CN109628421B

CN109628421B - 一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN109628421B
Application number: CN201910025135.6A
Authority: CN
Inventors: 宋传奎; 陈永先
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: CN109628421A

Abstract

本发明公开了一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用，糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码SEQ ID No.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用UGT10编码的蛋白，可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生成。为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生产提供了一种特异高效的生物合成方法。

Description

一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用。

背景技术

呋喃酮(4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,Furaneol,DMHF)，又称菠萝酮或草莓酮。它是一种非常重要的香气，具有强烈的焙烤焦糖香味，特征香气为果香、焦香、焦糖和菠萝样香气。自从1965年J.O.Rodin等人在菠萝汁的***萃取液中首次鉴定出呋喃酮以来，由于其低香气阈值、令人愉悦的香味和显著的增香效果，引起了合成者极大的兴趣，更博得风味研究工作者们的青睐。呋喃酮是用途极广的天然安全香料，广泛应用于食品、饮料、烟草、保健品等行业。呋喃酮在中国的香料香精行业具有不可替代的地位，是一种优良的甜味香料和增香剂，为美国食用香料制造者协会(FEMA NO.3134)和欧洲理事会(COE NO.536)共同认可的安全食用香料。

呋喃酮同时也是植物中重要的香气物质，是草莓、葡萄、茶的风味中的重要组成部分。研究表明，呋喃酮是真正贡献于草莓风味的15种香气活性物质中最关键的一种。同时，也是某些葡萄品种制成葡萄酒的重要香气的组成成分。另外，呋喃酮也是茶叶一些香气的重要组成成分。近年来有研究表明，呋喃酮是茉莉花茶、乌龙茶中甜香及烘焙茶叶茎产生特征性风味中甜香和焦糖香的重要组成成分。

研究表明，在植物体内，呋喃酮以一个未知的糖基转移酶催化的糖基化反应形成的糖苷，稳定存在于植物中。相比游离态香气物质，香气糖苷性质更稳定，水溶性更强，且具有多种重要的生物学功能，在化妆品、食品和药物开发领域具有巨大的商业价值。香气糖苷主要由UGT通过糖基化作用催化合成。糖苷化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，在调节植物细胞代谢平衡、解除外源毒素毒性、维持植物正常生长发育等方面具有重要作用，同时也可以通过代谢工程途径改善植物的香气成分。

目前，香气糖苷的合成主要通过化学和生物两种手段实现，生物合成由于使用酶或者工程菌在常温下进行转化，对环境无污染，且对位点选择性较强，产物单一，不需要外源催化剂的使用，安全可靠，在功能食品中具有非常大的潜力。但目前多种香气糖苷生物合成的方法还不成熟，其中呋喃酮糖苷的相关研究很少。已报道的呋喃酮相关的糖基转移酶不能特异高效催化呋喃酮糖苷的生成，多数利用底物广泛，合成呋喃酮糖苷能力弱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶及编码基因，解决呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生物合成难题。

本发明的技术方案为：

一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

一种编码SEQ ID No.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

表达载体，其包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1所示的糖基转移酶或SEQ ID No.2所示的基因UGT10在合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷上的应用。

一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：

(1)以茶树cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQ ID No.2所示的基因UGT10；

(2)将步骤(1)得到的基因UGT10进行原核表达；

(3)分离纯化得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的葡萄糖基转移酶；

(4)以呋喃酮或呋喃酮衍生物为底物，以SEQ ID No.1所示的糖基转移酶进行催化反应，得到呋喃酮葡萄糖苷或呋喃酮衍生物葡萄糖苷。

进一步地，所述呋喃酮衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。

进一步地，催化反应的条件为：温度25℃-35℃、pH值6.5-10。

优选地，催化反应的条件为：温度30℃、pH值8.5。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用UGT10编码的蛋白，可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生成。为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生产提供了一种特异高效的生物合成方法。

附图说明

图1：香气底物的筛选；

图2：不同反应时间的酶活数据；

图3：不同pH的酶活数据；

图4：不同温度酶活数据；

图5：为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的获得流程图。

具体实施方式

1、UGT10基因

在茶树基因组中，发现了一条糖基转移酶相关的基因，该基因编码的蛋白可以特异性利用呋喃酮及其衍生物，生成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷，将该基因命名为UGT10，该基因的CDS序列如SEQ ID No.2所示。

2、UGT10基因的克隆

根据上述UGT10的CDS，通过SnapGene Viewer软件设计引物，用茶树的cDNA为模板，用高保真酶克隆目的基因，之后通过商业化的试剂盒进行胶回收，获得单一的目的基因。

cDNA模板的获取：将茶叶的鲜叶液氮处理磨碎后，用商业化提取植物RNA试剂盒提取，之后用商业化反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。

UGT10基因的引物序列：

UGT10F：GGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGAGACACCAAACAGAGC(SEQ ID No.3)

UGT10R：GCTCGAGTCGACCCGGGTTAGGATCGCACTAATTCAGCTAC(SEQ ID No.4)

反应体系：

反应程序：

3、重组质粒pGEX4T1-UGT10的构建

将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT10，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。

4、UGT10基因的原核表达与纯化

将构建成功的表达载体pGEX4T1-UGT10转化到BL21感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中37℃过夜培养，在37℃条件下进行扩大培养，直至OD600＝0.6-0.8为止。冷却至16-18℃后，加入1M的IPTG在16℃培养室内诱导过夜。第二天离心收集菌落，超声破碎，按照文献中的优化的糖基转移酶的方法纯化蛋白(Song C,Hong X,Zhao S,et al.Glucosylation of 4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone,the KeyStrawberry Flavor Compound in Strawberry Fruit[J].Plant Physiol.2016,171(1):139-151；Song C,Ring L,Hoffmann T,et al.Acylphloroglucinol Biosynthesis inStrawberry Fruit[J].Plant Physiol.2015,169(3):1656-1670；Song C,Gu L,Liu J,etal.Functional Characterization and Substrate Promiscuity ofUGT71Glycosyltransferases from Strawberry(Fragaria×ananassa)[J].PlantandCell Physiology.2015,56(12))，并进行SDS-PAGE检测。该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

5、香气底物筛选

将纯化成功的蛋白进行香气底物筛选，活性测定参考本实验室优化的方法(SongC,Ring L,Hoffmann T,et al.Acylphloroglucinol Biosynthesis in Strawberry Fruit[J].Plant Physiol.2015,169(3):1656-1670；Song C,Gu L,Liu J,et al.FunctionalCharacterization and Substrate Promiscuity of UGT71Glycosyltransferases fromStrawberry(Fragaria×ananassa)[J].Plant and Cell Physiology.2015,56(12))，测定UDP的生成量，从而确定测定糖苷的生成量。

香气底物筛选的反应体系：

香气底物筛选的对照体系：

Tris-HCl pH＝7.5(50mM)4.6ul

DTT(50mM) 0.2ul

UDPG(2.5mM) 0.2ul

所用的香气底物有：呋喃酮、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、单甲基呋喃酮、丁子香酚、香草酸、扁桃腈、水杨酸、氧化芳香醇、1-萘酚、金合欢醇、橙花醇、山梨酸等。

发现UGT10编码的蛋白可以特异性催化呋喃酮、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、单甲基呋喃酮生成呋喃酮葡萄糖苷、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮葡萄糖苷和单甲基呋喃酮葡萄糖苷。相对活性见图1所示。

6、产物鉴定

把反应体系中反应产物用乙酸乙酯进行萃取，上清液通过浓缩后用甲醇进行溶解，溶解液过滤后直接用LC-MS/MS进行分析。采用全波长扫描，进样量体积为2ul，流速为1.0mL/min，流动相为水和甲醇，鉴定方法参考实验室优化的方法(Song C,Hong X,Zhao S,et al.Glucosylation of 4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone,the KeyStrawberry Flavor Compound in Strawberry Fruit[J].Plant Physiol.2016,171(1):139-151)。

7、UGT10体外酶动力学分析

研究UGT10基因编码的蛋白跟呋喃酮体外反应在不同反应时间、温度、pH下，酶活的差异，优化出最反应的最适条件。在最适条件下，改变底物浓度，做酶动力学实验，从而得到酶的Km和Vm。优化不同反应时间、温度、pH的反应体系为：

不同反应时间、不同pH、不同温度的酶活数据分别见图2、图3和图4。

根据最适温度(30℃)、最适pH值(8.5)，反应时间10min，求得酶动力学参数

表1酶动力学参数

8、呋喃酮及其衍生物糖苷的合成

通过上面的描述和数据可以看出，UGT10编码的蛋白可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物糖苷的生成。呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的获得流程图见图5。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> 茶树(Camellia sinensis)

<400> 1

Met Glu Thr Pro Asn Arg Ala Tyr Lys Ala His Val Leu Val Leu Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu Gln Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Leu Val Ala Arg Gly Val Lys Ala Thr Leu Ala Asn Ser Val Tyr Ile

35 40 45

Ser Lys Ser Met His Lys Asp Gln Ile Ser Thr Ile Asp Thr Asp Thr

50 55 60

Phe Ser Asp Gly His Asp Asp Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Glu Asn Pro

65 70 75 80

Glu Ala Tyr Leu Thr Lys Leu Arg Asp Val Gly Ser Arg Thr Leu Ala

85 90 95

Ser Leu Ile Glu Lys Leu Asn Gly Leu Gly Arg Pro Val Asp Ala Leu

100 105 110

Ile Tyr Asp Gly Phe Leu Pro Trp Ala Leu Asp Val Ala Lys Glu Leu

115 120 125

Gly Ile Leu Gly Val Val Phe Phe Thr Gln Thr Cys Ala Val Asn Ser

130 135 140

Ile Tyr Tyr His Val His Glu Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Pro

145 150 155 160

Asp Ser Thr Ile Leu Leu Pro Gly Leu Pro Pro Leu Glu Ser Cys Glu

165 170 175

Thr Pro Ser Phe Val Tyr Ala Tyr Gly Leu His Pro Ser Phe Tyr Asp

180 185 190

Leu Leu Val Asn Gln Phe Ser Asn Val Asp Lys Ala Asp Trp Val Leu

195 200 205

Phe Asn Thr Phe Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Val Val Asp Trp Met Ser

210 215 220

Lys Leu Trp Arg Val Arg Thr Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met Tyr

225 230 235 240

Leu Asp Gln Lys Leu Lys Asp Asp Ile Asp Tyr Gly Ile Asn Leu Phe

245 250 255

Lys Pro His Ser Thr Val Cys Met Asn Trp Leu Asn Ala Lys Pro Ser

260 265 270

Ser Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Met Ala Gln Phe Glu Pro

275 280 285

Glu Gln Met Glu Glu Ile Ala Trp Gly Leu Asn Gln Ser Asn Tyr Asn

290 295 300

Phe Leu Trp Val Val Arg Ala Thr Glu Glu Ala Lys Leu Pro Asn Asn

305 310 315 320

Phe Ile Asn Asp Thr Ala Glu Lys Gly Leu Val Val Thr Trp Ser Pro

325 330 335

Gln Leu Glu Val Leu Ala His Glu Ser Ile Gly Cys Phe Val Thr His

340 345 350

Cys Gly Phe Asn Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Val Pro Met

355 360 365

Val Gly Val Pro Tyr Trp Ser Asp Gln Ala Thr Asn Ala Lys Phe Val

370 375 380

Glu Asp Val Trp Gly Ile Gly Ile Arg Ala Lys Met Asp Asp Lys Gly

385 390 395 400

Ile Val Arg Arg Glu Val Leu Glu Ala Cys Met Lys Glu Val Phe Glu

405 410 415

Gly Lys Lys Lys Asn Glu Val Lys Met Asn Ala Met Lys Trp Lys Lys

420 425 430

Leu Ala Lys Glu Ala Leu Gly Asp Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile

435 440 445

Asp Glu Phe Val Ala Glu Leu Val Arg Ser

450 455

<210> 2

<211> 1377

<212> DNA

<213> 茶树(Camellia sinensis)

<400> 2

atggagacac caaacagagc ctacaaagcc catgttctag tcctacccta ccctgcccaa 60

gggcacatca acccaatgct tcaattctcc aagcgcttgg tagctagagg tgtcaaggcc 120

actcttgcca acagtgttta tatctccaag tccatgcaca aggaccaaat cagcaccatc 180

gacactgaca cgttttccga cggacacgac gatggcggct acgacaacgc cgaaaatccc 240

gaagcctatc tgaccaaatt acgcgacgtt ggatcgcgga ctctggccag tctcatcgag 300

aaactcaatg ggcttggccg accagtcgat gccctaattt atgatgggtt tttgccttgg 360

gctcttgatg ttgccaagga gttaggaata cttggagttg tgtttttcac tcagacttgt 420

gctgtcaata gcatatatta tcatgtgcac gagggtcttc tttcactccc actttcacca 480

gattcaacta ttttgttgcc tggattgcca ccacttgagt cctgtgaaac gccatcgttt 540

gtgtatgctt atgggttgca tccaagtttc tatgacttgt tggtgaatca attcagtaac 600

gttgataaag cagattgggt cctttttaat actttctacg aattggagaa agaggtggta 660

gattggatgt caaaactatg gcgggtgaga acaataggcc caacacttcc atccatgtac 720

ttagatcaga aactcaaaga tgacatagat tatggcatca atctcttcaa gcctcactcc 780

actgtgtgca tgaactggct aaatgccaag ccaagcagct ctgtcgttta cgtatccttt 840

ggcagcatgg cccaatttga acccgaacaa atggaagaaa tagcatgggg cttaaaccaa 900

agcaattaca acttcttgtg ggtcgtgagg gcaaccgaag aagccaagct accaaacaac 960

ttcatcaatg acacagccga gaagggcttg gtggtgacat ggagtccaca gctagaggtg 1020

ttggcacacg agtcaatagg ttgctttgtc acgcattgtg ggttcaactc tgttcttgag 1080

gcactgagct tgggtgtgcc aatggttggt gttccatatt ggtcggacca agctacgaat 1140

gctaagtttg tggaggatgt ttggggtata ggaattaggg ctaagatgga tgataagggt 1200

attgtcagga gggaagtgtt ggaggcttgc atgaaggagg tgtttgaagg aaaaaagaaa 1260

aatgaagtta agatgaatgc aatgaaatgg aaaaaattgg cgaaagaggc gcttggtgat 1320

ggtgggagtt cagacaagaa catcgatgaa ttcgtagctg aattagtgcg atcctaa 1377

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatctggtt ccgcgtggat ccatggagac accaaacaga gc 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcgagtcg acccgggtta ggatcgcact aattcagcta c 41

Claims

1.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种编码SEQ ID No.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.表达载体，其包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

4.SEQ ID No.1所示的糖基转移酶或SEQ ID No.2所示的基因UGT10在合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷上的应用。

5.一种合成呋喃酮或其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以茶树cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQ ID No.2所示的基因UGT10；

（2）将步骤（1）得到的基因UGT10进行原核表达；

（3）分离纯化得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的葡萄糖基转移酶；

（4）以呋喃酮或呋喃酮衍生物为底物，以SEQ ID No.1所示的糖基转移酶进行催化反应，得到呋喃酮葡萄糖苷或呋喃酮衍生物葡萄糖苷。

6.根据权利要求5所述的一种合成呋喃酮或其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述呋喃酮衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。

7.根据权利要求5所述的一种合成呋喃酮或其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，催化反应的条件为：温度25℃-35℃、pH值6.5-10。

8.根据权利要求7所述的一种合成呋喃酮或其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，催化反应的条件为：温度30℃、pH值8.5。