JP5757627B2 - 高機能自閉症の発症危険度を判定する方法およびマーカー - Google Patents
高機能自閉症の発症危険度を判定する方法およびマーカー Download PDFInfo
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Description
本出願は、日本特許出願２００９−２３６９７６（２００９年１０月１４日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、自閉症者を早期に発見する方法に関する。詳しくは、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含む、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。また、血漿または血清中のコレステロール濃度および／または中性脂肪濃度を測定する工程を含む、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。
自閉症はアメリカのカナー博士により１９４３年に「情緒接触の自閉的障害」として最初に記載された障害である。発症は極めて早期で３歳位までに現れ、他者との社会的関係の形成の困難さ、言葉の発達の遅れ、強迫的な同一性保持（興味や関心が狭く特定のものにこだわること）を主要症状とする。自閉症は発達の過程によって状態が変わっていく発達障害であり、未だ特定できない高次の中枢神経系の障害であると推測されている。
高機能自閉症とは自閉症のうち知的発達の遅れを伴わないものをいう。自閉症の罹病率は、子供１万人あたり７〜１６人であり、高機能自閉症は自閉症のおよそ１１〜３４％であると報告されている（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００４）。
自閉症の原因は現在のところ明らかでなく、根治的治療法は確立されていない。そのため早期発見にもとづく専門家の教育的介入（これを療育という）が、自閉症者の社会生活適応において重要である。療育の開始時期は早いほど効果的とされており、自閉症の症状が初めて現れる２歳前後に開始できることが望ましい。しかし、自閉症には客観的・生物学的な検査判定基準がないため、自閉症診断は医師が症状のみで行わなければならず、これには児童精神医学の現場での豊富な経験を必要とする。したがって、その分野の専門家がまだ不足している今日では自閉症者の早期発見が非常に困難というのが現状である。
なお、現在、自閉症の診断は、米国精神医学会の診断基準（ＤＳＭ−ＩＶ）、世界保健機構ＷＨＯのＩＣＤ−１０、ＡＤＩ−Ｒ（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｖｉｓｅｄ）を用いた面接で行なわれている。
自閉症の原因は現在のところ明らかではないものの、これまでに種々の報告がなされている。例えば、自閉症では出生後早期に頭囲の拡大が認められており、この時期の神経細胞やグリア細胞の新生の増加もしくは細胞死の減少が関与していると考えられる（ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５）。他に、ＦａｔｅｍｉらはＲｅｅｌｅｒマウスにみられる中枢神経発達障害に着目し、Ｒｅｅｌｅｒマウスの責任遺伝子Ｒｅｅｌｉｎの受容体である超低密度リポ蛋白質受容体（ＶＬＤＬ受容体：Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｍＲＮＡの増大が自閉症者死後脳の前頭葉および小脳でみられると報告した（Ｆａｔｅｍｉ ｅｔ ａｌ ２００５）。一方Ｓｈａｒｐらはプロテオーム解析によって自閉症児に特異的なａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−１００濃度の低下を見出している（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ ２００７）。元来ＶＬＤＬはａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−１００を含有した蛋白質・脂質の複合体であり、この分子の体内での発現変化は脂質代謝との関連を予想させる。しかし、これまで自閉症者の末梢血脂質分画について調べた報告はなく、自閉症者と血清脂質レベルとの関連を示す報告もなかった。
また、血清サンプル中の特定の成長因子の量を測定することにより自閉症を診断する発明が開示されている（特開２００８−３２４４７）。しかしながら、これらの成長因子の動向は脂質代謝とは何ら関連するものではない。
以上の通り、自閉症の病態の特殊性から、早期診断に基づく予防、あるいは早期治療、社会復帰支援といった包括的な治療体系の確立を目指して研究が進められているが、早期診断を可能とする自閉症の生物学的マーカーは未だ確立されていない。
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ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５
Ｆａｔｅｍｉ ｅｔ ａｌ ２００５
Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ ２００７
本発明の目的は、生物学的マーカーを用いた、客観的で簡便な自閉症の発症危険度を判定する方法を提供すること、該方法を用いて自閉症者を早期に発見することにより、自閉症者に早期に適切な治療を提供することを可能とすることにある。
上記目的を達成するため、発明者らは、高機能自閉症群と健常対照者群の血清を収集、比較して、未成年の自閉症者の超低密度リポタンパク質分画中の中性脂肪濃度が有意に低下していることを見出し、かかる現象に基づき、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、高機能自閉症群と健常対照者群の血清を収集、比較して、未成年の自閉症者のコレステロールおよび中性脂肪の双方で総量が有意に低下していること、および未成年の自閉症者の超低密度リポタンパク質分画中のコレステロール濃度が有意に低下していることを見出し、これらの現象に基づき、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含み、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が、６０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに自閉症の発症危険度が高いと判断することを特徴とする、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。
前記被検者は１８歳以下であることが望ましい。
さらに、前記被検者が８歳以下、血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が３０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに自閉症の発症危険度が高いと判断することができる。
また、本発明は、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、１または２以上の酵素と発色剤を含む、自閉症の発症危険度判定用キットも提供する。
さらに本発明は、自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（ｂ）非ヒト哺乳動物から血漿または血清を単離する工程、
（ｃ）単離した血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度を測定する工程、および
（ｄ）被検物質を投与する前と比べて、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が上昇することを指標として、被検物質が自閉症治療薬の候補物質であると判定する工程
を含むことを特徴とするスクリーニング方法も提供する。
（ａ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（ｂ）非ヒト哺乳動物から血漿または血清を単離する工程、
（ｃ）単離した血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度を測定する工程、および
（ｄ）被検物質を投与する前と比べて、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が上昇することを指標として、被検物質が自閉症治療薬の候補物質であると判定する工程
を含むことを特徴とするスクリーニング方法も提供する。
また、本発明は、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含み、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれるコレステロール濃度が、健常者の血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれるコレステロール濃度の標準値−標準誤差よりも低いときに自閉症の発症危険度が高いと判断することを特徴とする、自閉症の発症危険度を判定する方法も提供する。
さらに、本発明は、被検者より単離された血漿または血清中のコレステロール濃度および／または中性脂肪濃度を測定する工程を含み、前記コレステロール濃度が健常者のコレステロール濃度の標準値−標準誤差よりも低いとき、および／または前記中性脂肪濃度が健常者の中性脂肪濃度の標準値−標準誤差よりも低いときに自閉症の発症危険度が高いと判断することを特徴とする、自閉症の発症危険度を判定する方法も提供する。
本発明は、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、および発色剤を含む、自閉症の発症危険度判定用キットも提供する。
上記自閉症は、高機能自閉症であってもよい。
本発明により、初めて生物学的な高機能自閉症の発症危険度判定基準を定めることができた。また、本発明は、末梢血の採取という簡便かつ被検者の負担が最小限に抑えられる方法によって実施することができる。
本発明によって、これまで医師の主観によるものが大きかった自閉症の診断が、生物学的基準を導入した診断となることから、診断技術の向上が予想される。また自閉症者の療育は、早ければ早いほどその効果が期待されるところ、本発明法は幼児や児童に適応可能であり、早期発見、早期療育が可能となる。このことは、自閉症者が将来、社会生活を営む上で非常に効果的である。また、自閉症者が引き起こす事件がクローズアップされている現代、これらの問題に対応するという観点からの社会的効果は大きい。
本発明により、自閉症の早期、簡便かつ信頼性のある診断が可能となる。特にヒトの血液試料中の中性脂肪ＶＬＤＬ分画濃度を２段階で測定することによって、自閉症の診断補助を容易に行うことができる。
本発明は、自閉症者を早期に発見する方法に関する。詳しくは、被検者より単離された血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含む、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。
１．定義
「自閉症」は小児期に診断される広汎性発達障害の一つで、主要症状としてコミュニケーションの障害、社会的相互作用の障害、限局した興味と行動、知覚過敏や多動傾向が３歳までに現れる。「高機能自閉症」とは、上記の自閉症のうち、知的発達の遅れを伴わないものをいう。
「自閉症」は小児期に診断される広汎性発達障害の一つで、主要症状としてコミュニケーションの障害、社会的相互作用の障害、限局した興味と行動、知覚過敏や多動傾向が３歳までに現れる。「高機能自閉症」とは、上記の自閉症のうち、知的発達の遅れを伴わないものをいう。
本願発明において、「自閉症の発症危険度」とは、被検者が自閉症を発症するか否か、または自閉症を発症しているか否かを判断するための、自閉症の検査判定基準をいう。自閉症の発症危険度が高いほど自閉症を発症する可能性が高いまたは自閉症者であると判断され、低いほど発症する可能性が低いまたは健常者であると判断される。
「超低密度リポタンパク質（ｖｅｒｙ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ： ＶＬＤＬ）」とは、血液中のリポタンパク質の一つである。リポタンパク質は遠心分離によって測定される密度によって分類されており、他に、カイロミクロン（ＣＭ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）がある。これらのリポタンパク質は、タンパク質、中性脂肪、遊離コレステロール、コレステロールエステル、およびリン脂質からなる点は共通するが、それぞれ特徴的なアポタンパク質を含み、脂質組成が異なる点で相違する。
「超低密度リポタンパク質分画」または「ＶＬＤＬ分画」とは、血漿または血清を遠心分離して得られる、密度が０．９５０〜１．００６ｇ／ｍｌの画分をいう。同様に、「カイロミクロン分画」または「ＣＭ分画」とは、血漿または血清を遠心分離して得られる、密度が＜０．９５ｇ／ｍｌの画分を、「低密度リポタンパク質分画」または「ＬＤＬ分画」とは、血漿または血清を遠心分離して得られる、密度が１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌの画分を、「高密度リポタンパク質分画」または「ＨＤＬ分画」とは、血漿または血清を遠心分離して得られる、密度が１．０６３〜１．２１０ｇ／ｍｌの画分をいう。
「中性脂肪」、「トリアシルグリセロール」、または「ＴＧ」とは、脂肪酸とグリセロールとのトリエステル化合物である。
本発明において「未成年」または「児童」とは、１８歳以下のヒトを指す。
「カットオフ値」とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる。
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。
ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が０．５を超えない判定方法は、有用とは認められない。
２．自閉症の発症危険度を判定する方法
本発明は、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含む、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。
本発明は、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含む、自閉症の発症危険度を判定する方法に関する。
（１）単離工程
本発明において測定される試料は、被検者より通常採取した血液から、血漿または血清を調製して用いる。本発明は、末梢血を試料として用いることができる。血漿または血清を調製する方法としては、本分野において周知の方法を用いることができる。取得した血漿または血清は、測定するまで凍結保存してもよい。
本発明において測定される試料は、被検者より通常採取した血液から、血漿または血清を調製して用いる。本発明は、末梢血を試料として用いることができる。血漿または血清を調製する方法としては、本分野において周知の方法を用いることができる。取得した血漿または血清は、測定するまで凍結保存してもよい。
（２）測定工程
本発明において、測定工程は、超遠心法やゲル濾過等の本分野において周知の方法により、被検者より単離された血漿または血清を分離して各分画を得、次に分画中の中性脂肪濃度またはコレステロール濃度を測定することにより行われる。ゲル濾過ＨＰＬＣ法を用いると、血清を分離して各分画を検出および定量することができる。血漿中および血清中において、脂質濃度に差はない。
本発明において、測定工程は、超遠心法やゲル濾過等の本分野において周知の方法により、被検者より単離された血漿または血清を分離して各分画を得、次に分画中の中性脂肪濃度またはコレステロール濃度を測定することにより行われる。ゲル濾過ＨＰＬＣ法を用いると、血清を分離して各分画を検出および定量することができる。血漿中および血清中において、脂質濃度に差はない。
前述の通り、血漿または血清中のリポタンパク質は、その密度によりカイロミクロン、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分画される。血清の各分画への分離、定量は、ゲル濾過ＨＰＬＣ法等周知の方法に従い実施できる。
（ｉ）中性脂肪濃度の測定
本発明においては、直接ＶＬＤＬ中の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定してもよいし、まず血漿または血清中の中性脂肪の総量を測定し、中性脂肪の総量が一定値未満の場合にＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定する、という２段階の測定を行ってもよい。２段階の測定を行う場合、中性脂肪の総量が８０ｍｇ／ｄｌ未満、好ましくは７０ｍｇ／ｄｌ未満、より好ましくは６０ｍｇ／ｄｌ未満の場合に、ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定することが望ましい。こうして測定を２段階にすることにより、自閉症の診断補助を容易に行うことができる。
本発明においては、直接ＶＬＤＬ中の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定してもよいし、まず血漿または血清中の中性脂肪の総量を測定し、中性脂肪の総量が一定値未満の場合にＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定する、という２段階の測定を行ってもよい。２段階の測定を行う場合、中性脂肪の総量が８０ｍｇ／ｄｌ未満、好ましくは７０ｍｇ／ｄｌ未満、より好ましくは６０ｍｇ／ｄｌ未満の場合に、ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定することが望ましい。こうして測定を２段階にすることにより、自閉症の診断補助を容易に行うことができる。
中性脂肪の濃度は、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）によりトリグリセリドから生成するグリセリンを測定する方法に基づき、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）法、グリセロールオキシダーゼ（ＧＯＤ）法、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）法等により測定することができる。
例えば、ＧＰＯ−ＤＡＯＳ法では、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いて生じる過酸化水素をＤＡＯＳにより定量することで、中性脂肪量を測定することができる。具体的には、ＧＰＯ−ＤＡＯＳ法は以下の工程を含む：
１）試料中の中性脂肪をリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）の作用によりグリセリンと脂肪酸に分解する、
２）生成したグリセリンをＡＴＰ存在下でグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の作用によりグリセロール−３−リン酸とする、
３）生成したグリセロール−３−リン酸を、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の作用により酸化させ、同時に過酸化水素を生じさせる、
４）生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＮ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる、および
５）生じた青色色素の吸光度を測定することにより検体中の中性脂肪濃度を算出する。
１）試料中の中性脂肪をリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）の作用によりグリセリンと脂肪酸に分解する、
２）生成したグリセリンをＡＴＰ存在下でグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の作用によりグリセロール−３−リン酸とする、
３）生成したグリセロール−３−リン酸を、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の作用により酸化させ、同時に過酸化水素を生じさせる、
４）生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＮ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる、および
５）生じた青色色素の吸光度を測定することにより検体中の中性脂肪濃度を算出する。
同様に、「ＮＡＤ」法では、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼを使用して生成する過酸化水素を定量する。
（ｉｉ）コレステロール濃度の測定
本発明においては、直接ＶＬＤＬ中のコレステロール濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定してもよいし、まず血漿または血清中のコレステロールの総量を測定し、コレステロールの総量が一定値未満の場合にＶＬＤＬ分画のコレステロール濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定する、という２段階の測定を行ってもよい。こうして測定を２段階にすることにより、自閉症の診断補助を容易に行うことができる。
本発明においては、直接ＶＬＤＬ中のコレステロール濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定してもよいし、まず血漿または血清中のコレステロールの総量を測定し、コレステロールの総量が一定値未満の場合にＶＬＤＬ分画のコレステロール濃度を測定して、自閉症の発症危険度を判定する、という２段階の測定を行ってもよい。こうして測定を２段階にすることにより、自閉症の診断補助を容易に行うことができる。
コレステロール濃度の測定は、コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法等により測定することができる。
例えば、コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法では、コレステロールオキシダーゼを用いて生じる過酸化水素をＤＡＯＳにより定量することで、コレステロール量を測定することができる。具体的には、コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法は以下の工程を含む：
１）試料中のコレステロールをコレステロールオキシダーゼの作用により酸化して、ケトン体と過酸化水素を発生させる、
２）生じた過酸化水素をペルオキシダーゼの作用によりＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる、および
３）生じた青色色素の吸光度を測定することにより検体中のコレステロール濃度を算出する。
１）試料中のコレステロールをコレステロールオキシダーゼの作用により酸化して、ケトン体と過酸化水素を発生させる、
２）生じた過酸化水素をペルオキシダーゼの作用によりＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）と４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる、および
３）生じた青色色素の吸光度を測定することにより検体中のコレステロール濃度を算出する。
本発明の別の態様においては、測定工程は、被検者より単離された血漿または血清中の中性脂肪の総量またはコレステロールの総量を測定することにより行われる。
（３）判定工程
発明者らは、健常者においては年齢にかかわらずほぼ一定のＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度が、自閉症者においては、幼少時に低く、加齢とともに増加するという知見を見出した。
発明者らは、健常者においては年齢にかかわらずほぼ一定のＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度が、自閉症者においては、幼少時に低く、加齢とともに増加するという知見を見出した。
この知見に基づき、本発明では、上述の方法により測定したＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度が健常者の標準値−標準誤差よりも低い場合に、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。具体的には、６０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。好ましくは、１８歳以下の被検者において、ＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度が５０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは４０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに、自閉症の発症危険度が高いと判断する。より好ましくは、８歳以下の被検者において、ＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度が４０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは３０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに、自閉症の発症危険度が高いと判断する。
また、本発明者らは、健常者に比べて、自閉症者の超低密度リポタンパク質分画中のコレステロール濃度が有意に低下していることを見出した。この知見に基づき、本発明では、上述の方法により測定したＶＬＤＬ分画中のコレステロール濃度が健常者の標準値−標準誤差よりも低い場合に、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。具体的には、２０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは１５ｍｇ／ｄｌ以下であるときに、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。
さらに、本発明者らは、健常者に比べて、自閉症者のコレステロールおよび中性脂肪の双方で総量が有意に低下していることを見出した。この知見に基づき、本発明では、上述の方法により測定した血漿または血清中の中性脂肪濃度またはコレステロール濃度が健常者の標準値−標準誤差よりも低い場合に、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。具体的には、コレステロール濃度が１６０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは１５０ｍｇ／ｄｌ以下であるとき、または中性脂肪濃度が８０ｍｇ／ｄｌ以下、好ましくは６０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに、被検者の自閉症の発症危険度が高いと判断する。
本発明に従うと、末梢血を用いた簡便な方法により、高機能自閉症の発症危険度を早期に高い正診率で判定することができる。
３．自閉症の発症危険度判定用キット
本発明に係るキットは、上記２．欄で説明した自閉症の発症危険度を判定する方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器などは、特に限定されるものではない。
本発明に係るキットは、上記２．欄で説明した自閉症の発症危険度を判定する方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器などは、特に限定されるものではない。
本発明のキットは、これらに限定されるものではないが、例えば単離した末梢血漿若しくは末梢血清中、または末梢血ＶＬＤＬ中の中性脂肪を測定するための試薬：リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）、グリセロールオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素から選ばれる１または２以上、およびＤＡＯＳ、ＦＤＡＯＳ等の発色試薬を含む。さらに、測定に必要な緩衝液を含んでもよい。
例えば、ＧＰＯ−ＤＡＯＳ法によって中性脂肪濃度を測定する場合であれば、本発明のキットは、グリセリン、緩衝液（ＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．５）、リボプロテインリパーゼ、アデノシン−５’−リン酸二ナトリウム三水和物（ＡＴＰ）、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）、ペルオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２’−ヒドロキシ−３’−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）、４−アミノアンチピリン、およびアスコルビン酸オキシダーゼから選ばれる１または２以上を含むことができる。
また、本発明のキットは、これらに限定されるものではないが、例えば単離した末梢血漿若しくは末梢血清中、または末梢血ＶＬＤＬ中のコレステロールを測定するための試薬：コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、および発色試薬を含むことができる。
かかるキットを使用して、高機能自閉症の発症危険度を判定することができる。
さらに、本発明にかかる自閉症の発症危険度判定用キットは、後述する自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングする方法のためのキットとしても利用できる。
４．自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングする方法
本発明の判定方法や判定キットは、非ヒト哺乳類動物を用いた自閉症治療薬の候補物質のスクリーニング方法に応用しうる。非ヒト哺乳類動物としては、ヒトを除く哺乳動物であればよいが、例えば、マウス、ラット、およびサル等を使用することができる。
本発明の判定方法や判定キットは、非ヒト哺乳類動物を用いた自閉症治療薬の候補物質のスクリーニング方法に応用しうる。非ヒト哺乳類動物としては、ヒトを除く哺乳動物であればよいが、例えば、マウス、ラット、およびサル等を使用することができる。
本発明は、自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（ｂ）非ヒト哺乳動物から血漿または血清を単離する工程、
（ｃ）単離した血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度を測定する工程、および
（ｄ）被検物質を投与する前と比べて、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が上昇することを指標として、被検物質が自閉症治療薬の候補物質であると判定する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
（ａ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（ｂ）非ヒト哺乳動物から血漿または血清を単離する工程、
（ｃ）単離した血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度を測定する工程、および
（ｄ）被検物質を投与する前と比べて、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が上昇することを指標として、被検物質が自閉症治療薬の候補物質であると判定する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
本発明の別の態様では、末梢血漿若しくは末梢血清中の中性脂肪濃度、コレステロール濃度、または末梢血漿若しくは末梢血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれるコレステロール濃度が上昇することを指標として、自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングすることもできる。
かかるスクリーニング方法を使用して、高機能自閉症治療薬の候補物質を選択することができる。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
１．被験者
高機能自閉症の男性１０６名〔平均年齢：１４．７歳（標準偏差５．９）、年齢範囲：６歳〜３０歳〕を被験者に選び、ならびに同一年齢層の健康者１１２名〔平均年齢：１５．１歳（標準偏差６．２）、年齢範囲：６歳〜３０歳〕を健常対照として被験者に選んだ。すべての患者は、高機能自閉症の診断基準ＡＤＩ−Ｒ（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｖｉｓｅｄ）に従って診断した。
高機能自閉症の男性１０６名〔平均年齢：１４．７歳（標準偏差５．９）、年齢範囲：６歳〜３０歳〕を被験者に選び、ならびに同一年齢層の健康者１１２名〔平均年齢：１５．１歳（標準偏差６．２）、年齢範囲：６歳〜３０歳〕を健常対照として被験者に選んだ。すべての患者は、高機能自閉症の診断基準ＡＤＩ−Ｒ（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｖｉｓｅｄ）に従って診断した。
２．実験方法
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。コレステロールと中性脂肪の脂質分画をＨＰＬＣ法により測定比較した。ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度はＳｋｙｌｉｇｈｔ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社に委託し、ゲル濾過ＨＰＬＣ法を用いて測定した。
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。コレステロールと中性脂肪の脂質分画をＨＰＬＣ法により測定比較した。ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度はＳｋｙｌｉｇｈｔ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社に委託し、ゲル濾過ＨＰＬＣ法を用いて測定した。
３．統計分析
データは平均値で示した。２群間の統計分析はt検定で解析した。０．０１未満のｐ値を統計的に有意とした。
データは平均値で示した。２群間の統計分析はt検定で解析した。０．０１未満のｐ値を統計的に有意とした。
４．結果
（１）自閉症者における血清中脂質濃度の低下
健常対照の未成年被験者および高機能自閉症の未成年被験者における、血清中脂質のリポ蛋白質分画濃度平均値を表１および図１に示す。
（１）自閉症者における血清中脂質濃度の低下
健常対照の未成年被験者および高機能自閉症の未成年被験者における、血清中脂質のリポ蛋白質分画濃度平均値を表１および図１に示す。
図１より明らかなとおり、高機能自閉症の未成年被検者の血清中脂質は、健常対照の未成年被検者と比べて、コレステロールおよび中性脂肪の双方で総量が有意に低下していることがわかった。さらに、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの各リポタンパク質分画中のコレステロールおよび中性脂肪濃度を調べると、ＶＬＤＬ分画とＨＤＬ分画において両者とも濃度の低下が認められ、特にＶＬＤＬ分画において顕著に低下していた。カイロミクロン、ＬＤＬ分画については有意差が認められなかった。
（２）ＶＬＤＬ分画のコレステロール濃度・中性脂肪濃度の低下と年齢との相関
自閉症者と健常対照者の、ＶＬＤＬ分画中のコレステロール濃度と年齢との関係を図２に、ＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度と年齢との関係を図３に示す。
自閉症者と健常対照者の、ＶＬＤＬ分画中のコレステロール濃度と年齢との関係を図２に、ＶＬＤＬ分画中の中性脂肪濃度と年齢との関係を図３に示す。
図２より明らかなとおり、健常対照のＶＬＤＬ分画のコレステロール濃度は年齢に関係なくほぼ一定だが、自閉症者のＶＬＤＬ分画のコレステロール濃度は幼少時に最も低く、加齢とともに増加した。
ＶＬＤＬに含まれる脂質は中性脂肪が大部分であることから、中性脂肪濃度において、その傾向が一層顕著に認められた（図３）。そのため、ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度の低下は、高機能自閉症の早期診断に有効であると考えられた。
（３）カットオフ値
ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度の方が、コレステロール濃度に比べて、幼少時に低く、加齢とともに増加するという傾向が顕著であったため、中性脂肪濃度についてカットオフ値を検索した。
ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度の方が、コレステロール濃度に比べて、幼少時に低く、加齢とともに増加するという傾向が顕著であったため、中性脂肪濃度についてカットオフ値を検索した。
その結果、特に、８歳以下の患者において、ＶＬＤＬ分画の中性脂肪濃度が３０ｍｇ／ｄｌより低い場合、感度８３％、特異度９０％、正診率８６％の高率で、高機能自閉症者をスクリーニングすることができた（図３）。なお、未成年全体、すなわち１８歳以下では、感度６３％、特異度７２％、正診率６７％であった。
したがって、本実験により、血液中性脂肪ＶＬＤＬ分画は自閉症の生物学的マーカーとして有用であることが確認できた。
本発明によって、これまで医師の主観によるものが大きかった自閉症の診断が、生物学的基準を導入した診断となることから、診断技術の向上が予想される。また自閉症者の療育は、早ければ早いほどその効果が期待されるところ、本発明法は幼児や児童に適応可能であり、早期診断に基づく予防、あるいは早期治療、社会復帰支援といった包括的な治療体系の確立を可能とする。
Claims (10)
- 被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質を測定する工程を含み、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が、６０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに自閉症が検出されることを特徴とする、自閉症の検出方法。
- １８歳以下の被検者において、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が、６０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに自閉症が検出されることを特徴とする、請求項１に記載の自閉症の検出方法。
- ８歳以下の被検者において、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が、３０ｍｇ／ｄｌ以下であるときに自閉症が検出されることを特徴とする、請求項１に記載の自閉症の検出方法。
- 自閉症が高機能自閉症である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、１または２以上の酵素と発色剤を、被検者より単離された血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度の測定試薬として含む、自閉症の検査用キット。
- 自閉症が高機能自閉症である、請求項５に記載のキット。
- 自閉症治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（ｂ）非ヒト哺乳動物から血漿または血清を単離する工程、
（ｃ）単離した血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度を測定する工程、および
（ｄ）被検物質を投与する前と比べて、血漿または血清中の超低密度リポタンパク質分画に含まれる中性脂肪濃度が上昇することを指標として、被検物質が自閉症治療薬の候補物質であると判定する工程
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。 - 自閉症が高機能自閉症である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
- 被検者より単離された血漿または血清中のコレステロール濃度および中性脂肪濃度を測定する工程を含み、前記コレステロール濃度が健常者のコレステロール濃度の標準値−標準誤差よりも低いとき、および前記中性脂肪濃度が健常者の中性脂肪濃度の標準値−標準誤差よりも低いときに自閉症が検出されることを特徴とする、自閉症の検出方法。
- 自閉症が高機能自閉症である、請求項９に記載の方法。
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