CN109632924B - 人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用 - Google Patents

人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用。具体地，本发明提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括多种血浆脂质生物标志物，可以用于评估待测对象的黄斑新生血管性疾病患病风险或待测对象黄斑新生血管性疾病诊断。本发明还提供了包含所述生物标志物集合的试剂盒以及所述生物标志物集合在黄斑新生血管性疾病患病风险评估和诊断中的应用。

Description

人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用。
背景技术
脂质代谢对于维持人体视觉***的解剖结构及生理功能起着至关重要的作用。研究表明：视网膜脂质代谢的异常可导致视网膜组织变性、退化，甚至致盲。脂质组学是代谢组学的一部分，是指涉及细胞、组织、器官甚至整个生态***内的所有脂质成分。
黄斑新生血管性疾病是以黄斑区脉络膜新生血管生成为特征的一组疾病，包括：年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视等。
年龄相关性黄斑变性是导致55岁以上患者致盲的主要原因；到2040年，其将影响约17亿人口，其中11亿为亚洲人口；年龄相关性黄斑变性产生的异常新生血管可引起黄斑下液体及脂质渗漏、纤维疤痕产生，最终导致严重的视力损害。息肉样脉络膜血管病变亦多见于亚洲人口，常被认作是年龄相关性黄斑变性的一种亚型；其新生血管的产生与异常的分枝血管网有关，血管末端常有息肉样的血管膨大。病理性的高度近视多见于东亚国家，其特征为异常的脉络膜血管及增长的眼球。以上所有这些黄斑新生血管性疾病具有相近的新生血管病理性改变，均可导致严重的视力损害及不可逆盲，因此这类疾病已成为眼科临床医师诊疗的重点及难点。
迄今为止，对于黄斑新生血管性疾病的诊断多依赖于影像学检查，例如：光学相干断层扫描(OCT)、血流OCT(OCTA)、眼底血管荧光造影(FFA)、吲哚菁绿血管造影(ICGA)等。OCT及OCTA均为非侵入性检查，能快速有效地提供眼底视网膜、脉络膜甚至巩膜的高晰影像；FA及ICGA检查时需于患者静脉内注射荧光素钠或吲哚菁绿造影剂，常用于检测患者眼底视网膜及脉络膜的血流循环。但由于黄斑新生血管性疾病的病理改变非常相近，有时即使运用了以上所有的检测手段，某些疾病仍旧难以精确诊断。因此，目前迫切需要寻找其他针对黄斑新生血管性疾病的诊断手段。
因此，本领域迫切需要开发新的黄斑新生血管性疾病的脂质标记物，为此类疾病提供一种新的诊断、分型手段，亦为进一步阐明该类疾病的发生发展机制打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供新的黄斑新生血管性疾病的脂质标记物，为此类疾病提供一种新的诊断、分型手段，亦为进一步阐明该类疾病的发生发展机制打下基础。
在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合用于诊断黄斑新生血管疾病，或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险(易感性)或诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)待测对象黄斑新生血管疾病。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断AMD疾病的生物标志物集合，包括选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断AMD疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C26:0、十二烷酰基左旋肉碱、磷脂酰胆碱二酰基C26:0、癸酰基-L-肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断AMD疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C28:0、磷脂酰胆碱二酰基C24:0、十六碳二烯基左旋肉碱、溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，包括选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C26:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0、十二烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：磷脂酰胆碱二酰基C24:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：磷脂酰胆碱二酰基C24:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：羟基十八碳酰-L-肉碱、羟基十六碳二烯基左旋肉碱、十六碳二烯基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PM疾病的生物标志物集合，包括羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于诊断PM疾病的生物标志物集合，还包括溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0。
在另一优选例中，所述的集合包括两种或多种选自表A的生物标志物：
表A
Figure BDA0001909187270000031
Figure BDA0001909187270000041
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b14。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物bm、和一个或多个选自子集X 的生物标志物，其中子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物b(m+1)～b14 构成，m为整数且1≤m≤14，较佳地1≤m≤9，更佳地1≤m≤5。
在另一优选例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14；
其中，当m为1时，所述的生物标志物b1～b(m-1)不存在；
当m为2时，所述的生物标志物b1～b(m-1)表示生物标志物b1；
当m＝3-14中任一整数时，子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物 b(m+1)～b14构成；
当m为13时，所述的生物标志物b(m+1)～b14表示生物标志物b14；
当m为14时，所述的生物标志物b(m+1)～b14不存在。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1、b5和一个或多个选自子集 Y的生物标志物，其中子集Y由生物标志物b2-b4、b6-b14构成。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1、b2、b3、b5、b6和一个或多个选自子集Z的生物标志物，其中子集Z由生物标志物b4、b7-b14构成。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1、b2-b8和一个或多个选自子集Z的生物标志物，其中子集Z由生物标志物b9-b14构成。
在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：b1、b2-b8。
在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：b1、b2、b3、b5、 b6。
在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：b1、b5。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1-b2和一个或多个选自子集Y 的生物标志物，其中子集Y由生物标志物b3、b4-b14构成。
在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1-b4、b6和一个或多个选自子集Z的生物标志物，其中子集Z由生物标志物b5、b7-b14构成。
在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：b1-b2。
在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：
b1、b2、b3、b4、b6。
在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源于血液、血浆、或血清样品。
在另一优选例中，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有黄斑新生血管性疾病患病风险或患有黄斑新生血管性疾病，
其中子集H包括生物标志物b1至b14。
在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b1至b4。
在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b4。
在另一优选例中，通过质谱法对各个生物标志物进行鉴定，较佳地，通过色谱质谱联用，如气相色谱-质谱法(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)法。
在另一优选例中，所述的集合用于评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险或待测对象黄斑新生血管疾病诊断。
在另一优选例中，所述的评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险包括黄斑新生血管疾病的早期筛查。
在另一优选例中，所述黄斑新生血管疾病包括年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变、和病理性高度近视。
本发明第二方面提供了一种用于黄斑新生血管疾病患病风险评估或诊断的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂包括用于质谱法检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的物质。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。
在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于黄斑新生血管疾病患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平的参考数据集。
本发明第四方面提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险或待测对象黄斑新生血管疾病诊断，其中，所述生物标志物集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L- 肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述黄斑新生血管疾病选自下组：AMD、PCV、PM、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的AMD疾病的患病风险或待测对象 AMD疾病诊断时，所述生物标志物集合包括选自下组的生物标志物：十四碳二烯-L-肉碱、癸酰基-L-肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的AMD疾病的患病风险或待测对象 AMD疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：十四烷酰基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十二烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的AMD疾病的患病风险或待测对象 AMD疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：磷脂酰胆碱二酰基C26:0、羟基十四碳二烯基左旋肉碱、溶血磷脂酰胆碱酰基C26:0、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的AMD疾病的患病风险或待测对象 AMD疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0、磷脂酰胆碱二酰基C24:0、十六碳二烯基左旋肉碱、溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的AMD疾病的患病风险或待测对象 AMD疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括羟基十八碳酰-L-肉碱。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PCV疾病的患病风险或待测对象PCV疾病诊断时，所述生物标志物集合包括选自下组的生物标志物：L-山梨糖、核糖酸内酯、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PCV疾病的患病风险或待测对象 PCV疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：十四碳二烯-L-肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PCV疾病的患病风险或待测对象 PCV疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：十四烷酰基左旋肉碱、羟基十四碳二烯基左旋肉碱、十二烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PCV疾病的患病风险或待测对象 PCV疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C26:0、溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0、磷脂酰胆碱二酰基C24:0、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PCV疾病的患病风险或待测对象 PCV疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1、羟基十八碳酰-L-肉碱、羟基十六碳二烯基左旋肉碱、十六碳二烯基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PM疾病的患病风险或待测对象 PM疾病诊断时，所述生物标志物集合包括溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PM疾病的患病风险或待测对象 PM疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：十四碳二烯-L-肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，当用于评估待测对象的PM疾病的患病风险或待测对象 PM疾病诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述的评估或诊断包括步骤：
(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；
(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；
较佳地，所述的参考数据集包括来源于黄斑新生血管疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；
较佳地，所述的参考数据集包括来源于AMD患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；
所述的参考数据集包括来源于PCV疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；
所述的参考数据集包括来源于PM患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平。
在另一优选例中，所述的样品选自下组：血液、血浆、和血清。
在另一优选例中，所述的将步骤(1)测得的水平与一参考数据集进行比较，还包括建立一多元统计模型从而输出患病可能性的步骤，较佳地，所述的多元统计模型为正交偏最小二乘回归判别分析模型。
在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.5，所述的对象被判定为具有AMD 疾病患病风险或患有AMD疾病。
在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有AMD疾病患病风险或患有AMD疾病，
其中子集H包括生物标志物b1-b4。
在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.5，所述的对象被判定为具有PCV 患病风险或患有PCV疾病。
在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有PCV患病风险或患有PCV疾病，
其中子集H包括生物标志物b1-b4。
在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.5，所述的对象被判定为具有PM 患病风险或患有PM疾病。
在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有PM患病风险或患有PM疾病，
其中子集H包括生物标志物b1-b4。
在另一优选例中，通过质谱法对各个生物标志物的水平进行检测，较佳地，通过色谱质谱联用，如气相色谱-质谱法(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)法。
在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。
本发明第五方面提供了一种评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险或待测对象黄斑新生血管疾病诊断的方法，包括步骤：
(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中集合中各个生物标记物的水平进行检测，所述集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合；
(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；
较佳地，所述的参考数据集包括来源于黄斑新生血管疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平。
在另一优选例中，所述的参考数据集包括来源于AMD疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平。
在另一优选例中，所述的参考数据集包括来源于PCV疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平。
在另一优选例中，所述的参考数据集包括来源于PM疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平。
本发明第六方面提供了一种筛选治疗黄斑新生血管疾病的候选化合物的方法，包括步骤：
(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中集合中各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述集合中各个生物标记物的水平V2；
(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗黄斑新生血管疾病的候选化合物，其中所述集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
在另一优选例中，所述的待测对象为黄斑新生血管疾病患者。
在另一优选例中，如果一个或多个选自子集H的生物标志物的水平V1显著低于水平V2，表明测试化合物为治疗黄斑新生血管疾病的候选化合物，
其中子集H包括生物标志物b1-b14。
在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b1-b4。
在另一优选例中，所述“显著低于”指水平V1/水平V2的比值≤0.8，较佳地≤0.6，更佳地，≤0.4。
本发明第七方面提供了一种生物标志物集合的用途，用于筛选治疗黄斑新生血管疾病的候选化合物和/或用于评估候选化合物对黄斑新生血管疾病的治疗效果，其中，所述生物标志物集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
本发明第八方面提供了一种建立评估黄斑新生血管疾病患病风险或用于黄斑新生血管疾病诊断的质谱模型的方法，所述的方法包括：识别患者和健康对照者之间，血液样品中差异表达物质的步骤,
其中，所述的差异表达物质包括一种或多种生物标志物集合中的生物标志物，其中，所述生物标志物集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一个实施例中研究的人口学特征及临床特征。
图2显示了黄斑新生血管性疾病组及对照组的主成分1和2的主成分分析得分图。
图3显示了年龄相关性黄斑变性组及对照组的前两个及三个主成分的主成分分析得分图。
图4显示了年龄相关性黄斑变性组及对照组的正交偏最小二乘判别分析得分图。
图5A为不同黄斑新生血管性疾病相关脂质标记物的热图；
图5B为差异脂质相关性分析的热图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了黄斑新生血管性疾病的新的生物标志物。具体地，本发明发现了一种生物标志物集合，所述的集合包括多种黄斑新生血管性疾病的生物标志物，可以用于评估待测对象的黄斑新生血管性疾病的患病风险或待测对象的黄斑新生血管性疾病的诊断，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。在此基础上，发明人完成了本发明。
具体地，本发明招募了诊断为黄斑新生血管性疾病(包括：年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视)的患者，并以无眼底疾病的白内障患者作为对照组。利用OCT、FFA以及ICGA对所有患者的黄斑厚度及体积进行检测。收集患者的空腹血样，利用超高效液相色谱/串联质谱法结合模式识别技进行脂质的检测。应用正交偏最小二乘判别分析法来筛选能够区分黄斑新生血管性疾病组及对照组有差异的脂质代谢物。最后，在黄斑新生血管性疾病组中，识别出14个有统计学差异的脂质标志物。
术语
本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
根据本发明，术语“黄斑新生血管性疾病”，是以黄斑区脉络膜新生血管生成为特征的一组疾病，包括：年龄相关性黄斑变性(AMD)、息肉样脉络膜血管病变(PCV)及病理性高度近视(PM)等。AMD多表现为玻璃体膜疣及视网膜色素上皮损害，PCV是一种在亚洲人群中发病率较高的黄斑病变，特点为视网膜下橘红色结节样病灶和吲哚青绿色血管造影所显示的异常分支状脉络膜血管网及其末梢的息肉状脉络膜血管扩张灶，PM的病理特征包括漆裂纹、片状萎缩、脉络膜和脉络膜毛细血管变薄等。
根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。
根据本发明，生物标志物质的水平通过通过质谱信号面积归一化值指示。
根据本发明，参考集指训练集。
根据本发明，由现有技术可知，训练集和验证集具有相同的含义。在本发明的一个实施方式中，训练集指黄斑新生血管性疾病患者和健康对照生物样品中的生物标志物水平的集。在本发明的一个实施方式中，验证集是指用于测试训练集性能的数据集。在本发明的一个实施方式中，生物标志物的水平可以根据测定的方法代表为绝对值或相对值。例如，当用质谱来测定生物标记物的水平时，峰的强度可以代表生物标记物水平，这是一个相对值的水平；当用PCR 来测定生物标志物的水平时，基因的拷贝数或基因片段的拷贝数可以代表的生物标志物的水平。
在本发明的一个实施方式中，参照值是指健康对照的参考值或正常值。本领域的技术人员清楚，在样品数量足够多情况下，每个每个生物标记的正常值 (绝对值)的范围可以通过检验和计算方法得到。因此，当利用除质谱以外的其他方法来检测生物标志物的水平时，这些生物标记物水平的绝对值，可以直接与正常值比较，从而评价患有黄斑新生血管疾病(尤其是年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视)的风险，以及诊断或早期诊断黄斑新生血管疾病(尤其是年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视)。在本发明中，还可以使用统计方法。
根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG 标记)等。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。
根据本发明，术语“血浆”指的是全血的液体成分。根据所使用的分离方法，血浆可能完全不含细胞成分，也可能含有不同量的血小板和/或少量其它细胞成分。
根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。
检测方法
根据本发明，质谱(MS)可以分为离子阱质谱、四极杆质谱、轨道阱质谱和飞行时间质谱，偏差分别为0.2amu、0.4amu、3ppm和5ppm。在本发明中，利用飞行时间质谱获得MS数据。
试剂盒
在本发明中，本发明的试剂盒包括本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。
在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于黄斑新生血管疾病患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平的参考数据集。
评估方法
在另一优选例中，本发明方法可通过公式S＝W1S1+W2S2+WiS3+……WnSn计算加权综合评分；
其中，W1、W2……Wn为权重；
S1、S2……Sn为每个标志物的评分。
优选地，所述权重可以基于表1、表2和/或表3中的VIP值。例如对于 AMD的评估而言，任一权重(如W1)可以为表1中相应标志物的VIP值。对于PCV 的评估而言，任一权重(如W1)可以为表2中相应标志物的VIP值。例如对于 PM的评估而言，任一权重(如W1)可以为表3中相应标志物的VIP值。对于黄斑新生血管性疾病评估而言，任一权重(如W1)可以为表1、表2和表3中相应标志物的对应VIP值的均值(当某一标志物在表1-3中无相应VIP值时，则设VIP 值＝1)。在一优选实施方式中，正常人群的Ssubject＝W1S1+W2S2+WiS3+…… WnSn。
易感人群的Ssubject'＝W1'S1'+W2'S2'+Wi'S3'+……Wn'Sn'。
当某一标志物的Fold change＞预定阈值(如，1.2、1.5、1.8)时，则该标志物的相应评分记为1(异常)，否则记为0(正常)。
累加后，与正常人群的Ssubject比较，当某一对象的Ssubject'显著高于与正常人群的Ssubject，则表明该对象患黄斑新生血管性疾病的风险高于正常人群。
本发明的实验结果表明，本发明的标志物可显著提高黄斑新生血管疾病诊断(尤其是AMD、PCV、PM)的准确性。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明以血浆脂质标记物作为生物标志物用于黄斑新生血管疾病(尤其是年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视)的早期筛查、预判、防治，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。
(b)血浆作为生物标志物检测样本具有取材方便、操作步骤简单和可连续体外检测等优点。
(c)本发明的血浆脂质标记物用于黄斑新生血管疾病(尤其是年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视)的早期筛查、预判、防治具有重复性好的特点。
(b)本发明首次发现，羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱可作为同时诊断年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜血管病变及病理性高度近视的血浆脂质标记物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
化学名称
英文名称 中文名称
Tetradecadienyl-L-carnitine 十四碳二烯-L-肉碱
Decanoyl-L-carnitine 癸酰基-L-肉碱
Tetradecanoyl-L-carnitine 十四烷酰基左旋肉碱
Hydroxytetradecenoyl-L-carnitine 羟基十四烷酰基左旋肉碱
Dodecanoyl-L-carnitine 十二烷酰基左旋肉碱
Phosphatidylcholine diacyl C26:0 磷脂酰胆碱二酰基C26:0
Hydroxytetradecadienyl-L-carnitine 羟基十四碳二烯基左旋肉碱
lysoPhosphatidylcholine acyl C26:0 溶血磷脂酰胆碱酰基C26:0
lysoPhosphatidylcholine acyl C28:0 溶血磷脂酰胆碱酰基C28∶0
Phosphatidylcholine diacyl C24:0 磷脂酰胆碱二酰基C24:0
Hexadecadienyl-L-carnitine 十六碳二烯基左旋肉碱
lysoPhosphatidylcholine acyl C26:1 溶血磷脂酰胆碱酰基C26：1
Hydroxyoctadecenoyl-L-carnitine 羟基十八碳酰-L-肉碱。
Hydroxyhexadecadienyl-L-carnitine 羟基十六碳二烯基左旋肉碱
实施例1
患者招募入组
在上海市第一人民医院眼科中心共招募了328名患者，其中24.7％(81名)对照组，26.8％(88名)为年龄相关性黄斑变性患者(AMD)，31.1％(102名)息肉样脉络膜血管病变患者(PCV)，以及17.4％(57名)病理性高度近视患者(PM)。我们对所有患者均运用OCT、FFA以及ICGA检测其黄斑厚度及体积。
结果见图1，本研究的人口学特征及临床特征。
实施例2黄斑新生血管性疾病各亚型的脂质组学表现形式
利用超高效液相色谱/串联质谱法结合模式识别技术对对照组及黄斑新生血管性疾病的三个不同亚型患者血液样本进行脂质组学分析，共鉴定出14种代谢物。并且应用正交偏最小二乘判别分析法来筛选能够区分黄斑新生血管性疾病组及对照组的有统计学差异脂质代谢物。
结果见图2-5及图1。
图2：黄斑新生血管性疾病组及对照组的主成分1和2的主成分分析得分图。黄斑新生血管性疾病组与对照组在得分图上有明显的分离趋势，说明黄斑新生血管疾病在脂质代谢上存在异常。
图3：年龄相关性黄斑变性组及对照组的前两个及三个主成分的主成分分析得分图。年龄相关性黄斑变性组与对照组在得分图上有明显的分离趋势，说明年龄相关性黄斑变性组与对照组脂质代谢存在明显差异。
图4：年龄相关性黄斑变性组及对照组的正交偏最小二乘判别分析(OPLSDA) 得分图。OPLSDA得分图上，AMD和对照组完全分离，200次置换检验结果显示， OPLSDA模型拟合良好，没有过拟合。
图5A：不同黄斑新生血管性疾病相关脂质标记物的热图；图5B：差异脂质相关性分析的热图。
黄斑新生血管性疾病组及对照组相较有统计学差异的脂质及其受试者工作特征曲线(ROC)下面积的结果示于表1。
表1黄斑新生血管性疾病组(AMD)及对照组相较有统计学差异的新的代谢物
Figure BDA0001909187270000151
Figure BDA0001909187270000161
表2黄斑新生血管性疾病组(PCV)及对照组相较有统计学差异的新的代谢物
Figure BDA0001909187270000162
表3黄斑新生血管性疾病组(PM)及对照组相较有统计学差异的新的代谢物
Figure BDA0001909187270000163
Figure BDA0001909187270000171
表4
Figure BDA0001909187270000172
Figure BDA0001909187270000181
Figure BDA0001909187270000191
Figure BDA0001909187270000201
Figure BDA0001909187270000211
实施例3
对于约500人构成的人群(包括200个正常、以及300个临床诊断为患AMD、 PCV和/或PM的患者)，采用双盲法进行检测，并基于表5所示的标志物和阈值对黄斑新生血管性疾病进行诊断或评估。
结果如表5所示。
表5四种主要标志物在AMD、PM、PCV的预测正确率
Figure BDA0001909187270000221
如表5所示，在本发明中，即使仅用单个标志物，比如羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱，采用相应阈值时，在正常人群中高于该阈值的人数百分比均低于10％，而在黄斑新生血管性疾病中高于该阈值的人数百分比均高于30％(甚至高于 50％)，这表明，这些标志物可提供黄斑新生血管疾病患病或易感性的有用的辅助诊断信息，从而尤其用于早期和/或辅助诊断。
此外，当采用多个标志物进行综合评判时(包括简单综合评判和加权综合评判)，可以进一步地显著提高评判的准确性和特异性。
具体地，当所述十四烷酰基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、羟基十四碳二烯基左旋肉碱的阈值分别被设定为0.494、0.449、 0.925、0.235时，含量同时高于这4个阈值的正常人群仅为约6％；而含量同时高于这4个阈值的对象，在AMD、PM、PCV患者中百分比分别为约48％、42％和55％。这表明，这四个标志物具有很高的预测价值，尤其是组合使用，可进一步提高黄斑新生血管疾病诊断的准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种试剂组合，其特征在于，所述试剂组合用于黄斑新生血管疾病的患病风险评估或诊断，并且所述试剂组合包括用于检测一生物标志物集合中各个生物标记物的试剂，
其中，所述生物标志物集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
2.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述生物标志物集合为用于诊断AMD疾病的生物标志物集合，包括选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
3.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述生物标志物集合为用于诊断PCV疾病的生物标志物集合，包括选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
4.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述生物标志物集合为用于诊断PM疾病的生物标志物集合，包括羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱、或其组合。
5.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的集合包括两种或多种选自表A的生物标志物：
表A
Figure 1
Figure 747001DEST_PATH_IMAGE001
。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的试剂组合。
7.一种生物标志物集合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒中包括用于检测所述生物标志物集合中各个生物标志物的试剂，所述的试剂盒用于评估待测对象的黄斑新生血管疾病患病风险或待测对象黄斑新生血管疾病诊断，其中，所述生物标志物集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述黄斑新生血管疾病选自下组：AMD、PCV、PM、或其组合。
9.一种建立评估黄斑新生血管疾病患病风险或用于黄斑新生血管疾病诊断的质谱模型的方法，其特征在于，所述的方法包括：识别患者和健康对照者之间，血液样品中差异表达物质的步骤,
其中，所述的差异表达物质包括一种或多种生物标志物集合中的生物标志物，其中，所述生物标志物集合包括一种或多种选自下组的生物标志物：羟基十四碳二烯基左旋肉碱、羟基十四烷酰基左旋肉碱、十四碳二烯-L-肉碱、十四烷酰基左旋肉碱。
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