CN109640972B - 用于治疗神经退行性病症的修饰肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经退行性病症，特别是涉及用于治疗所述病状例如阿尔茨海默病的新型肽、肽模拟物、组合物、疗法和方法。

Description

用于治疗神经退行性病症的修饰肽
本发明涉及神经退行性病症，特别是涉及用于治疗所述病状例如阿尔茨海默病的新型肽、肽模拟物、组合物、疗法和方法。
本发明人先前曾提出，神经退行性过程是一个异常激活的发展过程。为了支持这一假说，实际上已报道了阿尔茨海默病患者大脑中的脑干‘中枢’神经元肥大(Bowser等,1997,《大脑病理学》(Brain Pathol.)7:723-30)。如果此中枢大面积受损，就会出现一种以上的神经退行性疾病，如同常见但尚未得到解释的阿尔茨海默病和帕金森病共同病变的病例中所出现的情况。有趣的是，尽管神经递质的异质性，但全局神经元易受伤害中枢内的所有神经元都含有熟悉的乙酰胆碱酯酶(AChE)。因此，AChE存在于其将无法执行其正常功能的神经元中，因为诸如去甲肾上腺素能蓝斑、多巴胺能黑质或5-羟色胺能中缝核的细胞亚群在任何情况下均不包含常见的底物乙酰胆碱。另一个意想不到的与其正常酶作用的偏差是，AChE实际上是从全局神经元释放出来的，推测它本身就是某种细胞间信使。一般而言，AChE现已广泛公认为一种信号分子，其在神经组织和非神经组织中的多种情况下具有营养活性。
本发明人先前已经证实，独立于其酶作用而作为营养剂起作用的AChE的确触发钙进入神经元。因此，在全局神经元中，AChE可能具有沿着营养毒性轴排列的双重非经典作用，这取决于数量、可用性持续时间和最为重要的年龄。如果标准神经元在成年期受损，如在中风时，则其它神经元会在功能上进行补偿。相比之下，全局神经元会通过调用其营养资源来尝试再生。但是，由于随后的钙内流在较老的成熟细胞中是致命的，因此，所造成的损伤将触发在以神经退化为特征的恶性循环中进行补偿的进一步尝试。
乙酰胆碱酯酶(AChE)在不同的发育阶段以不同的形式表达，所有这些都具有相同的酶活性，但是其分子组成迥然不同。‘尾部’(T-AChE)在突触处表达，并且本发明人先前已经鉴定出两种可以从C末端切割的肽，一种称为“T14”，其在被称为“T30”的另一种肽内，并且这两种肽与β淀粉样蛋白的类似区域具有很强的序列同源性。AChE C末端肽“T14”已经被鉴定为AChE分子中负责其非水解作用范围的突出部分。合成的具14个氨基酸的肽类似物(即“T14”)，以及随后其嵌入的更大、更稳定和更有效的氨基酸序列(即“T30”)显示出与对于‘非胆碱能’AchE所报道相类似的作用，其中T30序列内的惰性残基(即“T15”)不起作用。
T14和T30的急性作用是：它们(i)在从毫秒到小时的时间尺度上调节钙进入脑切片中的神经元；(ii)损害PC12细胞以及神经元器官型体外培养物中的细胞活力；(iii)调节‘补偿性’钙诱导的AChE从神经元和PC12细胞的释放；(iv)激活***中和脑切片中的神经元中的钙电流；(v)与淀粉样蛋白在毒性效应中协同作用；以及(vi)参与淀粉样前体蛋白的产生和β淀粉样蛋白(Aβ)肽的释放。T14和T30的慢性作用是：它们(i)减少神经元生长；(ii)诱导细胞凋亡；(iii)增加AChE释放；(iv)结合并调节α7烟碱受体(α-7nChR受体)；以及(v)增强α7受体在细胞表面上的表达超过24小时，从而提供进一步毒性的前馈机制。
由于T14和T30在诱导毒性方面比β淀粉样蛋白更具选择性，并且还协同淀粉样蛋白加剧毒性，因此，已经假设阻断T14或T30毒性作用的任何药剂也会降低淀粉样蛋白的较小选择性和后续毒性作用。本发明人先前已证实，T30和T14肽与α7烟碱受体上的变构位点结合，以诱导一系列营养毒性作用。这种受体在大脑发育的关键时期与AChE共表达，以及在成年大脑中显示紧密平行的分布，并且是大脑中最强大的钙离子载体之一。其也可独立于胆碱能传递发挥作用，因为胆碱(来自饮食)可以用作替代性主要配体。此外，这种受体已经作为阿尔茨海默病的当前疗法加兰他敏(Reminyl(RTM))的靶标之一，并且与淀粉样蛋白的作用有关。
然而，加兰他敏疗效的有限性已被证实，而其它α7烟碱乙酰胆碱受体拮抗剂仍在临床试验阶段。加兰他敏不仅对其它受体有非特异性作用，而且抑制AChE，但是，与T30和T14相比，其对α7烟碱受体的亲和力较低(即仅10μM)，而T30和T14对α7烟碱受体的亲和力要高得多(即5nM)。因此，在阿尔茨海默病大脑中，如果T30肽的内源性等效物已经占据了相应的受***点，则加兰他敏将需要以非生理性的高剂量给药，这存在不可避免的副作用，并且最重要的是，疗效值得怀疑。
在WO 2005/004430中，本发明人先前已证实，包含源自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C末端的氨基酸序列的环状多肽在体外选择性抑制AChE和/或其末端肽的非经典效应(即，AChE独立于其酶活性的作用)末端，因此可用于治疗神经退行性病症。例如，称为“NBP14”的环状肽(即环状T14肽)已证实极具活性，因为其作为α7烟碱受体的变构调节剂，可拮抗AChE肽和β淀粉样蛋白的作用。已证实，其能保护细胞免于线性T14、T30和β淀粉样蛋白的毒性作用，并且其阻断由线性T14和T30毒性引起的代偿性AChE释放。此外，它们观察到单独使用环状NBP14对大鼠脑切片中的Ca2+浓度没有显著影响，但阻断了β淀粉样蛋白的作用。然而，尽管环状NBP14表现出活性，但由于其大小，对其穿越血脑屏障用作治疗剂的能力有一些担忧。
因此，目前需要提供改进的药物来治疗神经退行性病症，如阿尔茨海默病和帕金森病。
本发明人继续其在WO 2005/004430中所描述的先前工作，其中，他们证实环状NBP-14可防止T30毒性作用和β淀粉样蛋白的产生。他们执行了一项计算机模拟研究来设计新型肽和肽模拟物，这些肽和肽模拟物展现对于α-7nChR受体的亲和力，并且因此可阻断内源性毒性T30肽与其活性位点的结合。在分析了大量可能的候选化合物后，通过考察受体和环状NBP-14之间的相互作用，现已确定与防止T30毒性作用和β淀粉样蛋白产生相关的化学官能团。基于这些实验，本发明人设计、合成并测试了几种候选化合物，这些化合物已证实对治疗神经退行性病症具有惊人的疗效。
根据本发明的第一方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物：
Figure GDA0004076375090000041
/>
Figure GDA0004076375090000051
其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000061
Figure GDA0004076375090000062
R3是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000063
Figure GDA0004076375090000064
R5是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R4和R5与其所键合的氮和碳一起形成被-OH或-NH2取代的五元环；
R6是
Figure GDA0004076375090000065
Figure GDA0004076375090000066
R7是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H；C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000067
X1是-NR9R10、-OH或
Figure GDA0004076375090000068
所述或每个R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R11是-NH2、-OH或芳基；
所述或每个m独立地介于0和5之间；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式，其用于疗法中。
如实施例中所述，以及如图9、图10和图26所示，根据本发明的化合物优选配置成通过减少钙内流和/或乙酰胆碱酯酶活性来保护用其治疗的受试者免于T30肽的毒性作用。此外，根据本发明的化合物优选配置成保护受试者免于β淀粉样蛋白产生。因此，本发明人还发现，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物可用于治疗神经退行性病症。
因此，在第二方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式，其用于治疗、改善或预防神经退行性病症。
此外，在第三方面，提供了一种治疗、改善或预防神经退行性病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
所治疗的神经退行性病症优选是以‘全局’神经元损伤或死亡为特征的病症。例如，神经退行性病症可选自阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿氏病；运动神经元疾病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；精神***症；路易体痴呆；和额颞叶痴呆。
优选的是，所治疗的神经退行性病症是阿尔茨海默病、帕金森病或运动神经元疾病。最优选的是，用根据第一方面的肽、其衍生物或类似物治疗的神经退行性病症是阿尔茨海默病。
应理解，术语“盐”是指本文提供的化合物的任何盐，该盐保留了所述化合物的生物特性且无毒，否则不适用于药物用途。这些盐可能衍生自本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子。这些盐包括但不限于：(1)与有机酸或无机酸形成的酸加成盐，所述酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚糖、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸和类似酸；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子(a)被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)或碱金属或碱土金属氢氧化物(例如钠、钾、钙、镁、铝、锂、锌和钡氢氧化物)、氨置换，或者(b)与有机碱配位时所形成的碱加成盐，所述有机碱例如脂族、脂环族或芳族有机胺，如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲基铵等。
盐可以进一步包括(仅作为示例)但不限于钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当所述化合物含有碱性官能团时，则包括无毒有机或无机酸的盐，如氢卤化物(例如盐酸盐和氢溴酸盐)、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、乙醇酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate/mesylate)、乙磺酸盐、1,2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate/besylate)、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基醋酸盐、叔丁基醋酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎宁酸盐、粘康酸盐等。
应理解，术语“溶剂化物”是指本文提供的化合物或其盐，其进一步包括化学计量或非化学计量的由非共价分子间力结合的溶剂。当溶剂是水时，溶剂化物是水合物。
应理解，芳基是指从芳环衍生的取代基。芳基可以是C6-C12芳基。优选的是，芳基是苯基、联苯基或萘基。
最优选的是，所述化合物具有式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)：
Figure GDA0004076375090000101
/>
Figure GDA0004076375090000111
或者，所述化合物可具有式(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(IVb)、(Vb)或(VIb)：
Figure GDA0004076375090000112
/>
Figure GDA0004076375090000121
R1可以是-OH。然而，优选R1是-NR9R10，更优选R1是-NR9H，最优选R1是-NH2。
优选的是，在实施方案中，如果R2是
Figure GDA0004076375090000122
Figure GDA0004076375090000123
则n优选介于1和5之间。因此，n可能是1、2、3、4或5，最优选n是1。
优选的是，在实施方案中，如果R2是
Figure GDA0004076375090000124
Figure GDA0004076375090000125
则n介于1和7之间，更优选介于2和6之间。因此，n可能是2、3、4、5或6，优选n是3或4，最优选n是4。
优选的是，R2是
Figure GDA0004076375090000131
Figure GDA0004076375090000132
更优选的是，R2是
Figure GDA0004076375090000133
/>
应理解，在实施方案中，如果R2是
Figure GDA0004076375090000134
则m可能是0、1、2、3、4或5。优选的是，m是1。优选的是，X1处于对位。
在一个优选的实施方案中，R2是
Figure GDA0004076375090000135
Figure GDA0004076375090000136
优选的是，在实施方案中，如果R2是
Figure GDA0004076375090000137
则R9或R10中的至少一个是-H，最优选R9或R10都是-H。
优选的是，在实施方案中，如果R2是
Figure GDA0004076375090000138
则R11是芳基，最优选是苯基。
在一个优选的实施方案中，R2是
Figure GDA0004076375090000141
Figure GDA0004076375090000142
在一个最优选的实施方案中，R2是
Figure GDA0004076375090000143
Figure GDA0004076375090000144
应理解，R3可能是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。优选的是，R3是甲基。然而，在一个更优选的实施方案中，R3是-H。
在实施方案中，如果R4是
Figure GDA0004076375090000145
则n优选介于1和5之间。因此，n可能是1、2、3、4或5，优选n是1。
在实施方案中，如果R4是
Figure GDA0004076375090000146
Figure GDA0004076375090000147
则n优选介于1和7之间，更优选介于2和6之间。因此，n可能是2、3、4、5或6，优选n是3或4。
在一个实施方案中，R4优选是
Figure GDA0004076375090000148
Figure GDA0004076375090000149
更优选的是，R4是
Figure GDA0004076375090000151
应理解，在实施方案中，如果R4是
Figure GDA0004076375090000152
则m可能是0、1、2、3、4或5。优选的是，m是1。优选的是，X1处于对位。
优选的是，R4是
Figure GDA0004076375090000153
Figure GDA0004076375090000154
更优选的是，R4是
Figure GDA0004076375090000155
优选的是，在实施方案中，如果R4是
Figure GDA0004076375090000156
则R9或R10中的至少一个是-H，最优选R9或R10都是-H。/>
因此，R4优选是
Figure GDA0004076375090000157
更优选的是，R4是
Figure GDA0004076375090000158
Figure GDA0004076375090000159
应理解，R5可能是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。优选的是，R5是甲基。然而，在一个更优选的实施方案中，R5是-H。
在一个替代实施方案中，R4和R5与其所键合的氮和碳一起形成被-OH或-NH2取代的五元环。因此，R4和R5与其所键合的氮和碳一起可限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000161
其中X2是-OH或-NH2。
优选的是，R4和R5与其所键合的氮和碳一起可限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000162
优选的是，R4和R5与其键合的氮和碳一起可限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000163
更优选的是，R4和R5与其所键合的氮和碳一起可限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000164
优选的是，X2是-NH2。
甚至更优选的是，R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000165
/>
甚至更优选的是，R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000171
最优选的是，R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000172
在实施方案中，如果R6是
Figure GDA0004076375090000173
Figure GDA0004076375090000174
则n优选介于1和5之间。因此，n可能是1、2、3、4或5，优选n是1。
在实施方案中，如果R6是
Figure GDA0004076375090000175
Figure GDA0004076375090000176
则n优选介于1和7之间，更优选介于2和6之间。因此，n可能是2、3、4、5或6，优选n是3或4，最优选n是3。
优选的是，R6是
Figure GDA0004076375090000177
Figure GDA0004076375090000178
更优选的是，R6是
Figure GDA0004076375090000181
应理解，在实施方案中，如果R6是
Figure GDA0004076375090000182
则m可能是0、1、2、3、4或5。优选的是，m是0。更优选的是，m是1。优选的是，X1处于对位。/>
在一个优选的实施方案中，R6是
Figure GDA0004076375090000183
Figure GDA0004076375090000184
优选的是，在实施方案中，如果R6是
Figure GDA0004076375090000185
则R9或R10中的至少一个是-H，最优选R9或R10都是-H。
优选的是，在实施方案中，如果R6是
Figure GDA0004076375090000186
则R11是芳基，最优选是苯基。
在一个优选的实施方案中，R6是
Figure GDA0004076375090000187
Figure GDA0004076375090000191
在一个最优选的实施方案中，R6是
Figure GDA0004076375090000192
Figure GDA0004076375090000193
应理解，R7可能是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。优选的是，R7是甲基。然而，在一个更优选的实施方案中，R7是-H。
在一个优选的实施方案中，R8是-H。然而，在一个更优选的实施方案中，R8是
Figure GDA0004076375090000194
在一个优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000195
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000196
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000201
R6是
Figure GDA0004076375090000202
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，R3是H并且R7是H。
在一些实施方案中，R3是H，R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000203
并且R7是H。
在一些替代实施方案中，R3是H，R5是H并且R7是H。
在一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000204
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000205
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R6是
Figure GDA0004076375090000211
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在一个更优选的替代实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000212
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000213
R6是
Figure GDA0004076375090000214
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H并且R7是H。
在一个更优选的替代实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000221
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000222
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R6是
Figure GDA0004076375090000223
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在另一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000224
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000231
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R6是
Figure GDA0004076375090000232
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，所述化合物是式(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(IVb)、(Vb)或(VIb)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ib)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在另一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000233
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000234
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R6是
Figure GDA0004076375090000235
并且/>
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
优选的是，R1是-OH并且R8是H。更优选的是，R1是NH2并且R8是
Figure GDA0004076375090000241
在一个甚至更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000242
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000243
Figure GDA0004076375090000244
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；或
R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000245
R6是
Figure GDA0004076375090000246
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基。
优选的是，R3是H并且R7是H。
在一些实施方案中，R3是H，R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000251
并且R7是H。
在一些替代实施方案中，R3是H，R5是H并且R7是H。
在一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000252
R3是H；
R4是
Figure GDA0004076375090000253
R5是H；或
R6是
Figure GDA0004076375090000254
并且
R7是H。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在一个更优选的替代实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000261
R3是H；
R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000262
R6是
Figure GDA0004076375090000263
并且
R7是H。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H并且R7是H。
在一个更优选的替代实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000264
R3是H；
R4是
Figure GDA0004076375090000265
R5是H；或
R6是
Figure GDA0004076375090000271
并且
R7是H。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在另一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000272
R3是H；
R4是
Figure GDA0004076375090000273
R5是H；或
R6是
Figure GDA0004076375090000274
并且
R7是H。
优选的是，所述化合物是式(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(IVb)、(Vb)或(VIb)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ib)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
在另一个更优选的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R2是
Figure GDA0004076375090000281
R3是H；
R4是
Figure GDA0004076375090000282
R5是H；或
R6是
Figure GDA0004076375090000283
并且
R7是H。
优选的是，所述化合物是式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)或(VIa)的化合物。
优选的是，所述化合物是式(I)的化合物，更优选是式(Ia)的化合物。
优选的是，R3是H，R5是H并且R7是H。
优选的是，R1是-OH并且R8是H。更优选的是，R1是NH2并且R8是
Figure GDA0004076375090000284
优选的是，所述化合物是式(101)、(102)、(103)、(104)或(105)的化合物：
Figure GDA0004076375090000291
/>
Figure GDA0004076375090000301
更优选的是，所述化合物是式(101a)、(102a)、(103a)、(104b)或(105a)的化合物：
Figure GDA0004076375090000302
/>
Figure GDA0004076375090000311
/>
Figure GDA0004076375090000321
应理解，式(101a)、(102a)、(103a)、(104b)和(105a)的化合物分别对应于实施例中所讨论的化合物Tri02-06。
据信这些化合物本质上是新颖的。
因此，根据第四方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000322
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000323
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R6是
Figure GDA0004076375090000324
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H、C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000331
R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
根据第五方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000332
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4和R5与其所键合的氮和碳一起限定以下结构：
Figure GDA0004076375090000333
R6是
Figure GDA0004076375090000334
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H、C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000335
R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
根据第六方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000341
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000342
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R6是
Figure GDA0004076375090000343
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H、C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000344
R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
根据第七方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000345
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000351
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R6是
Figure GDA0004076375090000352
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H、C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000353
R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
根据第八方面，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure GDA0004076375090000354
R3是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R4是
Figure GDA0004076375090000355
R5是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R6是
Figure GDA0004076375090000356
并且
R7是H或C1-5直链或支链烷基或烯基；
R8是-H、C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure GDA0004076375090000357
R9和R10独立地是-H或C1-5直链或支链烷基或烯基；并且
每个n独立地介于0和10之间；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式。
应理解，第四、第五、第六、第七和第八方面的化合物的R基团和式的任何定义可以如上文关于第一、第二和第三方面所述进一步限制。
在另一方面，提供了根据第四、第五、第六、第七和第八方面的化合物，其用于疗法中。
在另一个方面，提供了根据第四、第五、第六、第七和第八方面的化合物，其用于治疗、改善或预防神经退行性病症。
应理解，根据本发明的化合物可用于药物中，该药物可以用于单一疗法(即使用由第一方面限定的化合物)，用于治疗、改善或预防神经退行性病症，如阿尔茨海默病。或者，根据本发明的化合物可用作用于治疗、改善或预防阿尔茨海默病的已知疗法如乙酰胆碱酯酶抑制剂的辅助或与其组合。
根据本发明的化合物可组合成具有多种不同形式的组合物，特别取决于所述组合物的使用方式。因此，例如，所述组合物可以是散剂、片剂、胶囊剂、液体剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液或可施用于需要治疗的人或动物的任何其它适当形式。应理解，根据本发明的药物载体应当是被给予该药物的受试者良好耐受并且优选能够实现肽穿越血脑屏障递送的药物载体。
应理解，任何脑部病症治疗的效率取决于候选治疗化合物穿越血脑屏障(BBB)的能力。然而，众所周知，在阿尔茨海默病期间，血脑屏障的通透性增加，这可以使本发明化合物到达中枢神经***，实际上理想地仅在需要的变性部位，即血脑屏障受损的部位。
可以应用两种主要策略使本发明的肽穿越血脑屏障，包括：(1)使用纳米颗粒作为转运体，以特异性地靶向大脑并递送活性化合物。这种方法已成功地用于递送肽、蛋白质和抗癌药物递送到大脑；(2)使用运载肽(cargo peptide)。特异性地转运穿越血脑屏障的这种肽的添加允许通过促进方式转移本发明的化合物。
包含根据本发明的化合物的药物可以多种方式使用。例如，可能需要口服给药，在这种情况下，所述化合物可以包含在组合物中，所述组合物例如可以片剂、胶囊剂或液体剂的形式口服摄入。施用所述化合物的另一种选择是使用鼻喷雾剂，因为通过鼻喷雾剂施用肽比口服或静脉内施用方式更快且更有效地到达大脑(参见http://memoryzine.com/ 2010/07/26/nose-sprays-cross-blood-brain-barrier-faster-and-safer/)。因此，包含本发明化合物的组合物可通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可以配制成供局部使用。例如，乳膏剂或软膏剂可涂在皮肤上，例如，邻近大脑的皮肤。
根据本发明的化合物也可并入缓释或延迟释放装置中。这些装置例如可以***在皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周或甚至数月内释放。所述装置可至少邻近治疗部位(例如头部)定位。当需要用根据本发明的化合物进行长期治疗并且通常需要频繁给药(例如至少每天一次注射)时，所述装置可能特别有利。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的药物可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位而施用于受试者。例如，所述药物可以至少邻近大脑注射。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)。
应理解，所需化合物的量由其生物活性和生物利用度决定，而这又取决于施用模式、多肽的生理化学特性以及其是作为单一疗法还是联合疗法使用。施用频率也将受到所述化合物在所治疗受试者体内的半衰期的影响。最佳施用剂量可由本领域技术人员确定，并将随使用的具体化合物、药物组合物的强度、施用模式和神经退行性疾病的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其它因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和给药时间。
通常而言，视乎所使用的多肽，每日剂量为0.001μg/kg体重至10mg/kg体重的根据本发明的化合物可用于治疗、改善或预防神经退行性疾病。更优选的是，每日剂量在0.01μg/kg体重和1mg/kg体重之间，最优选在大约0.1μg/kg体重和10μg/kg体重之间。
所述化合物可在神经退行性疾病发病前、发病期间或发病后施用。每日剂量可单次给药(例如，每日单次注射或吸入鼻喷雾剂)。或者，所述化合物在一天中可能需要施用两次或更多次。例如，化合物可以每日两次(或更多次，取决于所治疗的神经退行性疾病的严重程度)按0.07μg至700mg(即，假设体重70kg)的剂量施用。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂，然后在晚上服用第二剂(如果使用两剂方案)，或者之后每隔3小时或4小时服用一次。或者，可以使用缓释装置向患者提供最佳剂量的根据本发明的化合物，而无需重复给药。
已知的程序，例如制药工业常规采用的程序(例如体内实验、临床试验等)，可用于形成本发明化合物的特定制剂和精确的治疗方案(如药剂的每日剂量和施用频率)。本发明人认为是他们基于本发明化合物的使用首次提出了抗神经退行性疾病组合物。
因此，在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，其包含根据第一方面的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式，以及药学上可接受的载体。
所述药物组合物优选为抗神经退行性疾病组合物，即用于治疗性改善、预防或治疗受试者的神经退行性病症如阿尔茨海默病的药物制剂。
在第十方面，本发明还提供了一种根据第九方面的药物组合物的制备方法，所述方法包括使治疗有效量的第一方面的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构形式或多晶型形式和药学上可接受的载体接触。
优选的是，所述化合物是式(101)、(102)、(103)、(104)或(105)的化合物。
更优选的是，所述化合物是式(101a)、(102a)、(103a)、(104b)或(105a)的化合物。
“受试者”可能是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药物可用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或可用于其它兽医应用。然而，最优选的是，受试者是人类。
化合物的“治疗有效量”是指当施用于受试者时为治疗神经退行性病症状况或产生预期效果所需的活性剂量的任何量。
例如，所用化合物的治疗有效量可以是约0.001mg至约800mg，优选约0.01mg至约500mg。化合物的量优选是约0.1mg至约100mg的量。
如本文所提及的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体可以是固体，并且组合物可以是散剂或片剂的形式。药学上可接受的固体载体可包括一种或多种物质，这些物质也可用作调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、包衣或片剂崩解剂。载体也可能是封装材料。在散剂中，载体是与根据本发明的细粉状活性剂混合的细粉状固体。在片剂中，活性剂可与具有必要压缩特性的载体以合适的比例混合，并以所需的形状和尺寸压实。所述散剂和片剂优选含有多达99％的活性剂。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方案中，药物载体可以是凝胶并且组合物可以是乳膏剂等形式。
然而，药物载体可以是液体，并且药物组合物是溶液形式。液体载体用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的活性剂可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可包含其它合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和胃肠外给药的液体载体的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇类)及其衍生物，以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于胃肠外给药，载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于无菌液体形式组合物中以进行胃肠外给药。用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其它药学上可接受的推进剂。
作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可以通过例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内并且特别是皮下注射来使用。所述化合物可以制成无菌固体组合物，其在施用时可使用无菌水、盐水或其它适当的无菌注射介质溶解或悬浮。
本发明的化合物和组合物可以无菌溶液或悬浮液的形式口服给药，所述无菌溶液或悬浮液含有其它溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、***胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其酸酐与环氧乙烷的共聚物)等。根据本发明使用的化合物也可以液体或固体组合物形式口服给药。适于口服给药的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂和散剂，以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。可用于胃肠外给药的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。
本文所述的所有特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤，均可与任何上述方面以任何组合进行组合，除非组合中这些特征和/或步骤中的至少一些是相互排斥的。
为了更好地理解本发明，以及为了示出如何实现本发明的实施方案，现在将通过举例参考附图，在附图中：-
图1a和图1b示出了与环状肽NBP-14结合的α7烟碱受体的变构结合口袋(即活性位点)中的四个关键区域(区域1、2、3和4)以及这四个区域之间的相应距离的表示的不同视图，所述距离取决于NBP-14是与T30竞争(图1a)还是与淀粉样蛋白竞争(图1b)；
图2示出了具有基于极性的彩色编码的α7烟碱受体结合口袋的3D结构；
图3示出了显示区域1-4的α7烟碱受体结合口袋的棒状图；
图4合并了图2和图3中所示的两个视图；
图5示出了在α7烟碱受体的每个结合区域(区域1、区域2、区域3或区域4)中参与结合的氨基酸或化学官能团的饼形图，并示出了残基是否导致惰性肽，其中一种对毒性T30具活性或对A-β具活性；
图6A-6F比较了不同区域(区域1-4)中结合的氨基酸之间的距离；
图7是与区域1、2、3和4中的每个结合的化学官能团的列表，这些官能团在提供针对T30毒性的保护方面具有特定的相关性；
图8是与区域1、2、3和4中的每个结合的化学官能团的列表，这些官能团在提供针对β淀粉样蛋白产生的保护方面具有特定的相关性；
图9示出肽模拟化合物1(即Tri02)的细胞培养数据(即乙酰胆碱酯酶活性)；
图10示出肽模拟化合物1(即Tri02)的细胞培养数据(即钙离子内流)；
图11示出了脑切片上对于对照环状肽NBP-14的电压敏感染料成像(VSDI)的结果；
图12示出了脑切片上对于肽模拟化合物1(即Tri02)的电压敏感染料成像(VSDI)的结果；
图13示出了在脑切片上使用电压敏感染料成像(VSDI)通过添加肽引起的变化相对于相应基线响应幅度的相关性分析。发现T30引起的响应幅度变化与其相应基线的幅度呈负相关(A)。因此，随后对灌注外源肽的每个实验进行相关性分析：B)T15、C)NBP14、D)Tri02、E)T30(在存在NBP14的情况下)和F)T30(在存在Tri02的情况下)。单位：y轴＝ΔF/F0；x轴＝ΣδF/F0；
图14示出了通过添加Tri02和T30介导的作用的量化；
图15示出了比较T30和NBP14与Tri02和T30联合应用在阻断T30对基底前脑活动作用方面的图表。NBP14联合应用能够完全阻断T30诱导的作用，而T30与Tri02引起类似但柔和的调节反应；
图16示出了环状NBP-14在大鼠血液中的药代动力学数据；
图17示出了环状NBP-14在人类血液中的药代动力学数据；
图18示出了肽模拟化合物1(即Tri02)在大鼠血液中的药代动力学数据；
图19示出了肽模拟化合物1(即Tri02)在人类血液中的药代动力学数据；
图20示出了肽模拟化合物3(即Tri04)在大鼠血液中的药代动力学数据；
图21示出了肽模拟化合物3(即Tri04)在人类血液中的药代动力学数据；
图22示出了普鲁卡因在大鼠血液中的药代动力学数据；
图23示出了普鲁卡因在人类血液中的药代动力学数据；
图24示出了肽模拟化合物1(即Tri02)的血液分解产物；
图25示出了肽模拟化合物3(即Tri04)的血液分解产物；
图26示出了肽模拟化合物3(即Tri04)的细胞培养数据(即钙离子内流)；
图27示出了(A)在脑切片上使用电压敏感染料成像(VSDI)通过添加肽(T30和Tri04)引起的基底前脑活动变化相对于基线响应幅度的时空图。在(B)中示出了在基底前脑中关于T30和Tri04(2μM)与仅T30记录的基底前脑诱发活动的比较图；
图28示出了与基线条件相比，在T30单独存在或在T30及其阻滞剂Tri04联合应用后进行的记录的荧光分数变化(响应时间序列，n＝29)；以及
图29示出了在4μM浓度下使用阻滞剂Tri04的基础前脑活动的条形图。Tri04联合应用能够完全阻断T30在大鼠基底前脑中的诱发作用。
实施例
本发明人执行了一项计算机模拟研究，旨在设计新型肽和肽模拟物，这些肽和肽模拟物展现对α-7nChR受体的亲和力，因此，其会阻断内源性毒性T30肽(KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL–SEQ ID No:1)与其活性位点的结合。计算机模拟研究有助于确定与防止T30毒性作用和β淀粉样蛋白产生相关的化学官能团，其通过考察受体与已知提供这种保护的环状NBP-14(即AEFHRWSSYMVHWK–SEQ ID No:2)之间的相互作用，这一点已在先前的工作中得到证实(参见WO 2005/004430)。以下实施例描述了计算机模拟研究，以及已在体外鉴定和测试的各种肽和肽模拟物的结构。
实施例1–设计抑制α-7nChR受体的新型肽的计算机模拟研究
通过使用NBP-14对药物靶受体的亲和力的计算分析，以及通过基于结构的研究，本发明人鉴定了一系列与NBP-14(SEQ ID No:2)具有相似体外性质的较小线性肽。研究了598种这些较小线性肽与靶α-7nChR受体之间的理论相互作用。用化学方法合成了NBP-14和来自上述计算分析的168种线性肽。在体外PC12细胞中筛选出NBP-14和所有168种多肽，PC12细胞通常用作神经元分化和神经分泌研究的模型***。在体外进行了毒性和神经退行性生物活动的筛选，后者通过监测乙酰胆碱酯酶活性和细胞内钙水平进行筛选。由此，使用在PC12细胞上体外测试的肽的计算机模拟分析以确定与受体结合中所涉及的主要化学官能团，已鉴定了具有针对T30的神经退行性保护性质的一系列第二代新分子。
已经在α-7nChR受体的变构位点上进行了这些化合物的对接。受体中的结合口袋包含四个区域(表示为区域1、2、3和4)，其可以如图1-4中所示来表示。
计算机模拟分析包括肽之间的比较，以确定并区分对防止T30毒性和β淀粉样蛋白的产生具有特异性的化学特征/官能团与惰性的化学特征。图2-4总结了具有基于极性的彩色编码的α-7nChR结合口袋的3D结构。
所遵循的步骤及其结果概述如下：
步骤1：在受体的每个特定区域中结合的氨基酸的比较
在这项分析中，单独考虑每个区域，只考虑与所述区域结合的氨基酸。如图5所示，呈现了参与结合的氨基酸或化学官能团的饼形图，这一步骤没有揭示不同区域中特异性结合的氨基酸。
步骤2：不同区域中的氨基酸结合之间距离的比较
在这项分析中，考虑到参与结合的化学官能团来测量氨基酸之间的距离。图6中呈现的这些数据显示，惰性变体和具有针对T30毒性的活性和β淀粉样蛋白活性的变体之间的距离没有显著变化。
步骤3：参与结合的氨基酸组合的比较
这个步骤需要分析参与结合的氨基酸，呈防止T30毒性和β淀粉样蛋白产生所必需的氨基酸的组合形式。
下表1和表2中显示的结果表明，18个氨基酸的组合似乎是防止T30毒性所必需的，并且31个氨基酸的组合似乎是防止β淀粉样蛋白产生所必需的。
表1：防止T30毒性的氨基酸组合
组合 区域1 区域2 区域3 区域4
1 组氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 色氨酸
2 酰胺 苯丙氨酸 组氨酸 -
3 组氨酸 蛋氨酸 色氨酸 -
4 酰胺 精氨酸 谷氨酸 -
5 色氨酸 组氨酸 酪氨酸 蛋氨酸
6 精氨酸 色氨酸 酪氨酸 蛋氨酸
7 苯丙氨酸 N末端 精氨酸 组氨酸
8 色氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸
9 精氨酸 酰胺 酪氨酸 -
10 精氨酸 蛋氨酸 酪氨酸 -
11 赖氨酸 色氨酸 酪氨酸 -
12 色氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 组氨酸
13 赖氨酸 组氨酸 酪氨酸 -
14 色氨酸 赖氨酸 N末端 -
15 色氨酸 丝氨酸 苯丙氨酸 精氨酸
16 N末端 酪氨酸 组氨酸 Yrp
17 酰胺 - 谷氨酸 -
18 组氨酸 - 丝氨酸 -
表2：防止β淀粉样蛋白产生的氨基酸组合
Figure GDA0004076375090000461
/>
Figure GDA0004076375090000471
鉴于这些结果，本发明人能够确定参与受体每一区域(区域1-4)内结合的氨基酸残基的排序，从而确定在提供防止T30毒性和β淀粉样蛋白产生方面具有特定相关性的化学官能团，分别参见图7和图8。
本发明人能够得出结论，每个区域需要特定的化学官能团，其总结在表3中。
表3：α-7nChR受体变构位点的每个区域中发生的相互作用的类型
区域 相互作用类型
1 氢键
2近端 氢键
2远端(任选的) 疏水性
3近端 疏水性
3远端 氢键
4远端(任选的) 氢键
因此，鉴于这些发现，本发明人已经证实了一种合适的肽，其将通过优先阻断烟碱受体的活性位点来阻断内源性T30的毒性作用。
实施例2-肽模拟物的设计和生产
然后，采用另一种方法来设计和分离新型肽模拟化合物，所述化合物(如同实施例2中所述的肽一样)能比T30更好地获得烟碱受体的变构活性位点。因此，进行了进一步的计算机模拟研究，其中在α-7nChR受体的变构位点的起始初始X射线结构上执行计算溶剂映射。这项分析旨在阐明在结合位点上的优先溶剂相互作用，以及定位热点(疏水性、芳香、极性或带电)的存在。该方法鉴定了配体为变得活性所需的预期化学特征。
IPRO溶剂分析阐明了结合位点的高疏水性。观察到IPRO溶剂映射预测与T14肽对接之间完美重叠。
基于溶剂映射分析，利用T14结构生成三肽和四肽的线性文库。在此步骤中，产生了超过500,000种肽模拟物，用于进一步评估。然后，通过AutoDock Vina对接引擎评估肽模拟物。分析中考虑了理论亲和力以及配体混杂性(即以多个结合位点或不同结合模式结合的趋势，由低的内RMSD表示)。该分析产生了五种候选肽模拟化合物，如下所示，其中得分(绝对值)越高，亲和力越好，并且化合物具有活性的可能性越高。
化合物1-Tri02(得分：-10.2)
Figure GDA0004076375090000491
4-((S)-2((S)-2-乙酰胺基-3-(萘-2-基)丙酰胺基)-3-(((S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)苯铵
化合物2-Tri03(得分：-9.8)
Figure GDA0004076375090000501
-(3S,5S)-1-((S)-2-乙酰胺基-3-(萘-2-基)丙酰基)-5-(((S)-1-氨基-6-((氨基(亚氨基)甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-铵
化合物3-Tri04(得分：-9.4)
Figure GDA0004076375090000502
4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-3-(4-苯甲酰基苯基)丙酰胺基)-6-((氨基(亚氨基)甲基)氨基)己酰胺基)-3-氨基-3-氧代丙基)苯铵化合物4-Tri05(得分：-9.6)
Figure GDA0004076375090000511
(((R)-4-乙酰胺基-5-(((S)-5-((氨基(亚氨基)甲基)氨基)-1-(((S)-1-氨基-3-(4-苯甲酰基苯基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-5-氧代戊基)氨基)(氨基)甲铵
化合物5-Tri06(得分：-8.9)
Figure GDA0004076375090000521
(S)-5-((S)-2-乙酰胺基-5-((氨基(亚氨基)甲基)氨基)戊酰胺基)-6-(((S)-1-氨基-3-(4-苯甲酰基苯基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-6-氧代己酸酯
实施例3-已鉴定化合物的合成
材料和方法
来自实施例2的化合物1和3由Genosphere Biotechnologies合成，并使用RP-HPLC分析纯度(>99％纯度)和通过质谱法分析质量(Tri02的平均MS为604.79和Tri04的平均MS为628.83)。
TRI02合成的简要逐步描述-序列：[乙酰基]-[2Nal][4nh2-F]-Trp-[酰胺]
1)Boc-Trp-OH+ClooEt+NH3.H2O-----Boc-Trp-NH2，在THF中反应，由乙酸***萃取。
2)Boc-Trp-NH2,4NHcl，除去Boc-，得到H-Trp-NH2.Hcl，由二***沉淀反应。
3)(2-萘基)-Ala+乙酸酐----Ac-(2-萘基)-Ala-OH，THF/H2O反应，由乙酸***萃取。
4)Boc-(4-NH2)-Phe-OH+H-Trp-NH2.Hcl----Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2，在DMF中反应，由乙酸***萃取。
5)Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2,4NHcl，除去Boc-，得到H-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2.Hcl，由二***沉淀反应。
6)Ac-(2-萘基)-Ala-OH+H-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2.Hcl--Ac-(2-萘基)-Ala-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2，在DMF中反应，由乙酸***萃取。
7)提纯
TRI04合成的简要逐步描述-序列：[乙酰基]-[bpa]R[4NH2-F]-[酰胺]
1)Rink Amide MBHA。树脂在DCM中浸泡30分钟，用泵抽干，用DMF洗涤3次，用泵抽干。
2)加入Fmoc-(4-NH2)Phe-OH、DIEA、HBTU、DMF，N2，反应30分钟，用泵抽干，用DMF洗涤6次，用泵抽干。
3)加入哌啶/DMF以除去Fmoc-，反应20分钟，用泵抽干，用DMF洗涤3次，用泵抽干。
4)加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、DIEA、HBTU、DMF，N2，反应30分钟，用泵抽干，用DMF洗涤6次，用泵抽干。
5)重复步骤3。
6)加入Fmoc-Bpa-OH、DIEA、HBTU、DMF，N2，反应30分钟，用泵抽干，用DMF洗涤6次，用泵抽干。
7)重复步骤3。
8)加入乙酸酐/DMF，N2，反应30分钟，用泵抽干，用DMF洗涤3次，用泵抽干，用DCM洗涤3次，用泵抽干，用MeOH洗涤3次，用泵抽干。
9)从树脂上裂解肽，用泵抽干，用二***沉淀反应，获得粗肽，离心干燥。
10)提纯
实施例4–在细胞培养物中评估化合物1(Tri02)和化合物3(Tri04)
本发明人在细胞培养研究中测试了T30、NBP-14和Tri02，以确定其对乙酰胆碱酯酶活性和钙内流的影响，以及Tri04对钙内流的影响。
材料和方法
1.AChE活性测定
AChE活性使用Ellman试剂测量，该试剂测量由AChE活性导致的硫醇基团的存在。在G4实验的情况下，单独测试AChE(G4)活性，以及与NBP14或三肽联合测试。在实验前一天，将PC12细胞铺板，用于细胞活力测定。细胞用T30(1μM)单独处理或与NBP14或三肽(0.5μM)联合处理。处理后，收集每个处理的上清液(灌注液)，将每个条件下的25μL上清液加入到新的平底96孔板，然后加入175μl Ellman试剂(溶液A：KH2PO4 139mM和K2HPO4 79.66mM，pH7.0；溶液B(底物)：乙酰硫代胆碱碘化物11.5mM；溶液C(试剂)：5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)8mM和NaHCO3 15mM)。将Ellman试剂按33(A):3(B):4(C)的比率配制成3种溶液的混合物。在Vmax板读取器(Molecular devices，英国沃金汉姆)中，在405nm下的实验中以60分钟的时间间隔进行吸光度测量。
2.钙荧光测定法
在实验前一天，在96孔板中，将PC12细胞接种于200μl杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's medium，DMEM)+2mM L-谷氨酰胺培养基中。在实验当天，通过在含有9ml Hank平衡盐溶液(HBSS)和1ml pluronic F127 Plus的分析缓冲液中加入20μl Fluo-8，按照供应商的描述制备Fluo-8溶液(Abcam)。随后，去除100μl生长培养基并加入100μl Fluo-8溶液。加入T30与NBP14或三肽一起处理，并在培养箱中温育30分钟以及在室温下温育30分钟。1小时后，将板放置在荧光板读取器(Fluostar,Optima,BMGLabtech，德国奥滕贝格)中。在读取荧光之前，制备烟碱受体的α7特异性激动剂PNU2829871μM，并将其置于Fluostar注射器中。对于每个孔，通过基础荧光读数形成读数，然后注入PNU282987，其通过烟碱受体诱导钙的增加。
3.数据分析
在每个不同的细胞技术中，统计分析是用3次或更多次实验的百分比值的平均值进行的。使用GraphPAD Instat(GraphPAD软件，加州圣地亚哥)通过单向方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验，对多个治疗组和同一对照组进行比较。统计学显著性在p值<0.05时采集。
结果
Tri02的结果示于图9和图10中，其中，在随后的图表中所示的n值是指重复实验的次数。可以看出，1μM T30可增加钙内流和AChE活性，并且如先前的工作(参见WO 2005/004430)中所示，1μM NBP14可防止这些毒性作用。
此外，如图所示，Tri02还通过减少钙内流和AChE活性，明显防止T30的毒性作用。因此，本发明人确信Tri02具有神经保护性，并且由于其比NBP-14小，穿过血脑屏障的机会要大得多。
Tri04的结果如图26中所示。可以看出，Tri04也通过减少钙内流来防止T30的毒性作用。
实施例5–在脑切片中评估化合物1
本发明人在使用电压敏感染料成像(VSDI)的脑切片研究中测试了NBP-14和Tri02。
材料和方法
1.脑切片制备
使用异氟烷(～15ml，100％w/w)麻醉雄性Wistar大鼠(14天龄)。在麻醉室(玻璃盒20×15×15cm)底部的棉床上涂上异氟烷，然后将大鼠放置大约45秒，直至达到完全麻醉。每只麻醉大鼠的后爪都被捏紧，以检查适当的麻醉深度。确认麻醉后，将大鼠快速断头，迅速取出大脑并浸入冰冷的含氧“切片”人工脑脊液中(以mmol计的aCSF：120NaCl、5KCL、20NaHCO3、2.4CaCl2、2MgSO4、1.2KH2PO4、10葡萄糖、6.7HEPES盐和3.3HEPES酸；pH＝7.1)。然后，使用振动切片机(Leica VT1000S)从包含基底前脑的脑块中获取冠状切片(400μm厚)，即MS-dBB复合体(在+9.20和+9.48mm的耳间与+0.48和+0.2mm的前囟之间)和躯体感觉桶场皮质(S1BF，在+8.08和+7.20mm的耳间与-0.92mm和-1.80mm的前囟之间)(Paxinos和Watson,1998)。然后在室温下将切片转移到含有含氧aCSF的鼓泡罐中(以mmol计记录的aCSF：124NaCl、5KCL、20NaHCO3、2.4CaCl2、2MgSO4、1.3KH2PO4、10葡萄糖；pH＝7.4)，这与VSDI(电压敏感染料成像)记录中使用的相同。切片然后放置大约1-1.5小时，然后准备进行VSD染色。
2.VSD设置
将切片置于黑暗的高湿度室中，室中充满用95％ O2、5％ CO2鼓泡的aCSF。一旦到达，将染料溶液(于48％aCSF、48％胎牛血清、3.5％ DMSO和0.4％cremophore EL中的4％0.2mM苯乙烯基染料吡啶鎓4-[2-[6-(二丁基氨基)-2-萘基]-乙烯基]-1-(3-磺丙基)氢氧化物(Di-4-NEPPS)，Invitrogen，英国佩斯利)(Tominaga等,2000)涂在切片上持续20-25分钟，然后被转移回保持在室温的含有含氧aCSF的鼓泡罐中持续30分钟。
在起始VSDI记录时，将切片放置在记录槽中的一小片滤纸上，以使含氧aCSF在切片下侧流动，并使其保持活力。然后，通过放置在切片顶部的自制塑料网格使切片负重。灌注浴溶液由台式加热器加热至30±1℃。将同心双极刺激电极(FHC，美国缅因州)放置在基底前脑的腹侧斜角带中，刺激设置为30V。为了获取VSD数据，使用带有BV_Analyze成像软件的MiCam02高分辨率相机(Brain Vision，日本)记录了相当于88×60像素的二维图像。图像的采集被耦合到Spike2 V4.23软件(CED Ltd，英国剑桥)，以便通过Micro 1401 MkII(CEDLtd，英国剑桥)使图像采集与刺激方案(每28秒，重复30次)保持一致。使用Osram卤素xenophot 64634 HLX EFR显示器/光学灯产生光，并使用耦合到MiCam02高分辨率成像***并通过>590nm高通滤光器过滤发射荧光的MHF-G150LR(Moritex公司)过滤以发射绿光(530±10nm)。
3.药物制备和应用
乙酰胆碱酯酶(AChE)C末端30个氨基酸的肽(T30；序列：‘N’–KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL–SEQ ID No:1)，T30的活性14个氨基酸区域的环状形式(NBP14；序列：c[AEFHRWSSYMVHWK]–SEQ ID No:2；c[]＝环状，N末端至C末端)和T30序列中所含的惰性15个氨基酸的肽(T15；序列：‘N’-NQFDHYSKQDRCSDL–SEQ ID No:3)是定制合成的并购自Genosphere Biotechnologies(法国巴黎)，纯度>99％。线性肽模拟物Tri02由Iproteos(西班牙巴塞罗那)通过计算机模拟设计，并以>99％的纯度合成并购自Genosphere Biotechnologies。在实验之前，所有药物和肽储备液都制成冷冻等分试样。为制备灌注溶液，将储备溶液解冻并在适当时加入到记录aCSF中，并使用Minipulse 3号蠕动泵(Gilson Scientific Ltd.，英国贝德福德)以1.5ml/min的恒定速率灌注施加浴液。每项实验性试验持续52分钟，其中用20分钟建立基线记录(仅用记录aCSF灌注)，用12分钟允许药物溶液灌注到浴槽中以及使染料分子在细胞膜中重新排列，最后用20分钟记录周期测量在药物溶液存在下的反应。
4.数据分析和统计
从每种药物条件下产生的二维图像中，提取了关键数据，如激活的时间过程、整体荧光信号的强度和扩散。这些数据使用自定义脚本进行处理，以将其转换为可用的MatLab(Mathworks Inc.，美国马萨诸塞州)文件，然后使用专门为VSDI数据分析制作的Matlab工具箱进行分析(Bourgeois等,2014)。这个工具箱允许选择可应用于每个切片的固定感兴趣区域(ROI)几何结构，以便提取和整理来自每个实验中使用的所有切片的相同ROI的数据。对于基底前脑切片，将使用的ROI是MSdBB复合体，选择它是因为其包括MS(中隔核)、VDB(腹侧斜角带)和HDB(水平斜角带)。更重要的是，选择此ROI是为了包括整个诱发响应。此响应可以绘制成单个平均时间序列，或者在‘时空图’中绘制成空间和时间上的响应，以便提供数据的定性描述。然而，为了产生可量化的值，计算了刺激时刻(t＝0)和之后156ms之间的时间序列下方面积(总荧光分数变化)。由于在各个切片之间观察到的响应的可变性，从每个实验中产生的原始数据相对于其自身的基线被标准化，以给出标准化的荧光值。选择这种量化方法是为了说明VSDI生成的信号的多个成分(Chemla和Chavane,2010)，即即时峰值和长延迟响应(Badin等,2016)。用Prism Graphpad 6进行统计。
5.调节肽的分析
在使用T30的整个实验期间，观察到信号的增大或减小。因此，在将这些结果平均在一起时，未检测到变化。然而，鉴于过去观察到的这种肽在各种制剂中的调节作用(Bon和Greenfield,2003，Day和Greenfield,2004，Greenfield等,2004，Badin等,2013)，以及T30在这类制剂中的应用所诱导的变化与基线响应幅度呈中度负相关(r＝-0.4286，p＝0.0257，Spearman秩相关，n＝27，图13A)的事实，决定是否应该根据观察到增大还是减小来将这些结果分成两部分。
随后，对每个添加了外源化合物的实验进行了类似的相关性分析(图13)。在确定显著相关性后，然后根据是否观察到增大或减小对数据进行分类。
结果
参考图2、图11和图12，添加4μM Tri02扼要重述了应用4μM NBP14所观察到的结果。
参考图11，向灌注液中添加NBP14(4μM)会导致诱发响应的幅度(总荧光)发生微小且不显著的变化。尽管这些小的诱发变化并不显著，但发现其与基线响应幅度成反比；因此，将数据分成导致轻微减少的试验(左直方图)和导致增加的试验(右直方图)，都呈实际(顶部)和标准化(底部)数据格式。如果合并考虑，则数据集将显示与基线相比无变化(因为增加和减少会相互抵消)，然而，即使在单独考虑荧光变化时检查NBP14没有诱导显著作用也是至关重要的。
如图12所示，向灌注液中加入Tri02(4μM)会引起诱发响应的幅度(总荧光)发生微小变化，其中诱导减少(n＝总共11次中的8次)显示出与标准化基线水平的显著偏差(左下直方图，p<0.05)。这些变化也被发现与基线响应幅度呈反相关；因此，将数据分为导致减少的试验(左直方图)和导致增加的试验(右直方图)，都呈实际(顶部)和标准化(底部)数据格式。如果合并考虑，则数据集将显示与基线相比无变化(因为增加和减少会相互抵消)，然而，即使在单独考虑荧光变化时检查NBP14没有诱导显著作用也是至关重要的。
调节肽模拟物的分析
参考图13，示出Tri02(4μM)和T30(2μM)数据的相关性分析(n＝15)，显示它们的共灌注导致诱发响应幅度的一些变化，其中一些切片显示活动略有增加(n＝6)，而大多数切片显示活动略有减少(n＝9)。发现这种相关性非常显著(p＝0.0405；r2＝-0.534)，提供了将数据分成显示由于Tri02和T30应用导致诱发活动增加和减少的数据的依据，就像添加NBP14和Tri02一样(分别见图11和图12)。
参考图14，显示了通过添加Tri02和T30介导的作用的量化：在诱导增加和减少的情况下，发现Tri02都不能防止T30引起的与基线的偏差，总体作用显著降低(左图，p<0.01，n＝9)和增加(右图，p<0.05，n＝6)。
如图15所示，测试正常aCSF(黑线)、2μM T30(红线)、T30(2μM)和4μM NBP14(蓝线)、T30(2μM)和4μM Tri02、对照NBP14(4μM)实验(图11，橙线)、对照Tri02(4μM)实验(图12，紫线)作用的实验相对于基线的标准化作用的总线图。该图显示了相对于基线和彼此的标准化降低，其中T30单独导致最大偏差，Tri02显示了阻断那些T30诱导偏差的一些功效，但它们的共同灌注(绿线)仍发生显著变化。
实施例6-药代动力学
本发明人研究了NBP-14、Tri-02和Tri-04在大鼠和人体血液中的降解产物。
程序
将测试化合物以10μg/ml加入PBS或用PBS稀释的血液(雄性Wistar大鼠或人类)中，并按照以下方案采集一系列样品：
Figure GDA0004076375090000621
普鲁卡因，一种已知在血液中不稳定的化合物，被列为阳性对照(仅用5倍稀释的血液操作)。取样程序是向冰冷的乙腈中加入一份等分试样，离心，并将上清液储存在干冰上直至分析。使用电喷雾电离的UHPLC-TOF质谱分析在进行温育的同一天进行。
结果
普鲁卡因在5倍稀释的大鼠和人类血液中的转化率分别为60％和100％，表明所用血液的代谢能力是可接受的，如图22和图23所示。
大鼠和人类血液中NBP-14、Tri-02和Tri-04的稳定性数据绘制于图16-21中。NBP-14表现出良好的稳定性，没有检测到降解产物。Tri-02在5倍和20倍稀释的大鼠和人类血液中都显示出一些不稳定性，并且检测到多种降解产物，如图24所示。与TRI-02相比，TRI-04显示出更好的稳定性，但仍在5倍稀释的大鼠血液中检测到一些降解产物，如图25所示。因此，Tri-02和Tri-04是稳定的并且因此良好的候选药物也是稳定的。
实施例7–在脑切片中评估化合物3
本发明人在使用电压敏感染料成像(VSDI)的脑切片研究中测试了Tri04。
材料和方法
1.脑切片制备
按照实施例5制备脑切片。
2.VSD设置
将切片置于黑暗的高湿度室中，室中充满用95％ O2、5％ CO2鼓泡的aCSF。一旦到达，将染料溶液(于aCSF 48％、胎牛血清48％、DMSO 3.5％和cremophore EL 0.4％中的4％0.2mM苯乙烯基染料吡啶鎓4-[2-[6-(二丁基氨基)-2-萘基]-乙烯基]-1-(3-磺丙基)氢氧化物(Di-4-ANEPPS，Invitrogen，英国佩斯利)(Tominaga等,2000))涂在切片上持续20-25分钟，然后转移到aCSF鼓泡罐(室温，22℃+/-1.5℃)持续1小时以洗掉过量的染料并恢复。
当起始VSD记录时，将切片放置在记录槽中的一小块滤纸上，以使切片保持活力，并使用放置在切片顶部的自制塑料网格适当负重。灌注浴溶液由台式加热器加热至30+/-1℃。将同心双极刺激电极(FHC，美国缅因州)置于基底前脑腹侧斜角带，刺激设定为30V。为了获取VSD数据，用耦合至Spike 2 V6.0(CED Ltd，英国剑桥)的带有Ultima 2004/08成像软件(Brain Vision)的数码相机(Brain Vision MiCAM Ultima R3-V20 Master)以1ms分辨率录制16位图像，所述Spike 2 V6.0用于触发与适当ISI相关的刺激。使用Osram卤素xenophot 64634 HLX EFR显示器/光学灯产生光，并使用耦合到MiCAM Ultima超快成像***并通过>590nm高通滤光器过滤发射荧光的MHF-G150LR(Moritex公司)过滤以发射绿光(530+/-10nm)。
3.药物制备和应用
线性肽模拟物Tri04由Iproteos(西班牙巴塞罗那)通过计算机模拟设计，并且以>99％的纯度合成并购自Genosphere Biotehnologies。在实验之前，所有药物和肽储备液都制成冷冻等分试样。为制备灌注溶液，将储备溶液解冻并在适当时加入到记录aCSF中，并使用Minipulse 3号蠕动泵(Gilson Scientific Ltd.，英国贝德福德)以1.5ml/min的恒定速率灌注施加浴液。每项实验性试验持续52分钟，其中用20分钟建立基线记录(仅用记录aCSF灌注)，用12分钟允许药物溶液灌注到浴液中以及使染料分子在细胞膜中重新排列，最后用15分钟记录周期测量在药物溶液存在下的反应。
5.调节肽的分析
在大多数使用T30的实验中，观察到信号减小。T30在p14大鼠的基底前脑中的记录VSDI信号中诱导净抑制(n＝21)，该值实际上包括在T30灌注期间观察到可忽略的或少量正面作用的少数情况(Badin等,2016)。
结果和讨论
参考图27、图28和图29，添加4μM Tri04扼要重述了先前应用4μM NBP14时所见的结果，而灌注溶液中的2μM Tri04确定了对基底前脑群体活动的显著影响。
调节肽模拟物的分析
参考图27A，示出由于含有2μM T30(n＝29)的灌注液中存在2μM Tri04，时空图表现出基底前脑活动的恢复。更具体而言，2μM Tri04确定对通过直接刺激大鼠基底前脑测量的T30活动过度的抑制作用的逆转。
参考图27B，与3个记录时期相关的条形图显示了Tri04应用后诱发反应的变化，证实了2μM Tri04共灌注诱导网络活动的增加(n＝29，p＝0.06，双尾配对t检验)，这是由T30诱导效应的抑制引起的。
参考图28，示出了三种记录条件下的反应时间序列(基线)，T30应用于人工脑脊液(aCSF)以及T30和Tri04共同应用于aCSF，在最初的100毫秒内，T30记录和T30+Tri04记录显示了相似的激活曲线，而随后在Tri04存在下的记录中检测到更高的活性，证实了Tri04的保护作用优于T30。
参考图29，示出了与三种记录条件相关的条形图。4μM Tri04在含有2μM T30的人工脑脊液(aCSF)中的共灌注确定了逆转T30活性的显著作用。特别是，已发现Tri04可防止T30引起的与基线的偏离，与仅存在T30下的记录相比，基底前脑活动显著增加(n＝20，p<0.05，双尾配对t检验)。因此，Tri04显示了阻断T30对中尺度网络活动的毒性作用的一些功效。
6
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<210>1
<211>30
<212> PRT
<213>
<220
<223>
<400>
Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn
1 5 10 15
Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu
20 25 30
<210>
<211>14
<212> PRT
<213>
<220
<223>
<400>2
Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys
1 5 10
<210> 3
<211>15
<212> PRT
<213>
<220
<223>
<400> 3
Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu
1 5 10 15

Claims (13)

1.分子式(I)的化合物
Figure FDA0004057105180000011
，
其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure FDA0004057105180000012
R3是-H；
R4是
Figure FDA0004057105180000013
R5是-H；
R6是
Figure FDA0004057105180000014
R7是-H；
R8是-H或
Figure FDA0004057105180000015
每个R9和R10都是独立的-H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；且
每个n独立地介于0和10之间；
或一种药学上可接受的盐，在制备治疗、改善或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，R1是–NH2，R2是
Figure FDA0004057105180000021
R4是
Figure FDA0004057105180000022
R6是/>
Figure FDA0004057105180000023
R8是/>
Figure FDA0004057105180000024
3.根据权利要求1所述的用途，其中，化合物具有分子式(Ia)
Figure FDA0004057105180000025
4.根据权利要求1所述的用途，其中，化合物是分子式(101)的化合物：
Figure FDA0004057105180000026
5.根据权利要求4所述的用途，其中，化合物是分子式(101a)的化合物：
Figure FDA0004057105180000031
6.分子式(I)的化合物，
Figure FDA0004057105180000032
其中：
R1是-NR9R10；
R2是
Figure FDA0004057105180000033
/>
R3是H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；R4是
Figure FDA0004057105180000034
R5是H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；R6是
Figure FDA0004057105180000035
R7是H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；R8是-H；一个C1-5直链或支链烷基或烯基或
Figure FDA0004057105180000041
R9和R10都是独立地为-H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；和
每个n独立地介于0和10之间；
或一种药学上可接受的盐，在制备治疗、改善或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，R1是–NH2，R2是
Figure FDA0004057105180000042
R4是
Figure FDA0004057105180000043
R6是/>
Figure FDA0004057105180000044
R8是/>
Figure FDA0004057105180000045
8.根据权利要求6所述的用途，其中，化合物具有分子式(Ia)：
Figure FDA0004057105180000046
9.根据权利要求6所述的用途，其中，化合物具有分子式(103)的化合物：
Figure FDA0004057105180000047
/>
10.根据权利要求9所述的用途，其中，化合物具有分子式(103a)的化合物：
Figure FDA0004057105180000051
11.分子式(I)的化合物，
Figure FDA0004057105180000052
其中：
R1是-NR9R10或-OH；R2是
Figure FDA0004057105180000053
R3是H；
R4是
Figure FDA0004057105180000054
R5是H；
R6是
Figure FDA0004057105180000055
R7是H；
R8是-H或
Figure FDA0004057105180000061
R9和R10都是独立地为-H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；和
每个n独立地介于0和10之间；
或一种药学上可接受的盐。
12.分子式(I)的化合物，
Figure FDA0004057105180000062
其中：
R1是-NR9R10或-OH；
R2是
Figure FDA0004057105180000063
R3是H；
R4是
Figure FDA0004057105180000064
R5是H；
R6是
Figure FDA0004057105180000065
R7是H；
R8是-H或
Figure FDA0004057105180000071
R9和R10都是独立地为-H或一个C1-5直链或支链烷基或烯基；和
每个n独立地介于0和10之间；
或一种药学上可接受的盐。
13.一种药物组合物，其包含权利要求11或12所述的化合物，或其药学上可接受盐，以及药学上可接受的载体。
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