字PCR微滴的温度循环控制，包括温度传感器702、加热的采用帕尔贴作为加热执行器704和降温执行器703、传热快701；其中，701为通过机加工形成的铝合金件，加热执行器704为加热电阻丝、降温执行器703为风扇，温度传感器702为热电偶传感器。
载物台装置，用于承载数字PCR微滴微流控芯片及其温控装置，包括载物台801，伺服电机803、805，传动装置802、804，位置传感器806、807。其中，伺服电机803、805为两相四线步进伺服电机，传动装置802、804为滚珠丝杆结构，行程分别为200mm和150mm，位置传感器806、807为直线光栅编码器，量程为200mm和150mm，精度0.01mm。
具体检测过程如下：
步骤1)，放置已经完成数字PCR微滴生成的微流控芯片至载物台，与PCR温控装置相接。
步骤2)，进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3)，物镜装置切换至最低倍率物镜；
步骤4)，光源装置、成像装置切换至第一染料对应的光路。
步骤5)，将数字PCR芯片在水平方向上的一个维度进行等分，等分为一系列宽度为W的长条状检测区域，通过连续扫描方式，获取每一条检测区域的连续图像，对数字PCR微流控芯片图像进行连续获取。所述宽度W为2mm；
步骤6)，光源装置、成像装置切换至下一染料对应的光路。再次执行步骤5)，完成下一荧光染料的图像的检测；
步骤7)，重复步骤6)，直至所有荧光染料均已探测完毕；
步骤8)，物镜装置切换至次低倍率物镜；重复步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤7)；
步骤9)，重复步骤8)，直至所有倍率的物镜切换完毕，所有荧光染料探测完毕；
步骤10)，重复步骤2)～步骤9)，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N；所述N代表扩增循环次数，为30～40；
步骤11)，完成全部测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置及方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (14)

1.一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，包括荧光激发光路和荧光检测光路；
沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；
沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；
其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。
2.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述载物台固定设于光路路径上，或至少具有一个平移自由度。
3.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述物镜装置包括：
一个物镜，其固定设于光路中；
或若干个不同倍率的物镜，其以可切换的形式分别被配置至光路中。
4.如权利要求3所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述物镜的倍率选自2X、4X、5X或10X。
5.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述光源装置包括：
光源组件，其提供平行混合光源；
光源滤光片组件，其具有：
一个光源滤光片，其固定设于所述荧光激发光路中，或
若干个光源滤光片，其以可切换的形式分别被配置至所述荧光激发光路中。
6.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述光源装置包括若干个单色光源组；
沿光路前进方向，所述单色光源组依次包括：单色光源、快门和光源透镜；其中，所述快门通断控制所述荧光激发光路。
7.如权利要求6所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述光源装置包括：
至少两个单色光源组；
若干个第一分色镜，其将所述单色光源组的发射光路合束并导入所述荧光激发光路中。
8.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，聚焦装置包括：
第二分色镜，其反射所述光源装置发射的激发光同时透过所述数字PCR芯片受激产生的荧光。
9.如权利要求8所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，聚焦装置还包括：
第一聚焦透镜组件，其设于所述光源装置与所述第二分色镜之间，用于整形和扩束所述激光。
10.如权利要求9所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，聚焦装置还包括：
第二聚焦透镜组件，其设于所述第二分色镜与所述成像装置之间，用于整形和扩束所述荧光。
11.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括单个荧光滤光组件和荧光成像透镜；
其中，所述荧光滤光组件固设于所述荧光检测光路，所述荧光滤光组件具有：
光源阻光片，其滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
荧光滤光片，其滤除非所述荧光波长的杂散光。
12.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括若干个荧光滤光组件和荧光成像透镜；
其中，若干个所述荧光滤光组件包括：
若干个不同波长的光源阻光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除所述光源装置发射的激发光；以及，
若干个不同波长的荧光滤光片，其以可切换的形式分别配置至所述荧光检测光路，以分别滤除非所述荧光波长的杂散光。
13.一种应用如权利要求1-12中任一项所述检测装置实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将已完成微滴处理的数字PCR芯片放置在载物台，所述数字PCR芯片与温控装置相接；
步骤2：进行一次PCR温度循环，过程为：升温至92～96度，停留25～40s，降温至53～57度，停留25～35s，升温至70～74度，停留35～45s；
步骤3：将物镜装置切换至最低倍率的物镜；
步骤4：将光源装置、成像装置切换至第一荧光染料或探针对应的光路；
步骤5：对所述数字PCR芯片的水平两维度进行等分，得到若干矩形或长方形区域，每个区域面积为S，并对每个区域进行微滴荧光图像获取，其中所述S为1mm2～16mm2；
步骤6：将光源装置、成像装置切换至第二荧光染料或探针对应的光路，再次执行所述步骤5，完成第二荧光染料的图像的检测；
步骤7：重复所述步骤6，直至所有荧光染料或探针均已探测完毕；
步骤8：将物镜装置切换至次低倍率物镜，重复所述步骤4、步骤5、步骤6和步骤7；
步骤9：重复所述步骤8，直至物镜的所有倍率的切换完毕，所有荧光染料探测完毕；
步骤10：重复步骤2～步骤9，并计数，每重复一次，计数一次，直至计数大于N，其中N代表扩增循环次数，所述N为30～40次；
步骤11：完成测试，进行后续图像处理和每个数字PCR液滴的qPCR计算，统计阴性阳性微滴个数，并计算浓度。
14.如权利要求13所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测的方法，其特征在于，在所述步骤5中，
将所述数字PCR芯片在水平方向上的任一维度进行等分，得到若干宽度为W的长条状检测区域，连续扫描所述长条状检测区域，获取每一条检测区域的连续图像，对数字PCR微流控芯片图像进行连续获取，其中，所述宽度W为1mm～3mm。
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